瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)的原理和方法.ppt

實(shí)驗(yàn)三瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)的原理和方法 主講教師和實(shí)驗(yàn)員 張運(yùn)峰 一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法檢測(cè)堿裂解法提取質(zhì)粒的結(jié)果檢測(cè)雙酶切法鑒定重組質(zhì)粒的結(jié)果 后續(xù)實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)PCR法鑒定質(zhì)粒的結(jié)果 后續(xù)實(shí)驗(yàn) 二實(shí)驗(yàn)原理 1 某物質(zhì)在電場(chǎng)作用下的遷移速度叫做電泳的速率 電泳的速率與核酸分子大小和構(gòu)型有關(guān) DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷 在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng) 分子質(zhì)量越小跑得越快 緊密構(gòu)型快于松散型開(kāi)環(huán)分子或線性分子 從而可以分離大小不同的DNA或RNA分子 2 瓊脂糖是一種線性多糖聚合物 可以形成具有剛性的濾孔 凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度 濃度越高 孔隙越小 其分辨能力就越強(qiáng) 配制多大濃度的瓊脂糖凝膠 要根據(jù)被檢的DNA分子大小來(lái)確定 瓊脂糖是一種線性多糖聚合物 濃度越高 孔隙越小 其分辨能力就越強(qiáng) 3 溴化乙錠為扁平狀分子 在紫外光照射下發(fā)射熒光 EB可與DNA分子形成EB DNA復(fù)合物 其熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比 據(jù)此可判斷DNA分子量大小和粗略估計(jì)樣品DNA濃度 表1瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分子大小的關(guān)系 三儀器 材料與試劑 1 質(zhì)粒樣品 酶切樣品和PCR樣品 2 凝膠電泳系統(tǒng)和電泳圖像分析系統(tǒng) 凝膠成像系統(tǒng) 等 3 瓊脂糖 1XTAE電泳緩沖液 Goldview 6X載樣緩沖液 6Xloadingbuffer 和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) Marker 等 1 凝膠電泳系統(tǒng) DYY 6C型雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀電源 北京六一 輸出范圍 顯示分辨率 6 600V 1V 4 400mA 1mA 240W 美國(guó)Bio rad伯樂(lè)小型水平電泳槽Mini SubCellGTCell 2 凝膠成像分析系統(tǒng) 3 Marker 一個(gè)已知分子質(zhì)量的DNA樣品做最對(duì)照 用來(lái)確定待測(cè)樣品的相對(duì)分子質(zhì)量 4 常用電泳緩沖液 電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色 一般與蔗糖 甘油或聚蔗糖400組成上樣緩沖液 作用 增加樣品比重 以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi) 形成肉眼可見(jiàn)的指示帶 預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置 使樣品呈色 使加樣操作更方便 5 上樣緩沖液 4 常用核酸染料 溴化乙錠 溴化乙錠 3 8 二氨基 5 乙基 6 苯基菲啶溴鹽EB EB染色 EB可很好地?fù)饺氲诫p鏈DNA中 在紫外光下會(huì)發(fā)出橙紅色的熒光 用于對(duì)DNA進(jìn)行染色和觀察 用于觀察的紫外光有 種波長(zhǎng) 一般使用中波紫外光 302nm 短波紫外光 254nm 觀察效果較好 但對(duì)DNA的破環(huán)很大 長(zhǎng)波紫外光 366nm 回收 1 制備瓊脂糖凝膠 1 2 制備凝膠板3 加樣4 電泳5 染色6 結(jié)果觀察 四 實(shí)驗(yàn)步驟 1 制備凝膠和膠板 20ml 1 TAE 0 2g瓊脂糖 三角瓶 煮膠 溶解 冷卻至60 不燙手 倒板 室溫下充分凝固 豎直拔下梳子 膠板設(shè)計(jì) 27人 每11孔膠板 4人 2樣品 1marker 5 l質(zhì)粒DNA 1 lloadingbuffer混勻 15 lPCR產(chǎn)物 3 lloadingbuffer 混勻 10 l酶切產(chǎn)物 2 lload ingbuffer混勻 5 lDNAMarker 每板膠一孔 2 加樣 3 電泳 電壓3 5V cm 約80 90V 注意電極方向 4 觀察 紫外透射分析儀下觀察 六實(shí)驗(yàn)結(jié)果 瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì) 不帶電荷 瓊脂糖鏈依分子內(nèi)和分子間氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束 構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠 瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)形成過(guò)程 瓊脂糖單糖分子結(jié)構(gòu) 瓊脂糖粉形成瓊脂糖凝膠的過(guò)程 DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng) DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷 在電場(chǎng)中向正極移動(dòng) 在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下 DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng) 即DNA分子本身的大小和構(gòu)型 當(dāng)DNA分子大小超過(guò)20kb時(shí) 普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開(kāi) 此時(shí)電泳的遷