激光共聚焦使用手冊.ppt

激光共聚焦顯微鏡FV1000 光譜掃描型 倒置顯微鏡IX81 簡易使用說明書 啟動系統(tǒng)3顯微鏡鏡下觀察微分干涉差觀察4熒光觀察5取圖的操作界面6如何取圖XY平面單標(biāo)7XY平面雙標(biāo)同步掃描方式10序列掃描方式13XY平面單標(biāo) 微分干涉差16XYZ掃描雙標(biāo)19XYL光譜掃描212D操作界面24圖像分析打開文件243D圖像的疊加25比例尺的使用263D圖像的重建273D圖像的旋轉(zhuǎn)29Unmixing31保存圖像35保存到CD R36關(guān)閉系統(tǒng)37附錄38 內(nèi)容 1 打開計算機(jī) 2 打開激光器 打開鑰匙開關(guān) 2 1 多線氬離子 458nm 488nm 514nm ON 打開電源開關(guān)后 打開鑰匙開關(guān) 2 2 氦氖綠 543nm ON2 3 氦氖紅 633nm ON打開汞燈電源開關(guān) 登陸WindowsXP系統(tǒng) 雙擊快捷方式 打開FV10 ASW應(yīng)用軟件 系統(tǒng)軟件的啟動需要等待一定時間 開啟系統(tǒng) 5 2 3 1 UserID AdministratorPassword fluoview UserID AdministratorPassword Administrator 微分干涉差觀察 1 使用手控面板選擇物鏡 參照 Memo 2 插入起偏鏡 3 插入微分干涉滑塊 4 點擊FV10 ASW軟件中的圖標(biāo) 5 標(biāo)本聚焦 Memo 按照7 1的操作轉(zhuǎn)換物鏡的倍率之后 對 物鏡 各物鏡對應(yīng)的DIC元件 進(jìn)行操作 DIC元件 1 2 3 4 Note1 使用TD滑塊控制鹵素?zé)舻墓鈴?qiáng) Note2 檢查濾色片轉(zhuǎn)盤的位置是否為 6 DICT 如果不是 用手柄按下DICT圖標(biāo) Note1 顯微鏡鏡下觀察 手控面板 用此旋鈕進(jìn)行微分干涉法對比度的調(diào)節(jié) 熒光觀察 1 2 3 顯微鏡鏡下觀察 Handswitch 1 使用手控面板選擇物鏡 2 點擊FV10 ASW軟件中的圖標(biāo) 3 使用手控面板選擇熒光濾色片 參照 Memo 4 標(biāo)本聚焦 Note2 Notes1 3 Note1 選擇第3步后 顯微鏡進(jìn)入熒光觀察狀態(tài) 注意此時汞燈的機(jī)械快門要打開 建議通常機(jī)械快門要放在關(guān)閉的位置 Note2 檢查DIC滑塊是否拉出 Memo 關(guān)于熒光濾色片NIBA 藍(lán)色激發(fā) 綠色熒光 例 FITC EGFP等 WIG 綠色激發(fā) 紅色熒光 例 Rhodamine DsRed等 Note3 觀察之前 檢查汞燈的機(jī)械快門要放在開啟的位置 圖像的拇指索引 明場觀察 顯微鏡鏡下觀察 熒光觀察 顯微鏡鏡下觀察 染料選擇 光路圖 取圖條件的保存 調(diào)出取圖條件 TwinScanner設(shè)定 取圖的操作界面 掃描的按鈕選擇XYZ XYT或XYL每個通道的調(diào)節(jié)共聚焦的孔徑大小鹵素?zé)舻墓鈴?qiáng)調(diào)節(jié)Kalman方式 圖像顯示窗口 內(nèi)存中所顯示的文件 掃描模式掃描速度像素數(shù)縮放和平移激光輸出的調(diào)節(jié) Lambda掃描的設(shè)定物鏡聚焦時間間隔和時間計數(shù) 用于XYT或XT掃描 掃描帶寬選擇 獲取單張圖像 XY平面 熒光圖像 例 綠色熒光染色 FITC 點擊FV10 ASW軟件中的按鈕關(guān)閉汞燈快門 同時 點擊按鈕關(guān)閉鹵素?zé)艨扉T 點擊染料選擇按鈕 在染料列表中 雙擊用于觀察的熒光染料 取消當(dāng)前熒光染料 選擇另外熒光染料 要雙擊已指定的熒光染料 并重復(fù)步驟2 3 點擊Apply按鈕 關(guān)閉染料選擇面板可以用Close按鈕 1 2 3 染料選擇后的顯示界面 如何取圖 XY平面 單標(biāo) Memo 掃描控制面板 連續(xù)掃描 停止掃描 快速掃描 隔行掃描 4 5 6 如何取圖 XY平面 單標(biāo) 4 點擊XYRepeat按鈕開始掃描 5 調(diào)節(jié)綠色 FITC 圖像 圖像調(diào)節(jié)的略述如下 更多的信息 參照附錄1 6 點擊Stop按鈕停止掃描 參照 Memo 7 8 9 10 如何取圖 XY平面 單標(biāo) 7 選擇AutoHV 并選擇掃描速度 隨著掃描速度變慢 在保持同等亮度的前提下 背景噪音就會消除 也可以使用Kalmanaccumulation方式 更多的信息 參照附錄2 8 點擊XY按鈕取得一幅圖像 9 點擊SeriesDone按鈕 2DView LiveImage x 2D界面就出現(xiàn) 10 保存該幅圖像 右擊圖像管理器中顯示的圖像圖標(biāo) 選擇另存為保存該幅圖像 保存為 xml 類型是FV10 ASW軟件專用的圖像格式 Memo FV10 ASW專用的圖形格式OIF格式 創(chuàng)建 一個含 16 bitTIFF 的圖像 和 一個附屬文件 不能單獨分割 OIB格式 創(chuàng)建單個的OIF格式的文件 方便進(jìn)行移動和進(jìn)行其它的操作 1 2 3 獲取單張圖像 XY平面 熒光圖像 例 綠色熒光 Alexa488 紅色熒光 Alexa546 二重染色同步掃描 如何取圖 XY平面 雙標(biāo) 點擊FV10 ASW軟件中的按鈕關(guān)閉汞燈快門 同時 點擊按鈕關(guān)閉鹵素?zé)艨扉T 點擊染料選擇按鈕 在染料列表中 雙擊用于觀察的熒光染料 取消當(dāng)前熒光染料 選擇另外熒光染料 要雙擊已指定的熒光染料 并重復(fù)步驟2 3 點擊Apply按鈕 關(guān)閉染料選擇面板可以用Close按鈕 染料選擇后的顯示界面 4 5 6 如何取圖 XY平面 雙標(biāo) Memo 掃描控制面板 連續(xù)掃描 停止掃描 快速掃描 隔行掃描 4 點擊XYRepeat按鈕開始掃描 5 調(diào)節(jié)綠色 AlexaFluor488 圖像和紅色 AlexaFluor546 圖像 圖像調(diào)節(jié)的略述如下 更多的信息 參照附錄1 6 點擊Stop按鈕停止掃描 參照 Memo 7 8 9 10 如何取圖 XY平面 雙標(biāo) 7 選擇AutoHV 并選擇掃描速度 隨著掃描速度變慢 在保持同等亮度的前提下 背景噪音就會消除 也可以使用Kalmanaccumulation方式 更多的信息 參照附錄2 8 點擊XY按鈕取得一幅圖像 9 點擊SeriesDone按鈕 2DView LiveImage x 2D界面就出現(xiàn) 10 保存該幅圖像 右擊圖像管理器中顯示的圖像圖標(biāo) 選擇另存為保存該幅圖像 保存為 xml 類型是FV10 ASW軟件專用的圖像格式 Memo FV10 ASW專用的圖形格式OIF格式 創(chuàng)建 一個含 16 bitTIFF 的圖像 和 一個附屬文件 不能單獨分割 OIB格式 創(chuàng)建單個的OIF格式的文件 方便進(jìn)行移動和進(jìn)行其它的操作 1 2 3 獲取單張圖像 XY平面 熒光圖像 例 綠色熒光 Alexa488 紅色熒光 Alexa546 二重染色序列掃描 這里介紹線序列掃描 如何取圖 XY平面 雙標(biāo) 點擊FV10 ASW軟件中的按鈕關(guān)閉汞燈快門 同時 點擊按鈕關(guān)閉鹵素?zé)艨扉T 點擊染料選擇按鈕 在染料列表中 雙擊用于觀察的熒光染料 取消當(dāng)前熒光染料 選擇另外熒光染料 要雙擊已指定的熒光染料 并重復(fù)步驟2 3 點擊Apply按鈕 關(guān)閉染料選擇面板可以用Close按鈕 染料選擇后的顯示界面 4 5 6 7 如何取圖 XY平面 雙標(biāo) 4 點擊序列掃描 并選擇線序列方式 5 點擊XYRepeat按鈕開始掃描 6 調(diào)節(jié)綠色 AlexaFluor488 圖像和紅色 AlexaFluor546 圖像 圖像調(diào)節(jié)的略述如下 更多的信息 參照附錄1 7 點擊Stop按鈕停止掃描 參照 Memo 8 9 10 11 如何取圖 XY平面 雙標(biāo) 8 選擇AutoHV 并選擇掃描速度 隨著掃描速度變慢 在保持同等亮度的前提下 背景噪音就會消除 也可以使用Kalmanaccumulation方式 更多的信息 參照附錄2 9 點擊XY按鈕取得一幅圖像 10 點擊SeriesDone按鈕 2DView LiveImage x 2D界面就出現(xiàn) 11 保存該幅圖像 右擊圖像管理器中顯示的圖像圖標(biāo) 選擇另存為保存該幅圖像 保存為 xml 類型是FV10 ASW軟件專用的圖像格式 Memo FV10 ASW專用的圖形格式OIF格式 創(chuàng)建 一個含 16 bitTIFF 的圖像 和 一個附屬文件 不能單獨分割 OIB格式 創(chuàng)建單個的OIF格式的文件 方便進(jìn)行移動和進(jìn)行其它的操作 1 2 3 4 獲取單張圖像 XY平面 熒光圖像 微分干涉 例 綠色熒光 FITC DIC圖像 如何取圖 XY平面 單標(biāo) 微分干涉差 1 點擊FV10 ASW軟件中的按鈕關(guān)閉汞燈快門 同時 點擊按鈕關(guān)閉鹵素?zé)艨扉T 點擊染料選擇按鈕 在染料列表中 雙擊用于觀察的熒光染料 取消當(dāng)前熒光染料 選擇另外熒光染料 要雙擊已指定的熒光染料 并重復(fù)步驟2 3 點擊Apply按鈕 關(guān)閉染料選擇面板可以用Close按鈕 4 選擇TD1 染料選擇后的顯示界面 5 6 7 如何取圖 XY平面 單標(biāo) 微分干涉差 Memo 掃描控制面板 連續(xù)掃描 停止掃描 快速掃描 隔行掃描 5 點擊XYRepeat按鈕開始掃描 6 調(diào)節(jié)綠色 FITC 圖像和微分干涉差的圖像 圖像調(diào)節(jié)的略述如下 更多的信息 參照附錄1 7 點擊Stop按鈕停止掃描 參照 Memo 8 9 10 11 如何取圖 XY平面 單標(biāo) 微分干涉差 8 選擇AutoHV 并選擇掃描速度 隨著掃描速度變慢 在保持同等亮度的前提下 背景噪音就會消除 也可以使用Kalmanaccumulation方式 更多的信息 參照附錄2 9 點擊XY按鈕取得一幅圖像 10 點擊SeriesDone按鈕 2DView LiveImage x 2D界面就出現(xiàn) 11 保存該幅圖像 右擊圖像管理器中顯示的圖像圖標(biāo) 選擇另存為保存該幅圖像 保存為 xml 類型是FV10 ASW軟件專用的圖像格式 Memo FV10 ASW專用的圖形格式OIF格式 創(chuàng)建 一個含 16 bitTIFF 的圖像 和 一個附屬文件 不能單獨分割 OIB格式 創(chuàng)建單個的OIF格式的文件 方便進(jìn)行移動和進(jìn)行其它的操作 1 4 5 8 Memo 和按鈕 點擊移動1 0 m 點擊移動0 1 m 2 6 7 獲取3D圖像 XYZ 熒光圖像 例 綠色熒光 FITC 和紅色熒光 Rhodamine 雙標(biāo)這里介紹線序列掃描取圖的過程 如何取圖 XYZ掃描 雙標(biāo) 1 采用13和14頁步驟1到7 2 輸入StepSize大小 點擊OP按鈕可以使用推薦的值 并選擇 3 點擊XYRepeat按鈕開始掃描 4 點擊和按鈕上移焦點位置 參照 Memo 5 當(dāng)圖像顯示到達(dá)上限時 點擊Set按鈕確定 6 點擊和按鈕下移焦點位置 參照 Memo 7 當(dāng)圖像顯示到達(dá)下限時 點擊Set按鈕確定 8 點擊Stop按鈕停止掃描 確定Z軸的上限和下限如下 9 10 11 13 12 如何取圖 XYZ掃描 雙標(biāo) 9 選擇AutoHV 并選擇掃描速度 隨著掃描速度變慢 在保持同等亮度的前提下 背景噪音就會消除 也可以使用Kalmanaccumulation方式 更多的信息 參照附錄2 10 選擇Depth按鈕 11 點擊XYZ按鈕取得圖像 12 點擊SeriesDone按鈕 2DView LiveImage x 2D界面就出現(xiàn) 13 保存該幅圖像 右擊圖像管理器中顯示的圖像圖標(biāo) 選擇另存為保存該幅圖像 保存為 xml 類型是FV10 ASW軟件專用的圖像格式 Memo FV10 ASW專用的圖形格式OIF格式 創(chuàng)建 一個含 16 bitTIFF 的圖像 和 一個附屬文件 不能單獨分割 OIB格式 創(chuàng)建單個的OIF格式的文件 方便進(jìn)行移動和進(jìn)行其它的操作 1 2 3 可以通過調(diào)用掃描狀態(tài)來實現(xiàn)該設(shè)置 更多的信息 參照附錄5 獲取光譜圖像 XYL 例 綠色熒光 AlexaFluor488 和綠色熒光 YOYO 1 雙標(biāo) 如何取圖 XYL光譜掃描 1 點擊FV10 ASW軟件中的按鈕關(guān)閉汞燈快門 同時 點擊按鈕關(guān)閉鹵素?zé)艨扉T 2 點擊按鈕檢查光路 3 做如下設(shè)置 選擇BS20 80或DM405 488 選擇488nm作為激發(fā)光源 選擇Mirror 只選擇CHS1 4 5 6 7 9 如何取圖 XYL光譜掃描 4 點擊按鈕 出現(xiàn)光譜設(shè)置窗口 5 設(shè)置CHS1光譜帶寬為10nm 以此為例 參照附錄4關(guān)于改變光譜帶寬的方法 6 點擊XYRepeat按鈕開始掃描 7 在觀察圖像的同時 移動光譜帶到圖像最亮的位置狀態(tài) 參照附錄4關(guān)于改變光譜帶寬的方法 注 移動光譜帶位置要保持光譜帶寬為10nm不變 8 調(diào)節(jié)圖像 參照附錄1 9 點擊Stop按鈕停止掃描 10 11 12 13 15 14 如何取圖 XYL光譜掃描 10 選擇AutoHV 并選擇掃描速度 隨著掃描速度變慢 在保持同等亮度的前提下 背景噪音就會消除 也可以使用Kalmanaccumulation方式 更多的信息 參照附錄2 11 設(shè)定要掃描的波長范圍 光譜帶寬和步距 Start 開始波長 End 結(jié)束波長 Resolution 光譜帶寬 StepSize 步距12 選擇Lambda按鈕 13 點擊XYL按鈕取得圖像 14 點擊SeriesDone按鈕 2DView LiveImage x 2D界面就出現(xiàn) 15 保存該幅圖像 右擊圖像管理器中顯示的圖像圖標(biāo) 選擇另存為保存該幅圖像 保存為 oib 和 oif 類型是FV10 ASW軟件專用的圖像格式 1 雙擊資源管理器中要選擇打開的文件 1 圖像分析 打開文件 2D的操作界面 1 2 圖像分析 3D圖像的疊加 1 點擊按鈕并選擇 2 要保存此圖像 右擊此圖像 選擇SaveDisplay并命名 1 2 3 4 5 圖像分析 比例尺的使用 1 點擊按鈕 2 點擊圖像的同時 拖放此比例尺到一個特定的位置 3 點擊手柄的左端或右端 移動鼠標(biāo) 4 選擇比例尺并右擊選擇屬性的設(shè)置 5 設(shè)置具體的比例尺屬性 改變比例尺的大小 改變文本 顏色 字體等 以一定的角度觀察3D圖像 觀察3D圖像的某個橫截面 1 3 4 5 圖像分析 3D圖像的重建 1 點擊按鈕 2 創(chuàng)建3D圖像 3 拖動鼠標(biāo)以一定的角度觀察圖像 要保存此圖像 進(jìn)行下一頁第6步的操作 4 點擊按鈕并選定 5 拖動鼠標(biāo)觀察某個垂直橫斷面 要保存此圖像 進(jìn)行下一頁第6步的操作 保存上一頁中第3 5選項的圖像 6 8 圖像分析 3D圖像的重建 6 點擊按鈕 7 會創(chuàng)建一個2D圖像 帶文件名 8 保存該幅圖像 右擊圖像管理器中顯示的圖像圖標(biāo) 選擇另存為保存該幅圖像 保存為 xml 類型是FV10 ASW軟件專用的圖像格式 Memo FV10 ASW專用的圖形格式OIF格式 創(chuàng)建 一個含 16 bitTIFF 的圖像 和 一個附屬文件 不能單獨分割 OIB格式 創(chuàng)建單個的OIF格式的文件 方便進(jìn)行移動和進(jìn)行其它的操作 1 3 動畫的播放 4 圖像分析 3D圖像的旋轉(zhuǎn) 1 點擊按鈕 2 創(chuàng)建3D圖像 3 拖動鼠標(biāo)以一定的角度觀察圖像 4 點擊并控制按鈕實現(xiàn)圖像圍繞著X 軸旋轉(zhuǎn) 再次點擊停止旋轉(zhuǎn) 點擊并控制按鈕實現(xiàn)圖像圍繞著Y 軸旋轉(zhuǎn) 再次點擊停止旋轉(zhuǎn) 點擊并控制按鈕實現(xiàn)圖像圍繞著Z 軸旋轉(zhuǎn) 再次點擊停止旋轉(zhuǎn) 5 7 10 6 8 9 圖像分析 3D圖像的旋轉(zhuǎn) 5 點擊按鈕 6 點擊Anglerotation菜單 7 選擇旋轉(zhuǎn)軸 8 輸入旋轉(zhuǎn)的角度 9 選擇AVI類型并點擊Create按鈕 10 輸入一個文件名并點擊Save按鈕 Start 開始角度End 結(jié)束角度Frame s 旋轉(zhuǎn)速度Interval 單次旋轉(zhuǎn)的角度 2 3 4 圖像分析 Unmixing I 每種熒光染料的定位都很明顯的情形 基于XYL圖像中類似熒光光譜相連的原則 通過已知的每種熒光染料的定位分解光譜并得到圖像 例 綠色熒光 AlexaFluor488 和綠色熒光 YOYO 1 雙標(biāo) 5 6 Unmixedimage 1 打開一幅AlexaFluor488和YOYO1雙標(biāo)的XYL圖像 2 分別為AlexaFluor488和YOYO1選定一個封閉的區(qū)域 3 從Processing下拉菜單中選擇SpectralDeconvolution圖標(biāo) 4 雙擊ROI1和ROI2區(qū)域 5 檢查處理類型設(shè)置為 Normal 并且點擊Execute按鈕 6 獲得圖像 2 3 4 5 6 記載的熒光光譜在此顯示 圖像分析 Unmixing II 基于使用單標(biāo)樣品作參照的情形 從單標(biāo)記的XYL圖像中取出單個熒光光譜作為參照 進(jìn)行光譜的分解并得到圖像 例 綠色熒光 AlexaFluor488 和綠色熒光 YOYO 1 雙標(biāo) 1 打開一幅AlexaFluor488單標(biāo)取樣的XYL圖像 2 為AlexaFluor488選定一個封閉的區(qū)域 3 從Processing下拉菜單中選擇SpectralDeconvolution圖標(biāo) 4 雙擊ROI1區(qū)域 5 點擊SaveProfile圖標(biāo) 6 輸入保存的名字并且點擊OK按鈕將AlexaFluor488的光譜記載到數(shù)據(jù)庫中 7 對于YOYO1單標(biāo) 重復(fù)1 6步 Unmixedimage 9 10 11 12 8 圖像分析 Unmixing II 基于使用單標(biāo)樣品作參照的情形 8 打開一幅AlexaFluor488和YOYO1雙標(biāo)的XYL圖像 9 從Processing下拉菜單中選擇SpectralDeconvolution圖標(biāo) 10 雙擊數(shù)據(jù)庫中記載的AlexaFluor488和YOYO1圖標(biāo) 11 檢查處理類型設(shè)置為 Normal 并且點擊Execute按鈕 12 獲得圖像 2 3 4 5 圖像分析 Unmixing III 基于只知道一定數(shù)量標(biāo)記的熒光染料的情形 BlindUnmixing 基于XYL圖像中類似熒光光譜相連的原則 通過已知的一定數(shù)量的熒光標(biāo)記分解光譜并得到圖像 例 兩種類型熒光標(biāo)記的樣品 Unmixedimage 1 打開一幅具有兩種類型熒光標(biāo)記的XYL圖像 2 從Processing下拉菜單中選擇SpectralDeconvolution圖標(biāo) 3 選中兩個檢查框用于計算 具有三種類型熒光標(biāo)記時要選中三個檢查框 4 檢查處理類型設(shè)置為 Blind 并且點擊Execute按鈕 5 獲得圖像 XY或者XYZ圖像的每個通道存為TIFF格式的文件 1 右擊圖像管理器中顯示的圖像圖標(biāo) 選擇另存為保存該幅圖像 2 設(shè)置Saveas類型為TIFF并保存 存為BMP和JPEG格式也可以 1 2 3 1 2 圖像分析 保存圖像 XY或者XYZ通道合并的圖像存為TIFF格式的文件 帶有比例尺的圖像存為BMP格式的文件 1 右擊圖像管理器中顯示的圖像圖標(biāo) 選擇另存為保存該幅圖像 2 設(shè)置Saveas類型為TIFF并保存 3 檢查要合并的通道并保存 存為BMP和JPEG格式也可以 1 右擊該幅圖像 2 選擇SaveDisplay并以新的文件名保存該幅圖像 動態(tài)圖像存為AVI格式的文件 1 右擊該圖像 2 選擇SaveasAVI并以新的文件名保存該圖像 保存到CD R 2 3 4 5 7 6 1 插入一張CD R光盤 2 點擊OK 3 選擇文件并拖放到CD R的窗口 4 點擊 WritethesefilestoCD 5 點擊Next 6 開始刻錄 7 點擊Finish按鈕結(jié)束 1 3 4 關(guān)閉系統(tǒng) 2