誘導(dǎo)痰在氣道炎癥評價(jià)中的應(yīng)用.doc

誘導(dǎo)痰檢測的方法學(xué)及其在氣道炎癥評價(jià)中的應(yīng)用 羅煒 綜述 賴克方 鐘南山 審校 【摘要】 氣道炎癥在哮喘、慢性支氣管炎和間質(zhì)性肺炎等一系列疾病中扮演著重要的角色，而且被認(rèn)為是導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)改變的主要因素之一。誘導(dǎo)痰檢測作為一種無創(chuàng)、安全和可靠的氣道炎癥評價(jià)方法正日益受到重視和利用。關(guān)鍵詞? 誘導(dǎo)痰；氣道炎癥；哮喘；慢性阻塞性肺部疾病氣道炎癥在哮喘、慢性支氣管炎和間質(zhì)性肺炎等一系列疾病中扮演著重要的角色，而且是導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)改變的主要因素之一。氣道炎癥的評估對于研究氣道疾病的發(fā)病機(jī)制起著重要作用。而且，能發(fā)現(xiàn)無臨床癥狀、無氣道高反應(yīng)性和肺功能正常的早期氣道疾病1。以往，氣道炎癥通常用纖維支氣管鏡取材進(jìn)行評價(jià)，但由于其屬于有創(chuàng)檢查，難以重復(fù)進(jìn)行，使其應(yīng)用受到限制2。 痰液檢查已經(jīng)有100多年的歷史，最初主要用于肺結(jié)核和肺腫瘤的診斷。未經(jīng)處理的痰液涂片，細(xì)胞分布不均，而且混在粘液中不易識別，使痰細(xì)胞學(xué)檢查的準(zhǔn)確性受到影響。1958年Bickerman 等3首次建立了誘導(dǎo)痰檢測方法，對不能自然咳痰的患者進(jìn)行高滲鹽水霧化獲得痰液，利用二硫蘇糖醇（DTT）等粘液溶解劑對痰進(jìn)行處理，消除粘液的影響。1992年P(guān)in等4 首先開始用誘導(dǎo)痰分析哮喘患者的氣道炎癥狀況。近年來，誘導(dǎo)痰檢測作為一種無創(chuàng)、安全和可靠的氣道炎癥評價(jià)方法正日益受到重視。下面就誘導(dǎo)痰檢測的方法學(xué)及其在氣道炎癥評價(jià)的應(yīng)用作一綜述。 1? 方法學(xué) 在Pin和Fahy兩種方案4，5 的基礎(chǔ)上，誘導(dǎo)痰檢測方法經(jīng)過多年的發(fā)展和改進(jìn)，現(xiàn)已基本成熟，但各家報(bào)導(dǎo)的方案稍有不同。下面就目前常用的痰液誘導(dǎo)和處理程序作一簡介。 1.1? 痰液的誘導(dǎo)? 誘導(dǎo)前10分鐘讓病人吸入喘樂寧（沙丁胺醇?xì)忪F劑），隨后檢測一秒最大呼氣量（FEV1），當(dāng)FEV170%，對病人進(jìn)行自然咳痰或等滲鹽水誘導(dǎo)處理，反之使用高滲鹽水誘導(dǎo)。常用的鹽水霧化程序有兩種：單一濃度高滲鹽水進(jìn)行長時(shí)間的誘導(dǎo)；梯度高滲鹽水從低濃度到高濃度間斷的短時(shí)間誘導(dǎo)，兩種方法總的誘導(dǎo)時(shí)間都小于30分鐘。單一法的鹽水濃度常采用4%或4.5%，該方法具有操作簡便、鹽水對痰中細(xì)胞和可溶成分的影響可估量等優(yōu)點(diǎn)。梯度法常采用3%、4%、5%作為誘導(dǎo)濃度，此方法雖然操作繁復(fù)，較難估量鹽水對痰中細(xì)胞和可溶成分的影響，但能通過誘導(dǎo)間隔進(jìn)行FEV1檢測，選擇是維持相同濃度還是采用下一個(gè)梯度濃度繼續(xù)誘導(dǎo)，如果FEV1降低超過20則終止誘導(dǎo)，提高誘導(dǎo)的安全性和成功率。也有研究者選用5%、7%、9%作為梯度濃度。痰液誘導(dǎo)過程還要注意采用各種方法，盡量減少唾液對痰的污染和稀釋6，由于肥大細(xì)胞在高滲溶液和Ca2+存在的環(huán)境中容易被激活并釋放組胺，所以研究肥大細(xì)胞時(shí)應(yīng)盡量避免采用高滲鹽水進(jìn)行誘導(dǎo)或通過咳痰前的漱口來減少痰液中高滲鹽水的殘留量 7。痰液誘導(dǎo)出來后必須進(jìn)行細(xì)胞分類和活力檢測，合格標(biāo)準(zhǔn)一般為上皮細(xì)胞40%。 另外據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道甘露醇和5三磷酸鹽尿嘧啶也可作為誘導(dǎo)物8，9，但由于甘露醇具有較明顯的刺激支氣管收縮作用，對于哮喘病人不適用，臨床通常將其作為激發(fā)試驗(yàn)的刺激物使用。尿嘧啶一方面能刺激氣道上皮P2Y2受體，打開Cl通道，使分泌物穿越粘膜進(jìn)入氣管腔，另一方面促進(jìn)粘膜下的腺體和杯狀細(xì)胞分泌粘液，同時(shí)增加氣道纖毛的清理作用，與高滲鹽水誘導(dǎo)相比，痰量增加了一倍，而患者的SaO2和PEF等指標(biāo)的下降比高滲鹽水誘導(dǎo)明顯降低，同時(shí)兩種方法的痰細(xì)胞總數(shù)和分類的結(jié)果相近。由于尿嘧啶誘導(dǎo)法具有以上優(yōu)點(diǎn)，有望成為一種評價(jià)呼吸系統(tǒng)疾病特別是哮喘的氣道炎癥的手段，具有一定的應(yīng)用前景。 1.2? 痰液的處理? 當(dāng)前痰的處理主要有兩種方法，一種是全取法10 ，即收集患者咳出的全部痰，另一種是選取法11，即挑選痰栓或痰的粘稠部分進(jìn)行處理。據(jù)Antonio報(bào)道12，選取法的細(xì)胞存活率（80.6%）、嗜酸粒細(xì)胞比例（15.3%）和嗜酸粒細(xì)胞陽離子蛋白（ECP）濃度（548ug/L）顯著高于全取法的細(xì)胞存活率（71.8%）、嗜酸粒細(xì)胞比例（8.3%）和ECP濃度（105ug/L），而選取法的中性粒細(xì)胞比例（33.3%）則顯著低于全取法（42.7%），使用上述兩種方法對正常人的痰進(jìn)行處理時(shí)，亦顯示選取法優(yōu)于全取法。 由于嗜酸粒細(xì)胞主要分布在痰栓中，加入和痰等體積的0.1%DTT或其光學(xué)異構(gòu)體DTE漩渦震蕩2分鐘，37水浴15分鐘能有效地溶解粘液，使痰均勻化以便進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)證明13在室溫或37下，DTT都能提高細(xì)胞和可溶物質(zhì)的檢測質(zhì)量，而且不會(huì)刺激嗜酸粒細(xì)胞釋放ECP，嗜堿粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞釋放組胺；并在不影響細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的前提下，提高細(xì)胞的回收率；對細(xì)胞因子的檢測也無干擾。 2? 可行性和安全性 由于高滲鹽水是支氣管激發(fā)劑，對病人特別是未完全控制的哮喘或慢性氣道阻塞患者進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)有一定危險(xiǎn)性。據(jù)Vlachos-Mayer報(bào)道14，由熟練的研究人員嚴(yán)格按照操作規(guī)范對304例哮喘和25例慢阻肺患者進(jìn)行痰誘導(dǎo)，73%的患者使用小于5%的高滲鹽水，其中又有28%的患者使用生理鹽水，成功率可達(dá)93%，只有8%的哮喘患者FEV1降低超過20%，而這些患者在誘導(dǎo)完成后吸入舒喘寧（200ug-400ug），F(xiàn)EV1都在30分鐘內(nèi)基本恢復(fù)到誘導(dǎo)前水平。另據(jù)Anneke報(bào)道15，使用0.9%、3.0%和4.5%梯度鹽水對93例重癥和難控制性哮喘患者進(jìn)行痰誘導(dǎo)，成功率也能達(dá)到74%，只有22%的患者FEV1降低超過15%。以上報(bào)道與其他文獻(xiàn)16共同提示誘導(dǎo)痰技術(shù)對于臨床研究氣道炎癥是一種較安全和成功率較高的檢測手段。需要強(qiáng)調(diào)的是，誘導(dǎo)前必須準(zhǔn)備好相關(guān)的搶救設(shè)備和藥物，誘導(dǎo)過程必須小心處理，如果病人出現(xiàn)呼吸道不適癥狀，建議馬上終止誘導(dǎo)。 3.? 有效性與重復(fù)性 正常人和哮喘、慢阻肺病人的痰細(xì)胞成分、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子等存在明顯區(qū)別。由于PBS灌洗液對支氣管肺泡灌洗液（BALF）造成不同程度的稀釋，所以對炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子等檢測受到限制。痰與BALF相比，含有更多的中性粒和嗜酸粒細(xì)胞，較少的單核和淋巴細(xì)胞。痰嗜酸粒細(xì)胞分類與支氣管灌洗液、BALF的嗜酸粒細(xì)胞分類相關(guān)性較好。據(jù)Pin 和 Spanavello報(bào)道，在同一誘導(dǎo)技術(shù)的前提下，不同時(shí)間里對癥狀穩(wěn)定的患者進(jìn)行痰細(xì)胞分類和痰內(nèi)可溶性介質(zhì)檢測，其重復(fù)性除了淋巴細(xì)胞之外都非常好，相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.7和0.6以上17,18。 4.? 應(yīng)用 4.1? 診斷方面? 痰是呼吸道粘膜的分泌物，主要成分是粘液和細(xì)胞。據(jù)Belda報(bào)道正常痰液細(xì)胞主要是吞噬細(xì)胞(61%)和中性粒細(xì)胞(36%)，嗜酸粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞較少見19。細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的異常提示不同的氣道炎癥和誘因。研究表明嗜酸粒細(xì)胞增高(3%)是支氣管哮喘、嗜酸粒細(xì)胞支氣管炎和過敏性疾病20，21的特征性標(biāo)志，同時(shí)痰細(xì)胞計(jì)數(shù)是嗜酸粒細(xì)胞支氣管炎的主要診斷依據(jù)22。而且痰嗜酸粒細(xì)胞比起血清ECP，更能靈敏和準(zhǔn)確地反映哮喘患者的氣道炎癥狀況23。它不但能反映哮喘發(fā)病的進(jìn)程，并與氣道阻塞和氣道高反應(yīng)性成正相關(guān)。哮喘發(fā)作時(shí)痰嗜酸粒細(xì)胞呈二至三倍的增長24,25，同時(shí)痰ECP、IL-5也伴隨有顯著的增高，隨著過敏原的消失或吸入激素治療后，痰嗜酸粒細(xì)胞和ECP也會(huì)隨之減少。痰和血清ECP的濃度并無相關(guān)性，當(dāng)痰ECP伴隨癥狀改善而下降時(shí)血清ECP濃度并無改變。這些研究結(jié)果提示痰嗜酸粒細(xì)胞和其脫顆粒產(chǎn)物的水平對于描述炎癥的程度有重要作用。由于肥大細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞在哮喘的氣道炎癥特征如支氣管痙攣收縮、氣道阻塞和氣道高反應(yīng)上扮演重要的角色，所以檢測痰粘液中上述細(xì)胞的產(chǎn)物有助于哮喘的診斷和發(fā)病機(jī)理的研究。據(jù)Birring報(bào)道CVA和EB病人的誘導(dǎo)痰中組胺、白三烯、前列腺素D2、E2和白介素8與正常人相比都有顯著差異26。但由于炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的檢測容易受到痰處理過程的各種因素的干擾而且費(fèi)用昂貴，通常不作為疾病診斷的首選指標(biāo)。另外如果利用上下班不同時(shí)段對誘導(dǎo)痰進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測，該技術(shù)還可應(yīng)用于職業(yè)性哮喘的研究27。 COPD患者痰內(nèi)主要是中性粒細(xì)胞， Keatings和Thompson研究發(fā)現(xiàn)呼吸道內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤程度達(dá)到70%28,29，BALF里中性粒細(xì)胞是正常人的二至三倍29,30。中性粒細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的彈性蛋白水解酶，導(dǎo)致肺實(shí)質(zhì)的彈性纖維破壞和彈性下降，最終導(dǎo)致肺氣腫。患有氣道阻塞的患者其嚴(yán)重程度與痰中性粒細(xì)胞的百分比成正比。小氣道和肺泡管是COPD患者氣道阻力增加的主要部位31，該部位炎癥的變化與氣道的阻塞相關(guān)聯(lián)32?？梢钥隙ㄕT導(dǎo)的痰液包含著下呼吸道的物質(zhì)，所以誘導(dǎo)痰是一種研究COPD氣道炎癥的有用工具。 目前世界衛(wèi)生組織建議將在呼吸道分泌物中找到抗酸桿菌作為診斷肺結(jié)核的首要依據(jù)，但由于該方法的敏感性不高而且有相當(dāng)部分的疑似病人不能自然咳出合格的痰而局限了該方法的應(yīng)用。Conde等人33發(fā)現(xiàn)通過誘導(dǎo)痰這種無創(chuàng)的，安全的方法能解決上述無法自然咳痰的問題，而且結(jié)果與纖維支氣管鏡取材結(jié)果相一致，從而能大大提高結(jié)核的檢出率。 對于肺癌病人，最佳的防治方案是能在早期或者癥狀出現(xiàn)前確診。Vignola發(fā)現(xiàn)34通過檢測誘導(dǎo)痰其特異性的致癌基因、抑癌基因表達(dá)、基因組的不穩(wěn)定性和異常甲基化等指標(biāo)，有可能在患者臨床診斷肺癌前幾年即可以分子生物學(xué)方法進(jìn)行診斷。 4.2? 治療方面? 由嗜酸粒細(xì)胞或中性粒細(xì)胞引起的不同炎癥，其治療方案各有不同。慢性咳嗽、哮喘或COPD患者的痰嗜酸粒細(xì)胞數(shù)量常預(yù)示其對激素治療效果的好壞35。伴有嗜酸粒細(xì)胞增多的慢性咳嗽和COPD對吸入激素治療效果顯著，足量的激素治療可使嗜酸粒細(xì)胞降低到正常水平，但非嗜酸粒細(xì)胞增多的慢性咳嗽和COPD則一般對皮質(zhì)類固醇無效36。通過觀察嗜酸粒細(xì)胞數(shù)量衡量激素治療效果的哮喘患者的要考慮幾個(gè)因素，第一，病人的依從性；第二，病人生活或工作環(huán)境中是否存在頻繁的變應(yīng)原刺激；第三，激素治療劑量不足；第四，診斷錯(cuò)誤，是中性粒細(xì)胞而非嗜酸粒細(xì)胞性哮喘或激素耐受型哮喘。痰細(xì)胞計(jì)數(shù)在治療由吸煙或肺氣腫引起的慢性氣道阻塞也有一定幫助37,38，痰嗜酸粒細(xì)胞的增高提示可用強(qiáng)的松改善癥狀，中性粒細(xì)胞的增高提示患者有感染，可施以抗菌治療。 5.? 存在問題與展望 雖然誘導(dǎo)痰檢測技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)有目共睹，但其不足之處也不容忽視。首先目前國內(nèi)外尚無統(tǒng)一的誘導(dǎo)痰標(biāo)準(zhǔn)化處理方案,不同方案處理得出的結(jié)果有一定的差異39，影響資料的可比性和該方法的廣泛利用。其二，由于處理過程中，鹽水和唾液對不同標(biāo)本的稀釋度存在差異，或在測定痰液上清炎癥介質(zhì)時(shí)，DTT、蛋白酶或其它未知成分的復(fù)合物對免疫測定或其他檢測程序的潛在干擾因素都會(huì)影響結(jié)果的可靠性，而且可溶性介質(zhì)的正常范圍也沒確定，降低其對于臨床的提示作用40。其三，由于痰液存放時(shí)間較短，4只能存放2小時(shí)，標(biāo)本不能留待批量處理，而痰的誘導(dǎo)和處理過程手工步驟多、耗時(shí)較長等都是影響該方法作為常規(guī)檢測項(xiàng)目的不利因素。 如何