突變的應(yīng)用微生物遺傳育種.ppt

第三章突變的應(yīng)用 第一節(jié)誘變育種第二節(jié)營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選與應(yīng)用第三節(jié)抗反饋調(diào)節(jié)突變型的篩選及應(yīng)用第四節(jié)其它類型突變株的篩選及應(yīng)用第五節(jié)菌種退化及其防止 第一節(jié)誘變育種 一 概述二 誘變育種方案的設(shè)計(jì)三 誘變育種的一般步驟四 誘變育種中應(yīng)注意的一些問題 一 概述 一 誘變育種技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展工業(yè)與工程需求 發(fā)酵工業(yè)尤其是抗生素工業(yè)生產(chǎn)菌株選育工作的需要 理論與技術(shù)基礎(chǔ) Thom和Steinberg 1939 用X射線在真菌中首次誘發(fā)基因突變成功 問題探索與技術(shù)發(fā)展 Davis對各種誘變篩選程序的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較 Calam對各種誘變劑量下的產(chǎn)量分步曲線的比較 Dahl等人對篩選工作可能誤差的分析 各種自動(dòng)化和高通量篩選技術(shù)出現(xiàn) 二 誘變育種技術(shù)在育種工作的作用 提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量 改善菌種特性 提高產(chǎn)品質(zhì)量 簡化工藝條件 開發(fā)新產(chǎn)品 給代謝調(diào)控育種提供技術(shù)手段 三 高產(chǎn)菌株誘變育種的特點(diǎn) 產(chǎn)量是一種數(shù)量性狀 數(shù)量性狀的特性和基因突變的特點(diǎn)決定了高產(chǎn)菌株的誘變選育一般具有以下一些特點(diǎn) 盲目性大 篩選工作繁瑣 工作量大 工作效率低 周期長 難以集合多個(gè)優(yōu)良性狀 二 誘變育種方案的設(shè)計(jì) 制定明確的選育目標(biāo) 一次誘變目標(biāo)不可太高太多 建立可行的篩選方法 關(guān)鍵問題是確立一種測定產(chǎn)物的方法 確定誘變篩選流程 是誘變育種工作方案設(shè)計(jì)的中心內(nèi)容 對于既往誘變史較少的低產(chǎn)菌株 采用一次高效法有利于提高育種工作的進(jìn)度 而對于已進(jìn)行多次誘變處理的高產(chǎn)菌株 多步積累法優(yōu)于一次高效法 三 誘變育種的一般步驟 出發(fā)菌株 純化 活化 前培養(yǎng) 同步培養(yǎng) 培養(yǎng)液 離心收集細(xì)胞 洗滌 制備均一的菌懸液 玻璃株打散 過濾 單細(xì)胞或單孢子懸液 活菌計(jì)數(shù) 誘變預(yù)備試驗(yàn)誘變處理 活細(xì)胞計(jì)數(shù) 致死率計(jì)算后培養(yǎng) 中間培養(yǎng) 平板分離 變異率計(jì)算初篩 復(fù)篩 保藏及擴(kuò)大試驗(yàn) 一 出發(fā)菌株的選擇 盡量選擇既往誘變史少的高產(chǎn)菌株 由自然界分離獲得的野生型菌株 突變可能性較大 經(jīng)自然分離的生產(chǎn)菌株 對生產(chǎn)環(huán)境適應(yīng) 又具野生型特性 也是良好的出發(fā)菌株 經(jīng)過誘變改造的菌株 負(fù)突變可能性較大 可結(jié)合其它育種方法改變其遺傳保守性 一 出發(fā)菌株的選擇 挑選純系 遺傳純 菌株 避免使用絲狀真菌菌絲體 異核體 要盡量選擇單倍體單核細(xì)胞 孢子 以減少誘變菌的分離延遲 結(jié)合誘變劑選擇 選擇對誘變劑敏感的菌株 選擇一些增變突變株采用多出發(fā)菌株更換出發(fā)菌株具有特定生產(chǎn)性狀的可能性 要確有特定物的代謝途徑 二 前培養(yǎng) 前培養(yǎng)的目的 對數(shù)中后期 生長旺盛 細(xì)胞濃度較高 對誘變劑敏感 同步培養(yǎng)物 誘變劑處理時(shí) 群體中變化一致 細(xì)胞內(nèi)應(yīng)具有豐富的內(nèi)源性堿基 DNA被誘變劑作用后所造成的損傷能快速通過復(fù)制而形成突變 可以獲得較高的突變率 前培養(yǎng)的培養(yǎng)基 嘌呤 嘧啶堿基含量要豐富 二 前培養(yǎng) 絲狀真菌的前培養(yǎng)產(chǎn)孢子真菌一般采用其孢子進(jìn)行誘變 為提高其對誘變劑敏感性 可以將其同步培養(yǎng)至孢子剛萌發(fā)的高生理活性狀態(tài) 芽管的長度相當(dāng)于孢子直徑的0 5 1倍 不產(chǎn)孢子的真菌可以采用年幼的菌絲體進(jìn)行誘變處理 對尖端菌絲 單菌落邊緣菌絲或小段菌絲懸浮液進(jìn)行誘變處理 三 菌懸液的制備 選擇合適的介質(zhì) 物理誘變常采用生理鹽水作分散介質(zhì) 而化學(xué)誘變則需要用緩沖液作介質(zhì) 使細(xì)胞或孢子要處于良好的分散狀態(tài) 利于與誘變劑解除 便于篩選玻璃株打散 脫脂棉或擦鏡紙 雙層 過濾調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)募?xì)胞或孢子密度酵母細(xì)胞 霉菌孢子 106 107個(gè) ml 細(xì)菌細(xì)胞 放線菌孢子 108個(gè) ml估計(jì) 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)或OD法計(jì)數(shù) 平板菌落計(jì)數(shù) 四 誘變處理 1 誘變劑的選擇在不影響誘變效果的前提下 盡量選擇毒性小 易于防護(hù) 安全性強(qiáng)的誘變劑 盡量選擇操作簡便易行 便宜易得的誘變劑 盡量選擇不易發(fā)生回復(fù)突變的誘變劑 堿基置換易回復(fù) 染色體畸變 移碼等不易回復(fù)對一些既往誘變史少的低產(chǎn)或野生菌株 uv線往往是首選 對于經(jīng)多次誘變處理的菌株 常需要能誘發(fā)染色體發(fā)生重排等較大損傷的強(qiáng)輻射進(jìn)行處理 結(jié)合細(xì)胞的透性和生理狀態(tài)進(jìn)行選擇經(jīng)常變換誘變劑或復(fù)合處理 2 誘變劑量的選擇高產(chǎn)菌株在低劑量時(shí)效果較好 而對多核細(xì)胞 孢子 低產(chǎn)菌株或質(zhì)量性狀處理劑量不宜過低 經(jīng)多次誘變處理已鈍化的菌株可用一次高劑量處理來激活 一次較高劑量的強(qiáng)誘變后 通常接著進(jìn)行2 3次較低劑量的溫和誘變 以利于菌株遺傳性狀的穩(wěn)定 在一次誘變中 可以分別采用不同劑量處理出發(fā)菌株 從中選出最佳劑量誘變劑量的控制方法化學(xué)誘變劑 誘變劑的濃度 處理時(shí)間和處理?xiàng)l件 物理誘變劑 照射距離 照射時(shí)間和照射條件 X 射線的照射劑量與亞熱帶鏈霉菌白霉素高產(chǎn)菌株39 變異的關(guān)系 形態(tài)突變型 負(fù)突變型 正突變型 紫外線照射劑量與龜裂鏈霉菌土霉素高產(chǎn)菌株293 變異的關(guān)系 3 處理方法單一誘變劑處理 復(fù)合處理 兩種或兩種以上誘變劑同時(shí)處理 不同的誘變劑交替處理 同一誘變劑連續(xù)處理以及紫外線與光復(fù)活交替處理等 注意 乙烯亞胺與紫外線復(fù)合誘變處理結(jié)果 3 處理方法直接處理 在緩沖液或無菌生理鹽水體系中對出發(fā)菌株進(jìn)行誘變處理 然后涂平板分離突變株 生長過程處理 在搖瓶培養(yǎng)基或固體平板中加入誘變劑 在菌體生長時(shí)進(jìn)行誘變處理 適用 五 后培養(yǎng) 后培養(yǎng) 將誘變處理過的細(xì)胞在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng) 使突變基因穩(wěn)定 純合并表達(dá) 目的 消除表型延遲后培養(yǎng)培養(yǎng)基 營養(yǎng)要求豐富 酪素水解液 或蛋白胨 可提供大量氨基酸 酵母膏可提供各種生長因子 六 變異菌株的分離及篩選 1 變異株的分離 多為平板分離 結(jié)合快速檢出法 平板預(yù)篩 根據(jù)形態(tài)變異淘汰低產(chǎn)菌株或篩選高產(chǎn)菌株 根據(jù)平皿反應(yīng)淘汰低產(chǎn)菌株或直接挑取高產(chǎn)菌株 2 篩選 包括初篩 復(fù)篩和終篩等 明確篩選目標(biāo) 產(chǎn)量突變還是其它突變型 產(chǎn)量準(zhǔn)備提高多少等 一次誘變目標(biāo)不要太高 制定篩選方案 篩選準(zhǔn)備分幾步 篩選采用的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件 每一步準(zhǔn)備篩選多少菌株 每一步準(zhǔn)備采用的分析方法等 制定篩選方案時(shí)的一些基本原則 篩選菌株的量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的人力物力條件而定 初篩的目的是將大多數(shù)未變異菌株或負(fù)變菌株去除 這時(shí)解決的主要是量的問題 因此每株菌培養(yǎng)時(shí)一般只在一種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)一瓶 培養(yǎng)條件一般沿用出發(fā)菌株的培養(yǎng)條件 分析方法也選用適于處理大量樣本的 操作簡便而快速的方法 如HPLC GC 比色法等 分析方法的精確性可以稍差一些 復(fù)篩時(shí)量的矛盾已不突出 而對準(zhǔn)確性有了更高的要求 因此復(fù)篩一般要培養(yǎng)2 3瓶 分析方法一般選用經(jīng)典方法或標(biāo)準(zhǔn)方法 有時(shí)要進(jìn)行幾次復(fù)篩 篩選的一般步驟 1株出發(fā)菌株 誘變處理400個(gè)單細(xì)胞菌株 初篩每株1瓶80株 復(fù)篩每株三瓶16株 復(fù)篩 三種工藝條件 每株各三瓶3株 對應(yīng)于不同工藝條件 供生產(chǎn)或再次誘變使用 四 誘變育種工作中應(yīng)注意的問題 安全問題 各種誘變劑幾乎都有致癌作用 因此在操作中應(yīng)時(shí)刻注意安全問題 個(gè)人安全和環(huán)境安全 個(gè)人安全 操作時(shí)注意防護(hù) 不同誘變劑要求不同防護(hù)方法 如 射線輻射防護(hù)要求較高 uv要求較低 而化學(xué)誘變劑則要求不與身體有關(guān)部位直接接觸 環(huán)境安全 所用物品要經(jīng)解毒處理 液體經(jīng)解毒或充分稀釋才可以排放 要養(yǎng)成良好的工作習(xí)慣 如仔細(xì)觀察細(xì)微的形態(tài)變化 要詳實(shí)記錄菌株的誘變史和誘變譜系 誘變育種技術(shù)要和其他育種手段相結(jié)合 誘變育種由于其篩選的盲目性 突變的不定向性 工作量十分大 因此要對整個(gè)工作進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)并結(jié)合新技術(shù)提高其工作效率 第二節(jié)營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選與應(yīng)用 代謝調(diào)控育種 推理育種rationalselection 是指利用代謝調(diào)控知識指導(dǎo)篩選工作的育種技術(shù) 工業(yè)與工程需求 克服誘變育種篩選盲目性大 效率低的缺陷 氨基酸發(fā)酵工業(yè)的興起理論與技術(shù)基礎(chǔ) 某些微生物中一些代謝產(chǎn)物的合成途徑 以及這些途徑之間的關(guān)系和調(diào)控特點(diǎn)被揭示 誘變育種技術(shù)已經(jīng)成熟問題探索與技術(shù)發(fā)展 對微生物代謝途徑的研究不斷深入 越來越多的代謝途徑和代謝調(diào)控方法被闡明 一 營養(yǎng)缺陷型及其應(yīng)用 營養(yǎng)缺陷型 auxotroph 是指喪失了合成一種或多種必需生長因子能力的菌株 它們只能在補(bǔ)充了相應(yīng)的生長因子的培養(yǎng)基上才能正常生長 野生型 wildtype 從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生營養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株 均稱該微生物的野生型 原養(yǎng)型 prototroph 營養(yǎng)缺陷型突變株經(jīng)回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的 其營養(yǎng)要求在表型上與野生型相同的菌株 完全培養(yǎng)基CompleteMedium CM 含有滿足某微生物的所有營養(yǎng)缺陷型和野生型菌株生長所需營養(yǎng)物質(zhì)的天然或半合成培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基MinimalMedium MM 不含生長因子僅能滿足某微生物的野生型菌株生長需要的最低成分合成培養(yǎng)基 補(bǔ)充培養(yǎng)基SupplementedMedium SM 補(bǔ)充了一種或數(shù)種生長因子 以滿足某微生物的特定的營養(yǎng)缺陷型生長的培養(yǎng)基 其中的生長因子多是通過直接添加AA 堿基或維生素而提供 與營養(yǎng)要求有關(guān)的三種遺傳型 基本培養(yǎng)基MM完全培養(yǎng)基CM或補(bǔ)充培養(yǎng)基MM A MM B 野生型 A B 原養(yǎng)型 A B 營養(yǎng)缺陷型 A B 或 A B 回復(fù)突變或重組 二 營養(yǎng)缺陷型突變株的應(yīng)用 科研上 研究代謝途徑 基因重組的遺傳標(biāo)記菌種 AA 堿基 維生素生物測定的試驗(yàn)菌種生產(chǎn)上 氨基酸 核苷酸等發(fā)酵產(chǎn)品生產(chǎn)菌種的代謝調(diào)控育種 生產(chǎn)菌株雜交育種的親本進(jìn)行遺傳標(biāo)記 營養(yǎng)缺陷型突變株在代謝調(diào)控育種中的應(yīng)用 阻斷代謝途徑 積累中間代謝產(chǎn)物例 利用谷氨酸棒桿菌的精氨酸缺陷型積累鳥氨酸 1 2 SAMP AMP XMP IMP GMP R 5 P AMP脫氨酶 3 GMP還原酶 阻斷分支代謝 積累另一終端代謝產(chǎn)物例 利用XMP 生產(chǎn)AMP B subtilis C glutamicum 高絲氨酸脫氫酶 AK 解除反饋抑制 積累代謝產(chǎn)物如 高絲氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株 Hser 條件解除 Thr Lys 對AK的協(xié)同反饋抑制 應(yīng)用滲漏突變株進(jìn)行代謝調(diào)控育種滲漏突變株 leakagemutant 一種遺傳障礙不完全的營養(yǎng)缺陷型 其特點(diǎn)是酶的活力下降但不完全喪失 使其能少量合成某一代謝產(chǎn)物 但產(chǎn)物的量又不造成反饋抑制 優(yōu)點(diǎn) 不需要限量添加生長因子 篩選 營養(yǎng)缺陷型突變株 誘變 挑選在MM上生長緩慢且菌落小的回復(fù)突變株 不同類型突變株積累L 賴氨酸的水平 二 營養(yǎng)缺陷型的篩選 誘變處理 同前后培養(yǎng) 在CM中進(jìn)行 消除突變細(xì)胞的表型延遲 生理性延遲和分離延遲 饑餓培養(yǎng) 洗滌后用無氮基本培養(yǎng)基培養(yǎng)4 6小時(shí) 避免在淘汰野生型時(shí)營養(yǎng)缺陷型被誤殺淘汰野生型 降低野生型細(xì)胞的數(shù)量和比例 使?fàn)I養(yǎng)缺陷型細(xì)胞得以相對濃縮檢出缺陷型鑒定缺陷型 淘汰野生型 原理 限制營養(yǎng)成分使缺陷型細(xì)胞生長受抑制 野生型細(xì)胞在生長過程中被殺死或生長后被除去方法 差別殺菌 利用芽孢或孢子比營養(yǎng)細(xì)胞更耐熱的特點(diǎn) 將誘變處理的細(xì)菌形成芽孢 把芽孢在基本培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時(shí)間 然后加熱殺死營養(yǎng)體 由于野生型芽孢能萌發(fā)所以被殺死 而營養(yǎng)缺陷型不能萌發(fā)不被殺死 抗生素法 青霉素能殺死生長態(tài)的細(xì)菌而對休止態(tài)的細(xì)菌無作用菌絲過濾法 適用于絲狀真菌將誘變后的孢子接種至MM中 控制培養(yǎng)時(shí)間 使野生型長成菌絲體 通過過濾而除去菌絲體 反復(fù)幾次后 剩余的多為缺陷型孢子 饑餓法 抗生素淘汰野生型 饑餓培養(yǎng) 培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)離心 洗滌后 懸浮于無氮基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 2小時(shí) 耗盡細(xì)胞內(nèi)氮源 防止加抗生素后的 誤殺 加抗生素處理 加入等體積的2N基本培養(yǎng)基 兩倍濃度氮源的基本培養(yǎng)基 同時(shí)加入抗生素 培養(yǎng)一定時(shí)間 野生型細(xì)胞由于生長而被殺死 缺陷型細(xì)胞處于休止?fàn)顟B(tài)而得以保留 制霉菌素可用于處理酵母菌和霉菌 注意 培養(yǎng)基應(yīng)添加滲透壓穩(wěn)定劑而制成高滲培養(yǎng)基 可避免由于細(xì)胞破裂而給缺陷型提供營養(yǎng)物質(zhì) 饑餓法 原理 微生物的某些缺陷型菌株在某些培養(yǎng)條件下會(huì)因代謝不平衡自行死亡 可是如果在細(xì)胞中發(fā)生了另一營養(yǎng)缺陷型突變 這一細(xì)胞反而會(huì)因代謝平衡的恢復(fù)而避免死亡 從而可被濃縮 舉例 1 胸腺嘧啶缺陷型細(xì)菌在不加胸腺嘧啶時(shí)在短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞大量死亡 而殘留下來的細(xì)菌中可以發(fā)現(xiàn)許多營養(yǎng)缺陷型 2 二氨基庚二酸缺陷型 二氨基庚二酸是合成賴氨酸和細(xì)胞壁物質(zhì)的前體 這一缺陷型在不加賴氨酸的情況下不生長也不死亡 給以賴氨酸時(shí)反而大量死亡 如果細(xì)胞中發(fā)生了另一個(gè)氨基酸缺陷型突變 它反而可以存活 檢出缺陷型 限量補(bǔ)充法MM 0 01 蛋白胨 野生型菌落大 缺陷型菌落小夾層培養(yǎng)法制備瓊脂平板 培養(yǎng) 長出菌落后作記號加第四層培養(yǎng)基 CM培養(yǎng) 新長出的菌落多為缺陷型 夾層平板的制備 MMMM 菌液MM 逐個(gè)檢出法分離得單菌落 CM點(diǎn)種 逐個(gè)菌落依次點(diǎn)種至MM和CM上培養(yǎng) 在MM上不長 CM上長的菌落為缺陷型 影印培養(yǎng)法分離單菌落 CM影印 用 印章 影印至MM和CM上培養(yǎng) 在MM上不長所對應(yīng)的CM上的菌落即為缺陷型篩選特定的缺陷型時(shí) 用SM取代CM則可以得到目的菌 鑒定缺陷型 生長譜法 大類的鑒定 營養(yǎng)因子 A 酪素水解液 AA混合物 B 水溶性維生素混合液C 酵母核酸水解液 堿基 D 酵母膏水溶液方法 缺陷型菌經(jīng)CM液體培養(yǎng)后 離心洗滌 制成107 108個(gè) ml菌懸液 取0 1ml涂布至MM平板上 分別用無菌小濾片沾取少許各種營養(yǎng)因子后 放入接種的MM上 適宜溫度下培養(yǎng) 判斷 A D生長 AA缺陷型B D生長 維生素缺陷型C D生長 堿基缺陷型A B D生長 AA 維生素雙缺A C D生長 AA 堿基雙缺B C D生長 維生素 堿基雙缺 詳細(xì)鑒定生長因子組合 10種生長因子分成4組 15種分成5組 21種分成6組 將各營養(yǎng)因子等量混合 研細(xì)成粉未 或按照規(guī)定量制成混合液 若氨基酸為DL型 則用量加倍 方法 直接加固體粉未或用無菌濾紙片取少許混合液加至培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)判斷 生長圈 單缺棱形生長帶 雙缺或多缺抑菌圈 生長因子濃度過高 且為單缺 生長因子分組方法 營養(yǎng)缺陷型的生長譜鑒定 第三節(jié)抗反饋調(diào)節(jié)突變型的篩選及應(yīng)用 一 反饋調(diào)節(jié)和抗反饋調(diào)節(jié)突變 一 反饋調(diào)節(jié)是指當(dāng)合成代謝途徑的終產(chǎn)物或分支代謝途徑的終產(chǎn)物過量積累時(shí) 抑制合成代謝途徑的關(guān)鍵酶 往往是代謝途徑或分支代謝途徑第一步的酶 的活力或相關(guān)酶的合成 反饋調(diào)節(jié)分為反饋抑制和反饋?zhàn)瓒?反饋抑制是指合成代謝途徑終產(chǎn)物過量積累時(shí)對該途徑前端某些關(guān)鍵酶酶活性的抑制作用 反饋?zhàn)瓒羰侵肝⑸锖铣纱x中高濃度終產(chǎn)物對該途徑上酶合成的抑制作用 反饋抑制直接以產(chǎn)物濃度控制關(guān)鍵酶的活性 從而控制整個(gè)代謝途徑 具有快速 有效 經(jīng)濟(jì)和直接的特點(diǎn) 反饋?zhàn)瓒糇饔檬前麅?nèi)產(chǎn)物過量后終止酶合成的一種機(jī)制 與反饋抑制相比 反應(yīng)較慢 并且往往影響代謝途徑中所有酶 整個(gè)操縱子 的合成 突變前突變后反饋抑制與抗反饋抑制突變 抗反饋?zhàn)瓒敉蛔兊臋C(jī)制 二 抗反饋調(diào)節(jié)突變是指解除了反饋調(diào)節(jié)的突變株 包括抗反饋抑制突變和抗反饋?zhàn)瓒敉蛔?抗反饋抑制突變是指解除了反饋抑制的突變株 調(diào)節(jié)中心發(fā)生結(jié)構(gòu)改變 無法與效應(yīng)物結(jié)合 抗反饋?zhàn)瓒敉蛔兪侵附獬朔答佔(zhàn)瓒舻耐蛔冎?調(diào)節(jié)基因突變或操縱基因突變 三 抗反饋調(diào)節(jié)突變株的篩選篩選抗結(jié)構(gòu)類似物突變株利用回復(fù)突變篩選初級代謝產(chǎn)物營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變株 野生型 營養(yǎng)缺陷型 原養(yǎng)型 次級代謝產(chǎn)物營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變株 野生型 營養(yǎng)缺陷型 原養(yǎng)型 次級代謝產(chǎn)物零產(chǎn)量回復(fù)突變篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變株 高產(chǎn)株 零變株 高產(chǎn)株 二 抗代謝類似物突變型的篩選 一 代謝類似物與抗代謝類似物突變代謝類似物 結(jié)構(gòu)與 初級 代謝物類似 因此可起到代謝物所具有的調(diào)節(jié)作用而不具備其生理功能的一類化合物 ThreonineAHVa Amino b hydroxyvalericacida 氨基 b 羥戊酸 LysAECS 2 Aminoethyl L Cysteine 真正代謝物功能 合成大分子 終產(chǎn)物一般為初級代謝產(chǎn)物 為生長必需 調(diào)節(jié)功能 反饋 代謝類似物 只有調(diào)節(jié)功能 不能合成有活性的生物大分子 加入代謝類似物 將關(guān)閉相關(guān)代謝物的合成 從而影響微生物的生長 抗代謝類似物突變株 在含有代謝類似物的基本培養(yǎng)基中能夠生長的菌株被稱作抗代謝類似物突變株 通過基因突變 使變構(gòu)酶或阻遏蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變 使其不能與代謝終產(chǎn)物結(jié)合 從而解除了代謝終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)作用 所以即使在代謝類似物存在時(shí) 也能合成相關(guān)代謝物 從而能夠生長 二 抗結(jié)構(gòu)類似物突變株在代謝調(diào)控育種中的應(yīng)用抗結(jié)構(gòu)類似物突變的實(shí)質(zhì)是解除了反饋抑制或反饋?zhàn)瓒?因此 在這類突變株中 合成代謝途徑也不再受代謝終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié) 能夠在終產(chǎn)物過量積累的情況下還不斷合成該產(chǎn)物 從而可以大大提高這些終產(chǎn)物的合成量 抗結(jié)構(gòu)類似物突變在氨基酸 核苷酸和維生素等初級代謝產(chǎn)物的高產(chǎn)菌株選育中被廣泛應(yīng)用 三 篩選方法一次性篩選法 將經(jīng)過誘變后培養(yǎng)的細(xì)胞直接涂布在含有一定濃度結(jié)構(gòu)類似物的基本培養(yǎng)基平板上 長出的菌落即為抗結(jié)構(gòu)類似物突變株 藥物不很貴 梯度平板法 將經(jīng)過后培養(yǎng)的細(xì)胞涂布在基本培養(yǎng)基平板上 在平板的中央加少量結(jié)構(gòu)類似物 在抑菌圈內(nèi)長出的個(gè)別菌落即為抗結(jié)構(gòu)類似物突變株 注 如果是協(xié)同反饋抑制 則要在基本培養(yǎng)基中添加起協(xié)同反饋抑制作用的產(chǎn)物抗結(jié)構(gòu)類似物突變是數(shù)量性狀 可通過逐漸提高結(jié)構(gòu)類似物的濃度使產(chǎn)物的積累水平逐漸提高抗結(jié)構(gòu)類似物突變和營養(yǎng)缺陷型突變等共同使用 提高產(chǎn)量的效果會(huì)更好 結(jié)構(gòu)類似物和代謝終產(chǎn)物 第四節(jié)其它類型突變型的篩選及應(yīng)用 一 組成型突變株的篩選組成型突變株 在沒有誘導(dǎo)底物存在時(shí)也能產(chǎn)生大量誘導(dǎo)酶的突變株 篩選原理 通過誘變處理 使調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變 不產(chǎn)生有活性的阻遏蛋白 或者操縱基因發(fā)生突變不再能與阻遏物相結(jié)合 從而使誘導(dǎo)型酶變?yōu)榻M成型酶 篩選方法 創(chuàng)造一種有利于組成型菌株生長而不利于誘導(dǎo)型菌株生長的培養(yǎng)條件 造成對組成型突變株的選擇優(yōu)勢 選擇適當(dāng)?shù)蔫b別培養(yǎng)基 直接在平板上識別兩類菌落 從而把組成型突變株選擇出來 限量誘導(dǎo)物恒化培養(yǎng)法控制低于誘導(dǎo)濃度的誘導(dǎo)物作碳源進(jìn)行恒化連續(xù)培養(yǎng) 誘導(dǎo)型菌株生長極弱 而變異株由于能產(chǎn)分解底物的酶 則能分解底物而得以生長 通過連續(xù)不斷加入新鮮基質(zhì) 野生型就會(huì)被 洗出 組成型突變株就被不斷 濃縮 最后達(dá)到能分離的濃度 循環(huán)培養(yǎng)法不含誘導(dǎo)物培養(yǎng)基 含誘導(dǎo)物培養(yǎng)基 普通碳源或氮源 誘導(dǎo)物作唯一碳源或氮源 兩菌都能生長 但組成型突變株已能合成特定的酶 親株不能 變異株調(diào)整期短 親株調(diào)整期長 短時(shí)間培養(yǎng)后 變異株所占比例增大 反復(fù)循環(huán)培養(yǎng)幾次后 變異株所占比例逐漸提高 然后進(jìn)行分離 誘導(dǎo)抑制劑法誘導(dǎo)物作唯一碳源或氮源 添加誘導(dǎo)抑制劑 只有變異株能合成酶利用底物進(jìn)行生長例 b 半乳糖苷酶誘導(dǎo)物 乳糖誘導(dǎo)抑制劑 鄰硝基苯基 b D 巖藻糖苷 平板菌落識別法例 篩選E colib 半乳糖苷酶組成型突變株將誘變后的細(xì)胞涂布接種到以甘油為唯一碳源的平板上培養(yǎng)后在長出的菌落上噴鄰硝基苯半乳糖苷 o nitropheny b D galactoside onp G 三 細(xì)胞膜透性突變型1 提高細(xì)胞膜透性的優(yōu)點(diǎn)使胞內(nèi)產(chǎn)物濃度維持較低的水平 有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行 提高產(chǎn)物的生成量使胞內(nèi)產(chǎn)物濃度維持低于發(fā)生反饋抑制或阻遏的程度 以積累過量的產(chǎn)物2 提高細(xì)胞膜透性的措施例1 谷氨酸生產(chǎn)生物素對于細(xì)胞膜 脂肪酸 的合成是必需的篩選Bio 在限量添加生物素的情況下可使合成的谷氨酸大量分泌到胞外 使谷氨酸得以過量積累 例2 5 肌苷酸生產(chǎn)Ade 可以合成5 肌苷酸 但不能分泌到胞外在限量Mn2 10mg L 時(shí) 可以分泌選育Mn2 濃度 100mg L 不敏感突變株 能在過量Mn2 的培養(yǎng)基中正常分泌5 肌苷酸 達(dá)到過量積累的目的 四 抗性突變株的篩選1 抗性突變株的用途育種的遺傳標(biāo)記提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量2 篩選方法1 一次性篩選法 在對于出發(fā)菌株完全致死的環(huán)境中一次性篩選少數(shù)抗性變異株的方法稱為一次性篩選法 如Str抗性突變株的篩選 培養(yǎng)基中添加Str 500U ml 長出的菌即為抗500U ml的菌株 2 階梯性篩選法梯度平板法 培養(yǎng)過夜即形成藥物梯度平板 涂菌后 在高濃度藥物區(qū)長出的是抗高濃度藥物的菌株紙片擴(kuò)散法 在無菌濾紙片上加入一定量的藥物 干燥后放入涂布菌體的平板上 在抑菌圈內(nèi)長出的菌為抗性菌 越接近藥物抗性越強(qiáng) 第四節(jié)致癌物質(zhì)的檢測 一 誘變作用測定方法概論靈敏度鏈霉素依賴型 非依賴型藥物敏感 抗性營養(yǎng)缺陷型 非缺陷型代表性誘變作用的生物專一性誘變作用的基因?qū)Ｒ恍?測定方法 快速 簡單 固體培養(yǎng)基上誘變作用的測定A MM 不加誘變劑 B MM 加誘變劑 C CM 加誘變劑 A B C 二 致癌物質(zhì)的檢測 Ames測驗(yàn) 指示菌株 一組具有不同結(jié)構(gòu)改變的組氨酸缺陷型菌株TA1535 rfa uvrB hisG46 堿基置換突變TA1536 rfa uvrB hisC207 移碼突變 GC對缺失TA1537 rfa uvrB hisC3076 移碼突變 GC對增加TA1538 rfa uvrB hisD3052 移碼突變 GC和CG對的缺失 前誘變劑 本身不是誘變劑 但在人體或動(dòng)物體內(nèi)能轉(zhuǎn)變?yōu)檎T變劑的物質(zhì) 鼠肝臟提取物前誘變劑誘變劑 對照陽性對照 已知誘變劑陰性對照 無誘變作用的制劑空白對照 測自發(fā)突變率只有回復(fù)突變率比自發(fā)突變率高出2倍以上時(shí)才能認(rèn)為該物質(zhì)有致癌作用 測定結(jié)果表明90 致癌物質(zhì)是誘變劑86 非致癌物質(zhì)不是誘變劑 幾種致癌物質(zhì)的誘變作用的測定結(jié)果 三 菌種的退化 復(fù)壯和保藏 一 菌種退化degeneration及其防治1 菌種退化的表現(xiàn) 生產(chǎn)性狀劣化 遺傳標(biāo)記丟失 原有的典型性狀變得不典型具體表現(xiàn) 菌落及細(xì)胞形態(tài)的改變 生長速度緩慢 產(chǎn)孢子越來越少 代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力下降 抗不良環(huán)境條件 抗噬菌體 抗低溫 能力減弱 2 退化原因 基因自發(fā)突變 誘變后菌株本身不純 多核細(xì)胞中單核突變 單核細(xì)胞中單鏈改變等 其他原因 總之 退化是發(fā)生在群體細(xì)胞中的一個(gè)從量變到質(zhì)變的逐步演變過程 由于個(gè)別突變細(xì)胞表現(xiàn)生長優(yōu)勢 導(dǎo)致在群體中最后數(shù)量占優(yōu)勢 純是相對的 不純是絕對的 自發(fā)突變率10 8 10 9 3 退化的防治 從菌種選育方法上考慮1 進(jìn)行充分的后培養(yǎng)及分離純化2 增加突變位點(diǎn) 減少基因回復(fù)突變的幾率 從菌種保藏方式上考慮1 盡量減少傳代次數(shù)2 選擇適宜的保藏培養(yǎng)基 從菌種培養(yǎng)適宜條件上考慮1 結(jié)構(gòu)類似物抗性菌株在保藏培養(yǎng)基中應(yīng)添加相應(yīng)藥物 及時(shí)淘汰回復(fù)突變細(xì)胞 2 基因工程菌添加抗生素于培養(yǎng)基中防止質(zhì)粒的丟失從菌種管理的措施上考慮 復(fù)壯1 定期對保藏菌種分離純化 淘汰已退化細(xì)胞 2 定期對發(fā)酵液進(jìn)行分離篩選 選取自發(fā)性突變的細(xì)胞 生產(chǎn)育種 二 菌種復(fù)壯rejuvenation廣義復(fù)壯 在菌種的生產(chǎn)性能尚未退化之前經(jīng)常進(jìn)行純種分離和生產(chǎn)性能測定 從生產(chǎn)中篩選自發(fā)正突變的細(xì)胞 狹義復(fù)壯 在菌種已經(jīng)發(fā)生退化的情況下 通過純種分離和生產(chǎn)性能測定等方