07 生物化學(xué)實驗--血清γ-球蛋白的分離、純化與鑒定.doc

血清 - 球蛋白的分離、純化與鑒定 【 目的 】 1 掌握鹽析 - 層析法提純血清 - 球蛋白的原理和技術(shù)。 2 熟悉電泳比較法定性 - 球蛋白的方法。 3 了解掃描定量 - 球蛋白的方法。 【 原理 】 蛋白質(zhì)的分離、純化是研究蛋白質(zhì)化學(xué)性質(zhì)及生物學(xué)功能的重要手段。根據(jù)不同蛋白質(zhì)的分子量、溶解度以及在一定條件下帶電荷性狀的差異來分離、純化各種蛋白質(zhì)。 1 - 球蛋白的分離、純化 （ 1 ）鹽析：清蛋白與球蛋白的穩(wěn)定性不同，故可用鹽析法對血清蛋白質(zhì)初步分離。在半飽和硫酸銨溶液中，清蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，離心所得的沉淀即是球蛋白混合物。 （ 2 ）脫鹽：球蛋白混合物中的硫酸銨會妨礙進(jìn)一步分離純化，應(yīng)除去。脫鹽的方法有多種，本試驗采用凝膠過濾。 在凝膠過濾中，柱中的填充料是高度水化的惰性多聚物，最常用的有葡聚糖凝膠（ Sephadex Gel ）和瓊脂糖凝膠 (Agarose Gel) 等顆粒。葡聚糖凝膠是具有不同交聯(lián)度的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物，它的 “ 網(wǎng)眼 ” 大小可以通過交聯(lián)劑與葡聚糖的配比來達(dá)到。不同型號的葡聚糖凝膠可用來分離和純化不同分子大小的物質(zhì)。把葡聚糖凝膠裝在層析柱中，不同分子大小的蛋白質(zhì)混合液借助重力通過層析柱時，比 “ 網(wǎng)眼 ” 大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入網(wǎng)格中，而被排阻在凝膠顆粒之外，隨著洗脫劑在凝膠顆粒的外圍而流出。比 網(wǎng)眼 小的分子則進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部。這樣，由于不同大小的分子所經(jīng)路程距離不同而得到分離。大分子物質(zhì)先被洗脫出來，小分子物質(zhì)后被洗脫出來。所以含硫酸銨的蛋白值溶液通過層析柱時，先被洗脫出層析柱的是球蛋白，小分子硫酸銨由此法分離除去（參見第 2 篇第 2 章 圖 2-3 ） 。 （ 3 ）純化： - 球蛋白與 、 - 球蛋白（以及微量的清蛋白），等電點不同，所以采用離子交換層析，從球蛋白混合物中分離、提純出 - 球蛋白。 用于蛋白質(zhì)分離的層析材料多是離子交換纖維素，它們的優(yōu)點是對蛋白質(zhì)的交換容量較一般的離子交換樹脂大，而且品種較多，可以適用于各種分離目的。常用的陽離子交換劑有弱酸性的羧甲基纖維素（ CM-C ），常用的陰離子交換劑有弱堿性二乙基氨基乙基纖維素（ DEAE-C ）（圖 3 -6 ）。 圖 3-6 兩種離子交換纖維素 蛋白質(zhì)混合物與離子交換纖維素的酸性或堿性基團相結(jié)合。蛋白質(zhì)對固相離子交換劑的結(jié)合力取決于彼此間相反電荷基團的靜電吸引，而后者又與溶液 pH 有關(guān)。因為 pH 決定離子交換劑與蛋白質(zhì)的電離程度。鹽類的存在可以降低離子交換劑的離子基團和蛋白質(zhì)的相反電荷基團之間的靜電相互吸引。因此蛋白質(zhì)混合物的分離可由改變?nèi)芤褐宣}類離子強度和 pH 來完成，對離子交換劑結(jié)合力量小的蛋白質(zhì)首先由層析柱中洗脫出來。 DEAE- 纖維素，在偏酸環(huán)境中帶正電荷，而血清蛋白質(zhì)的 pI 分別為：清蛋白 pI4.9 、 、 - 球蛋白 pI 6 、 - 球蛋白 pI7.3 。 選用 0.02mol/L pH6.5 醋酸銨 (NH 4 AC ) 緩沖液，即可使 DEAE- 纖維素帶正電荷，又可使 、 - 球蛋白 ( 及清蛋白 ) 帶負(fù)電荷而與 DEAE- 纖維素結(jié)合，唯有 - 球蛋白帶正電荷，不與 DEAE- 纖維素結(jié)合首先從層析柱中洗脫出來，收集得到的即是純化的 - 球蛋白。 （ 4 ）濃縮：濃縮的方法很多，本實驗借助葡聚糖凝膠富含羥基，善吸水不允許大分子蛋白質(zhì)進(jìn)入微孔的特性，在樣品溶液中酌情加少量凝膠，濃縮蛋白。 2 鑒定 （ 1 ）定性分析：在同樣條件下，同種蛋白質(zhì)的電泳位置相同。用醋酸纖維薄膜電泳，以全血清的電泳圖譜為對照，即可通過比較法鑒定出所分離蛋白質(zhì)的種類和純度 ( 電泳原理請參見第 3 篇第 1 章實驗 4 ) 。 （ 2 ）定量分析：將電泳后的透明薄膜放入自動掃描吸光度儀內(nèi)掃描定量 - 球蛋白。正常血清蛋白各組分的含量見表 3-6 。 表 3-6 正常血清蛋白各組分的含量 蛋白質(zhì)種類 正常值 清蛋白 60 70% 1 - 球蛋白 2 3.5% 2 - 球蛋白 4 7% - 球蛋白 9 11% - 球蛋白 12 18% 【 器材 】 1 離心機 2 層析柱及填料 3 電泳儀及電泳槽 4 吸光度值 5 兔血清 【 試劑 】 1 飽和硫酸銨溶液 稱固體硫酸銨 850g 加到 1000ml 蒸餾水中。在 70 80 下攪拌促溶。室溫下放置過夜，瓶底析出白色晶體，上清即為飽和硫酸銨溶液。 2 0.3mol/L ， pH6.5 醋酸銨溶液 稱醋酸銨 (CH 3 COONH 4 ) 23.11g ，加蒸餾水約 800ml 溶解之。用 pH 計檢測，在電磁攪拌下用稀氨水或醋酸溶液準(zhǔn)確調(diào)至 PH6.5 ，再加蒸餾水至 1000ml 。 3 0.02mol/L ， pH6.5 醋酸銨溶液 取配置好的 0.3mol/L pH6.5 醋酸銨液用蒸餾水做 15 倍稀釋。 4 1.5mol/L NaCl-0.3mol/L NH 4 Ac ( 醋酸銨 ) 溶液 稱取 NaCl 87.7g 加 0.3mol/L pH6.5NH 4 Ac 溶解至 1000ml 。 5 0.5mol/L HCl 溶液 6 0.5mol/L NaOH 溶液 7 20% 磺基水楊酸溶液 8 5% 醋酸鋇溶液 9 巴比妥鈉緩沖液 (PH8.6 ， 離子強度 0.06) 巴比妥 1.66g ，巴比妥納 12.76g ，加蒸餾水溶解至 1000ml 。 10 染色液 ( 任選其一 ) ： （ 1 ）氨基黑 10 B 1g ，三氯醋酸 13.4g ，磺柳酸 13.4g ，加蒸餾水溶解至 1000ml 。 （ 2 ）麗春紅 2 R 0.8g ，溶于 6% 三氯醋酸 100ml 中。 11 2.5% 醋酸溶液 12 透明液 冰醋酸 25ml 加 95% 乙醇 75ml 。 注意：冰醋酸量若過多，會使醋酸纖維薄膜成軟膠凍狀或皺縮變形。 【 操作 】 1 層析柱的準(zhǔn)備 （ 1 ） Sephadex G25 層析柱 凝膠的處理：稱取 Sephadex G25 6g 于燒杯中，加水 100ml, 置沸水浴中加熱 1h, 或在室溫浸泡 24h ，使其充分吸水膨脹 , 再用蒸餾水洗二次。 裝柱：將層析柱 (2 40cm ) 垂直固定在架上，關(guān)緊下端出口。加 0.02mol/L pH6.5NH 4 AC 約 10ml 左右，再緩慢 , 均勻加入已膨脹好的凝膠混懸液，同時打開下端出口，使液體緩慢流出，凝膠加至床容積 25ml 左右。凝膠床內(nèi)不得有氣泡、斷層，膠床表面應(yīng)平整，在整個層析過程中應(yīng)始終位于液面之下。柱裝好后，用 3 倍柱床體積的 0.02mol/L pH6.5NH 4 AC 洗滌平衡 . 。 再生與保存：此凝膠柱可反復(fù)使用 . 。每次用后以所需的緩沖液洗滌平衡后即可再用。久用后，若凝膠床表面有沉淀物等雜質(zhì)滯留，可將表層凝膠粒吸棄 , 再添補新的凝膠，若凝膠床出現(xiàn)氣泡或流速明顯減慢，應(yīng)將凝膠粒倒出，重新裝柱。為防止凝膠霉變，暫不用時應(yīng)用含 0.02%NaN 3 的緩沖液洗滌后放置。久不用時宜將凝膠由柱內(nèi)倒出 , 加 NaN 3 至 0.02% ，濕態(tài)保存于 4 ，嚴(yán)防低于 0 凍結(jié)損壞凝膠粒。 （ 2 ） DEAE 纖維素離子交換層析柱 酸堿處理：稱取 DEAE- 纖維素（ DE-52 3.0g 或 DE-22 1.5g ) 加 0.5mol/L HCl45ml 攪拌，浸泡 30 分鐘后傾去 HCl ，用水洗至中性，用 0.5mol/L NaOH45ml 浸 30 60min ，傾棄上層液體，再用蒸餾水洗至中性 (PH=7.0) 。 平衡、裝柱 (1 20cm ) ： 上柱前經(jīng)酸堿處理過的 DEAE- 纖維素加 0.02mol/L pH6.5 醋酸銨約 200ml ，再用 1mol/L 醋酸調(diào)至 PH6.5 ，攪勻后平衡過夜。裝柱時，傾棄上清夜，將濃漿狀的纖維素一次傾入柱中，使其自然沉降 ( 注意不要有氣泡產(chǎn)生 ) ，裝成 1 10 厘米 的柱床。進(jìn)一步用 0.02mol/LpH6.5 醋酸銨流洗平衡，至流出液 pH 為 6.5 。 再生與保存：纖維素柱作過一次樣品分離后，可用 1.5mol/LNaCl-0.3mol/LNH 4 Ac 流洗。溶液中的鹽類降低離子交換劑的離子基團和蛋白質(zhì)的相反電荷基團間的靜電吸引，使蛋白質(zhì)從纖維素上脫離被洗脫，直到流出液中不含蛋白質(zhì)為止 (0.06mol/LNH 4 AC 可洗脫下 球蛋白和部分 球蛋白， 0.3mol/LNH 4 AC 可洗脫下清蛋白 ) 。再用 0.02mol/LpH6.5NH 4 AC 平衡即可重復(fù)使用。若柱床頂部有洗脫不下來的雜質(zhì)，應(yīng)將頂層的纖維素吸棄。若多次使用后雜質(zhì)較多或流速過慢，應(yīng)將纖維倒出，先用 1.5 2mol/L NaCl 浸泡，水洗，再如上述用酸處理后重新裝柱。如暫不使用， DEAE- 纖維素應(yīng)以濕態(tài) ( 在柱中或倒出 ) 保存在含 1% 正丁醇的緩沖液中，以防霉變。 2 血清 - 球蛋白的分離、純化 （ 1 ）硫酸銨鹽析：血清 1.0ml, 邊搖邊緩慢滴入飽和硫酸銨 1.0ml ，混勻后室溫靜置 10min ， 3500r/min 離心 10min 。輕輕取出，傾倒去上清液（用滴管仔細(xì)地吸棄上清）。沉淀加 0.02mol/LpH6.5NH 4 AC 0.4ml 溶解，留作進(jìn)一步純化 ( 稱粗蛋白溶液 ) 。 （ 2 ）凝膠過濾除鹽： Sephadex G25 層析柱經(jīng) 0.02mol/LpH6.5NH 4 AC 洗流平衡后，放棄多余的緩沖液，當(dāng)液面下降到略高于凝膠床表面時，關(guān)閉下端出口。用滴管吸取粗蛋白溶液加到凝膠床表面，加樣時應(yīng)注意勿將凝膠沖起或破壞凝膠床表面的平整。打開下端出口，使樣品進(jìn)入凝膠床，用相同緩沖液 2 3ml 沖洗沾在柱壁上的樣品 , 如此重復(fù)三次。然后可上大量的平衡緩沖液洗脫，流速控制在 15 25d/min 。 洗脫開始后用小試管連續(xù)收集流出液，每收集 1ml 換一支試管，為隨時檢查流出液中是否含有蛋白質(zhì)，可另取小試管若干支，分別加入 20% 磺基水楊酸 2 滴，取各管收集的流出液 1 滴，若流出液與磺基水楊酸接觸出現(xiàn)白色沉淀或混濁說明已有蛋白質(zhì)流出。視白色沉淀的多少估計各管中的蛋白質(zhì)濃度，合并蛋白質(zhì)含量高的各管，留待 DEAE- 纖維素純化 ( 其中留出少許作電泳鑒定使用 ) 。 洗脫完蛋白質(zhì)的凝膠柱，還應(yīng)用相同緩沖液繼續(xù)流洗以洗凈其中殘留的小分子硫酸銨，可用醋酸鋇檢測硫酸根離子。取流出液 2 滴于試管中，加 1 滴 5% 醋酸鋇 BaAC 2 ，若有硫酸根離子就會出現(xiàn)白色沉淀或混濁，還應(yīng)繼續(xù)流洗 , 直至反應(yīng)轉(zhuǎn)陰性。 （ 3 ） DEAE- 纖維素離子交換層析：將脫鹽后的球蛋白溶液加于纖維素柱上 ( 方法同凝膠過濾 ) ，用 0.02mol/LpH6.5NH 4 AC 緩沖溶液洗脫，流速 10 15d/min ，用小試管連續(xù)收集流出液 ( 約 1.5ml/ 管 ) 并用 20% 磺基水楊酸檢測其中是否有蛋白質(zhì) ( 方法同前 ) 。用該緩沖液洗脫下來的即是不被吸附的 - 球蛋白，收集含量高的部分濃縮作純度鑒定。 用過的 DEAE- 纖維素層析柱應(yīng)重新再生平衡，方可再度使用。先用 1.5mol/L NaCl-0.3mol/L NH 4 AC 洗脫其他被結(jié)合的蛋白質(zhì)，直至流出液與磺基水楊酸反應(yīng)轉(zhuǎn)陰性；再用 0.02mol/L pH6.5 NH 4 AC 緩沖液流洗平衡。 （ 4 ）濃縮：每 ml 純化的 球蛋白溶液加 Sephadex G25 0.2g 搖動 2 3min ，室溫下靜置 2h ，上清液即為濃縮的蛋白質(zhì)。 3 醋酸纖維素薄膜電泳鑒定 （ 1 ）準(zhǔn)備：取醋酸纖維素薄膜三條，浸潤入 pH8.6 離子強度 0.06 的巴比妥緩沖液中，待完全浸透后，用鑷子小心地夾住薄膜邊角取出，置濾紙中吸去多余的溶液。然后在無光澤面，距一端 1.5 2cm 處用點樣器加樣品，使成一條均勻的直線。 （ 2 ）點樣： 三條醋酸纖維膜分別加下列樣品：全血清，點樣 1 次；脫鹽后粗蛋白溶液，點樣 3 5 次；濃縮后純 - 球蛋白溶液，點樣 3 5 次。 （ 3 ）電泳：待樣品全部吸入薄膜后，以無光澤面向下，兩端緊貼在浸透緩沖液的濾紙鹽橋上，點樣端置電泳槽陰極端，加蓋平衡 2 3min ，開始電泳。電泳條件：電壓 90 110V ； 電流 0.4 0.8mA/cm 寬 ； 時間 40min 。 （ 4 ）染色：電泳畢，關(guān)電源。取出薄膜浸入盛有麗春紅染色液的燒杯中，固定染色 2min 。然后取出放入 2.5% 醋酸溶液中進(jìn)行漂洗 , 分別在三個燒杯中各洗 2min, 直到背景呈白色。最后在清水中漂洗一次；洗脫完放在濾紙上自然干燥。將三條薄膜并列，使點樣線位于同一水平線上，以血清蛋白圖譜為對照，觀察提純物質(zhì)的蛋白質(zhì)種類和純度。 4 掃描測定各蛋白質(zhì)區(qū)帶的百分含量 （ 1 ）薄膜透明：將完全干燥的薄膜，浸入透明液中約 20s ，取出平貼于干凈、平滑的玻璃上，注意勿殘留氣泡。膜干燥后，用刀片從膜的一角撬起，用手捏住撬起的一角將膜輕輕揭下，置紙中壓平。 （ 2 ）掃描：透明的薄膜放入自動掃描吸光度儀內(nèi)，通過透射，在記錄器上自動繪出血清蛋白各組分曲線圖。橫坐標(biāo)為膜的長度，縱坐標(biāo)為吸光度值，每個峰代表一處蛋白質(zhì)組份。 （ 3 ）定量：用求積儀測量出各峰的面積，計算每個峰的面積與它們總面積的百分比，既是血清中各種蛋白質(zhì)組份的百分含量；或?qū)⑶€圖上各峰沿曲線剪下，稱量各峰的重量，計算每個峰的重量與它們總重量的百分比，也可代表血清中各種蛋白質(zhì)組份的百分含量；使用帶電子計算機附件的自動掃描吸光度儀時，可由數(shù)字顯