微生物實驗手冊.doc

微生物實驗室規(guī)則與安全微生物學(xué)實驗室規(guī)則醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實驗的對象大多為病原微生物，具有傳染性，因此要求進入實驗室后必須嚴格遵守以下實驗室規(guī)則：1進入實驗室應(yīng)穿白大衣，離室時脫下，反折放回原處，不必要的物品不得帶入實驗室，必須帶入的書籍和文具等應(yīng)放在指定的非操作區(qū)，以免受到污染。無菌操作時必須戴口罩，并不得開電風(fēng)扇。2實驗室內(nèi)禁止飲食、抽煙，不得高聲談笑或隨便走動。3各種實驗物品應(yīng)按指定地點存放，用過的器材必須放入消毒缸內(nèi)，禁止隨意放于桌上及沖入水槽。4須送溫箱培養(yǎng)的物品，應(yīng)做好標(biāo)記后送到指定地點。5實驗過程中發(fā)生差錯或意外事故時，禁止隱瞞或自作主張不按規(guī)定處理，應(yīng)立即報告老師進行正確的處理。如有傳染性的材料污染桌面、地面等，應(yīng)立即用0.2%0.5% “84”消毒液浸泡污染部位，作用510min后方可抹去。如手被活菌污染也應(yīng)使用上述消毒液浸泡510min后，再以自來水反復(fù)沖洗干凈。6愛護室內(nèi)儀器設(shè)備，嚴格按操作規(guī)則使用。節(jié)約使用實驗材料，不慎損壞了器材等，應(yīng)主動報告老師進行處理。7實驗完畢，應(yīng)物歸原處并將桌面整理清潔，實驗室打掃干凈。最后以0.2%0. 5% “84”消毒液浸泡手5min，洗凈后方可離開實驗室。實驗一 器皿包扎及消毒與滅菌一、實驗?zāi)康?、了解玻璃器皿的清洗、棉塞制作、移液管和培養(yǎng)皿的包扎方法。2、了解干熱滅菌、紫外線滅菌、微孔濾膜過濾除菌和高壓蒸汽滅菌的原理和應(yīng)用范圍。3、掌握高壓蒸汽滅菌的操作技術(shù)。二、實驗原理（1）實驗室中使用的玻璃器皿簡介 微生物學(xué)實驗所用的玻璃器皿，大多要進行消毒、滅菌和（將“和”改為“才能”）用來培養(yǎng)微生物，因此對其質(zhì)量、洗滌和包裝方法均有一定的要求。玻璃器皿的質(zhì)量一般要求硬質(zhì)玻璃，才能承受高溫和短暫灼燒而不致破壞；玻璃器皿的游離堿含量要少，否則會影響培養(yǎng)基的酸堿度；對玻璃器皿的形狀和包裝方法的要求，以能防止污染雜菌為準(zhǔn)；洗滌玻璃器皿的方法不當(dāng)也會影響實驗的結(jié)果。目前微生物學(xué)實驗室中，有些玻璃器皿（如培養(yǎng)皿、吸管等）已被一次性塑料制品所代替，但玻璃器皿仍是重要的實驗室用具。（2）滅菌的常用方法和基本原理實驗室常用的滅菌方法有干熱滅菌法、紫外線照射法、微孔濾膜過濾除菌法和高壓蒸汽滅菌法等。A.干熱滅菌是用電熱干燥箱（圖1）加熱，利用高溫使微生物細胞內(nèi)的酶、蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。B.紫外線殺菌機制主要是因為它誘導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA鏈的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復(fù)制。C.微孔過濾除菌（圖2、圖3）是通過機械作用濾去液體或氣體中細菌、真菌孢子等的方法。D.高壓蒸汽滅菌也是使蛋白質(zhì)變性而滅菌，高壓蒸汽滅菌鍋（圖4、圖5、圖6）滅菌時是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點增高，得到高于100的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。圖1 電熱干燥箱的外觀和結(jié)構(gòu)圖2 圖3 圖4 高壓蒸汽滅菌鍋圖5 臥式滅菌鍋 圖6 手提式滅菌鍋1.安全閥；2.壓力表；3.放氣閥；4.軟管；5.緊固螺栓；6.滅菌桶；7.篩架；8.水干熱滅菌與高壓蒸汽滅菌的滅菌效果與所滅物品的蛋白質(zhì)含水量有很大的關(guān)系（表1）。就效果而言，濕熱滅菌效果要比干熱滅菌效果好（表2）。在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要（表3），因為空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓，所以，當(dāng)水蒸汽中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。表1 蛋白質(zhì)含水量與凝固所需溫度的關(guān)系卵白蛋白含水量/%30分鐘內(nèi)凝固所需溫度/50562574-801880-906145表2 干熱、濕熱穿透力及滅菌效果比較溫度/時間/h透過布層的溫度/滅菌10層20層100層干熱130-1404867270.5不完全濕熱105.33101101101完全表3 滅菌鍋內(nèi)留有不同分量空氣時壓力與溫度的關(guān)系壓 力 數(shù)全部空氣排出時的溫度 ()2/3空氣排出時的溫度()l/2空氣排出時的溫度 ()1/3空氣排出時的溫度 ()空氣全不排出時的溫度 ()MPakg/cm2 1b/in20.030.070.100.140.170.210.350.701.051.401.752.10 51015202530108.8115.6121.3126.2130.0134.610010911512112613094105112118124128901001091151211267290100109115121壓力數(shù)全部空氣排出時的溫度2/3空氣排出時的溫度1/2空氣排出時的溫度1/3空氣完全排除時的溫度空氣完全排除時的溫度MPaKg/cm21b/in20.030.355108.81009490720.070.7010115.6109105100900.101.0515121.31151121091000.141.4020126.21211181151090.171.7525130.01261241211150.212.1030134.6130128126121延伸閱讀1、紫外線滅菌法紫外線滅菌是用紫外線燈進行的，波長為200300 nm的紫外線都有殺菌能力，其中以260 nm的殺菌力最強。在波長一定的條件下，紫外線的殺菌效率與強度和時間的乘積成正比。紫外線殺菌機制主要是因為它誘導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成，從而抑制了DNA的復(fù)制。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離，再使O2氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成過氧化氫（H2O2），O3和H2O2均有殺菌作用。紫外線穿透力不大，所以，只適用于無菌室、接種箱、手術(shù)室內(nèi)的空氣及物體表面的滅菌。紫外線燈距照射物以不超過1.2 m為宜。此外，為了加強紫外線滅菌效果，在打開紫外線燈以前，可在無菌室內(nèi)（或接種箱內(nèi)）噴灑3-5的石炭酸溶液，一方面使空氣中附著有微生物的塵埃降落，另一方面也可以殺死一部分細菌。無菌室內(nèi)的桌面，凳子可用2-3的來蘇爾擦洗，然后再開紫外線燈照射，即可增強殺菌效果，達到滅菌目的。2、化學(xué)試劑滅菌大多數(shù)化學(xué)藥劑在低濃度下起抑菌作用，高濃度下起殺菌作用。常用5%石炭酸、70%乙醇和乙二醇等。化學(xué)滅菌劑必須有揮發(fā)性，以便清除滅菌后材料上殘余的藥物?；瘜W(xué)滅菌常用的試劑有表面消毒劑、抗代謝藥物（磺胺類等）、抗生素、生物藥物素?？股厥且活愑校ㄓ桑┪⑸锘蚱渌锷顒舆^程中的（刪除）合成的次生代謝產(chǎn)物或人工衍生物，他（它）們在很低濃度時就能抑制或感染它種生物（包括病原菌，病毒，癌細胞等）的生命活動，因而可用作優(yōu)良的化學(xué)治療劑。氣體滅菌法，利用環(huán)氧乙烷或甲醛性殺微生物的一種方法。本辦法主要用于玻璃制品、磁制品、金屬制品、橡膠制品、塑料制品、纖維制品等，用于設(shè)施、設(shè)備或粉末狀的醫(yī)藥品等，使用氣體滅菌時，其被滅菌的物品以未變質(zhì)為前提條件；藥液滅菌法，是用藥液殺滅微生物的方法。本辦法主要用于玻璃制品、磁制品、金屬制品、橡膠制品、塑料制品、纖維制品等物品的滅菌，還可用于手指、無菌箱或無菌設(shè)備等的消毒，藥液滅菌用于未變質(zhì)的物品。通常使用的有酒精（70-75%乙醇）、0.11 % （w/v）鹽化苯類溶液、甲酚、苯酚水或福爾馬林水等。三、實驗材料1、各種玻璃器皿、試管刷、洗滌劑、培養(yǎng)皿、移液管、牛皮紙或報紙等。2、棉花、紗布、線繩、三角瓶和試管等。3、高壓蒸汽滅菌鍋。四、實驗步驟1.棉塞制作2. 移液管和培養(yǎng)皿的包扎3. 高壓蒸汽滅菌鍋的操作（1）加水：將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水使水面與三角擱架相平為宜。（2）裝料：放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌物品。（3）加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓。（4）排氣：通電加熱，待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥。（5）升壓至0.1Mpa。（6）保壓：當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。本實驗用0.1Mpa，121.5，20min滅菌。（7）降壓：滅菌所需的時間到后，關(guān)閉電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表降至“0”時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。（8）無菌檢查：將取出的滅菌培養(yǎng)基放入37溫箱培養(yǎng)24h，經(jīng)檢查若無雜菌生長，即可待用。五、注意事項1切勿忘記加水，同時加水量不可過少，以防滅菌鍋燒干而引起炸裂事故。2壓力一定要降到“0”時，才能打開排氣閥，開蓋取物。否則就會因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染，甚至灼傷操作者。六、實驗結(jié)果1、主要的滅菌技術(shù)有哪幾種？2、滅菌鍋的使用（步驟）3、玻璃器皿包扎（培養(yǎng)皿、移液管）操作：每人嘗試使用手提式滅菌鍋1次，每組制作試管塞4個、三角瓶塞3個（2小，1大），練習(xí)包扎移液管4根，包扎玻璃培養(yǎng)皿1組滅菌。七、思考題1、為什么干熱滅菌比濕熱滅菌所需要的溫度高，時間長？請設(shè)計干熱滅菌和濕熱滅菌效果比較的實驗方案。2、高壓蒸汽滅菌開始之前，為什么要將鍋內(nèi)冷空氣排盡？滅菌完畢之后，為什么待壓力降至“0”時才能打開排氣閥，開蓋取物？3、你知道紫外線燈管是用什么玻璃制作的？為什么不用普通玻璃？實驗二 培養(yǎng)基的制備一、實驗?zāi)康?、學(xué)習(xí)掌握培養(yǎng)基的配制原理；2、通過對幾種培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。二、實驗原理培養(yǎng)基是供微生物生長、繁殖和代謝的營養(yǎng)物質(zhì)，需要適宜的pH值、一定的緩沖能力及合適的滲透壓。在培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)微生物時需要添加凝固劑，實驗室常用凝固劑是瓊脂，即從石花菜等海藻中提取的多糖，是應(yīng)用最廣泛的凝固劑，它在96-100融化，46以下凝固，培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后方可使用。（1）培養(yǎng)基據(jù)組成成分可分為:合成培養(yǎng)基：由各種純化學(xué)物質(zhì)按一定比例配制而成。 半合成培養(yǎng)基：有一部分純化學(xué)物質(zhì)和另一部分天然物質(zhì)配制而成。天然培養(yǎng)基：利用天然來源的有機物配制而成。（2）據(jù)用途可分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基：能滿足各種微生物的營養(yǎng)需求的培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基：加入某種物質(zhì)抑制其他微生物生長，使目標(biāo)微生物得到富集，便于分離。鑒別培養(yǎng)基：用來檢測微生物的某些代謝特性。鑒別培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥品，使難以區(qū)分的微生物經(jīng)培養(yǎng)后呈現(xiàn)出明顯差別，因而有助開快速鑒別某種微生物。如常用的麥康凱培養(yǎng)基，它含有膽鹽、乳糖和中性紅。膽鹽具有抑制腸道菌以外的細菌的作用（選擇性），乳糖和中性紅（指示劑）能幫助區(qū)別乳糖發(fā)酵腸道菌（如大腸桿菌）和不能發(fā)酵乳糖的腸道致病菌（如沙門氏菌和志賀氏菌）（3）從培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可分為： 液體培養(yǎng)基：不加凝固劑的液體狀態(tài)培養(yǎng)基。 固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入2%左右的凝固劑的固體狀態(tài)的培養(yǎng)基或農(nóng)副產(chǎn)品培養(yǎng)基。 半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入0.20.5%凝固劑而成的半固體狀培養(yǎng)基。延伸閱讀牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細菌基本培養(yǎng)基，有時又稱普通培養(yǎng)基，其中牛肉膏為微生物提供碳源 、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要提供氮源和維生素，而NaCl提供無機鹽。（1）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基適用于培養(yǎng)一般細菌，其配制方法是： 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g 瓊脂 20g 水 1000ml pH 7.47.6（2）高氏1號培養(yǎng)基（適用于培養(yǎng)放線菌）可溶性淀粉 2gKNO3 0.1gK2HPO4 0.05gMgSO47H2O 0.05gNaCl 0.05gFeSO47H2O 0.001g （可用母液法）瓊脂 2g水 100mLpH 7.47.6（3）孟加拉紅培養(yǎng)基（適用于培養(yǎng)分離真菌）蛋白胨 5g 葡萄糖 10g 磷酸二氫鉀 1g 硫酸鎂(MgSO47H2O) 0.5g 瓊脂 20g 1/3000孟加拉紅溶液 100mL 蒸餾水 1000mL 氯霉素 0.1g三、實驗材料：1、溶液和試劑：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂、1mol/L HCl、1mol/L NaOH等。2、儀器和其他用品：天平、試管、量筒、小燒杯、玻璃棒、藥匙、pH試紙、棉花塞、報紙、棉繩、標(biāo)簽、培養(yǎng)皿、高壓蒸汽滅菌鍋、電爐等。四、實驗步驟（1）稱量。l 蛋白胨很易吸濕，在稱取時動作要迅速。l 牛肉浸膏用小燒杯或培養(yǎng)皿稱量，然后熱水溶化轉(zhuǎn)移。l 稱藥品時嚴防藥品混雜，一把藥匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈，擦干，再稱取另一藥品。l 瓶蓋不要蓋錯。（2）熔化。l 配制培養(yǎng)基時，不可用銅或鐵鍋加熱溶化。l 向燒杯中加入少許所需要的水量，然后隔以石棉網(wǎng)小心加熱，用玻棒攪拌，待藥品完全溶解后定容，補足水分。l 在瓊脂溶化時，應(yīng)控制火力，以免沸騰而溢出容器。需不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦。（3）調(diào)pH。l pH勿調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。滅菌后pH值會下降0.10.2，在做培養(yǎng)基校正pH值時，應(yīng)比實際值高0.10.2。l 若偏酸，滴加1mol/L NaOH調(diào)整，若偏堿，滴加1mol/L HCl調(diào)整（4）過濾。用濾紙或紗布過濾，供一般用的培養(yǎng)基此步驟可省略。（5）分裝。分裝過程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上以免引起污染。注意：固體裝入試管中的量不宜超過試管高度的1/5，半固體1/3，裝入三角燒瓶中的量以燒瓶總體積的一半為限。（6）加塞。培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角瓶上塞好棉塞，以阻止外界微生物污染培養(yǎng)基，并保證有良好的通氣性能。（7）包扎。加塞后，將全部試管用棉繩捆好，再在棉塞外包一層報紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，最后用扎好。同時用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、配制日期、組別。（8）滅菌。將上述培養(yǎng)基以0.103MPa，121，15min高壓蒸汽滅菌。（9）擱置斜面。滅菌的試管培養(yǎng)基冷卻至50左右，將試管一端傾斜擱在玻璃棒或其他合適高度的器具上，擱置的斜面長度以不超過試管長的一半為宜。（10）無菌檢查。將滅菌培養(yǎng)基于37，培養(yǎng)24-48h，以檢查滅菌是否徹底。五、注意事項:1. 蛋白胨很易吸濕，在稱取時動作要迅速。另外，稱藥品時嚴防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈，擦干，再稱取另一藥品。2. 在瓊脂溶化過程中，應(yīng)控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器。配置培養(yǎng)基時，不可用銅或鐵鍋加熱熔化，以免離子進入培養(yǎng)基中，影響細菌生長。3. pH不要調(diào)過頭，以避免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。4. 分裝過程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。六、實驗結(jié)果每組配制高氏1號培養(yǎng)基：100ml，試管斜面2個；牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：200ml，試管斜面4個；孟加拉紅培養(yǎng)基：100ml，試管斜面2個。剩余三角瓶內(nèi)培養(yǎng)基保留瓶內(nèi)，統(tǒng)一滅菌后，下次實驗倒平板操作。七、思考題1、 培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是否為無菌的？2、 在配置培養(yǎng)基的操作過程中應(yīng)主要些什么問題，為什么？3、 馬丁氏培養(yǎng)基的pH“自然”，根據(jù)你配制前2種培養(yǎng)基的經(jīng)驗和所學(xué)知識你認為此培養(yǎng)基滅菌后應(yīng)是偏酸還是偏堿？為什么？實驗三 無菌操作技術(shù)一、實驗?zāi)康?、熟練掌握從固體培養(yǎng)物和液體培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)接微生物的無菌操作技術(shù)；2、體會無菌操作的重要性；3、掌握倒平板的基本操作方法。二、實驗原理在微生物學(xué)實驗或科研生產(chǎn)中，要經(jīng)常地把一定種類的微生物菌種接種或移植到新鮮培養(yǎng)基中。由于我們接種的微生物都是純種的，所以接種工作都必須在無菌環(huán)境下（在無菌室或超凈工作臺）進行，并嚴格遵守?zé)o菌操作技術(shù)。利用接種工具（如接種環(huán)、接種鏟等）進行菌種的移植。因此無菌操作是接種培養(yǎng)微生物的關(guān)鍵。接種方法：常用的有斜面接種法、平板接種法、液體接種法、試管深層固體培養(yǎng)基的穿刺接種法。（1）斜面接種法 把各種培養(yǎng)條件下的菌種，接入斜面上（包括從試管斜面、培養(yǎng)基平板、液體純培養(yǎng)物等中把菌種移接于斜面培養(yǎng)基上）。這是微生物學(xué)中最常用、最基本的技術(shù)之一。接種前，需在待接種試管上貼好標(biāo)簽，注明菌名及接種日期。接種最好在無菌室或無菌箱內(nèi)進行，若無此條件，可在較清潔密閉的室內(nèi)進行。（2）液體接種液體接種是一種用移液管、滴管或接種環(huán)等工具將菌液移接到培養(yǎng)基中的方法。吸管不同于其它接種工具，不能灼燒，可預(yù)先對其進行烘烤法滅菌。（3）穿刺接種穿刺接種常用于保藏菌種或細菌運動性的檢查。一般適用于細菌、酵母菌的接種培養(yǎng)。用接種針沾取少許菌種，移入裝有固體或半固體培養(yǎng)基的試管中，自培養(yǎng)基中心垂直刺入到底，然后按原來的穿刺線將針慢慢拔出。三、實驗材料：超凈工作臺、接種環(huán)等接種工具、斜面培養(yǎng)基、酒精燈、酒精棉球等。接種工具有：接種環(huán)、接種鉤、接種針、接種圈、接種鋤、玻璃涂棒、其他接種工具。四、實驗步驟1、無菌操作要點1）要求建立“有菌概念”。2）接種時要有一個潔凈的環(huán)境，整個操作過程必須在火焰旁進行。3）接種環(huán)，棉塞一定要拿在手上，不能隨便亂丟。2、用接種環(huán)轉(zhuǎn)接菌種接種細菌應(yīng)用接種針（環(huán)）來沾取細菌標(biāo)本，進行接種。接種環(huán)與接種針為用白金絲或合金絲所制，亦可用電爐絲代替，因它能耐高熱且散熱快，便于接種前后通過火焰滅菌（整個接種環(huán)燒紅即達到滅菌目的）。在使用接種環(huán)時一般用右手持筆式較為方便，左手可持培養(yǎng)基進行配合，其接種程序可分為：滅菌接種環(huán)稍冷沾取細菌樣品進行接種（包括：啟蓋或塞、接種劃線、加蓋或塞）進行接種環(huán)滅菌等五個程序。不同培養(yǎng)基，接種方法也不同。接種方法：A、接種前用酒精棉球擦凈桌面；B、將試管貼上標(biāo)簽，注明菌名、接種日期、接種人姓名等，然后用酒精棉球擦手消毒；C、點燃酒精燈以后，在火焰旁將每一支試管內(nèi)的棉塞稍微轉(zhuǎn)一下，使其松動，以便在接種時易拔出，并將試管放在試管架上，放在接種臺的右前方；D、將菌種和斜面培養(yǎng)基的兩支試管，用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于兩試管之間的部分，斜向上，并使他們呈水平位置，也可將試管橫放在左手掌中央，用四個手指托住試管，大拇指壓在試管上，斜面向上；E、右手拿接種環(huán)，在火焰上將環(huán)的部分燒紅滅菌，環(huán)以上凡在接種可能進入試管內(nèi)的部分，均應(yīng)通過火焰灼燒。（見圖）以下操作，需要使管口靠近火旁。F、用右手小指、無名指和手掌拔掉棉塞；G、以火焰灼燒管口，灼燒時應(yīng)不斷轉(zhuǎn)動試管口，使試管口沾染的少量菌得以燒死；H、將燒過的接種環(huán)伸入菌種試管內(nèi)，先將環(huán)接觸沒有長菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燒死被接種的菌體，然后輕輕接觸菌體，取出少許，慢慢將接種環(huán)抽出試管（圖），注意盡量不要使環(huán)的部分碰釘子到管壁，取出后不可使環(huán)通過火焰；從一個試管移種到另一試管I、迅速將接種環(huán)在火焰旁伸進另一試管，在斜面培養(yǎng)基上從底部劃線到頂部，但不要把培養(yǎng)基劃破，也不要使菌種沾染管壁；J、取出接種環(huán)，灼燒試管口，并在火焰旁將棉塞塞上，不要用試管去迎棉塞，以免試管在運到時灌入不潔的空氣；K、將接種環(huán)在火焰上再灼燒滅菌，放回原出后，再騰出手來將棉塞塞緊，將新接種的斜面試管放在試管架上；L、接種后的斜面培養(yǎng)基，放在恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。3、液體培養(yǎng)基中的菌種接入液體培養(yǎng)基中接種工具：移液器，無菌移液管和無菌滴管移液管和滴管不能在火焰上燒，應(yīng)預(yù)先滅菌用無菌移液管自菌種管中吸取一定量的菌液接到另一管液體培養(yǎng)基中，將試管塞好棉塞即可。4、倒平板操作當(dāng)培養(yǎng)基冷至45左右時，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拿培養(yǎng)皿，以中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，靠近火焰，將皿蓋掀開，倒入培養(yǎng)基后將培養(yǎng)皿平放在桌上，順時針和逆時針來回轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基和菌液充分混勻，冷凝后即成平板，倒置于30培養(yǎng)2448h，然后觀察結(jié)果。五、實驗結(jié)果操作：每組倒2皿高氏一號培養(yǎng)基，2皿孟加拉紅培養(yǎng)基和6皿牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（4個玻璃培養(yǎng)皿，2個一次性塑料培養(yǎng)皿）。通過無菌接種技術(shù)每組各接一支大腸桿菌試管和一支金黃色葡萄球菌試管。每組各倒3種不同類型的培養(yǎng)基3個平板以備下次實驗使用。六、思考題1、為什么接種完畢后，接種環(huán)還必須灼燒后再放回原處，吸管也必須放進廢物桶中？實驗四 實驗室環(huán)境和人體表面的微生物檢查一、實驗?zāi)康?、證實實驗室環(huán)境與人體表面存在微生物；2、體會無菌操作的重要性；3、觀察不同類群微生物的菌落形態(tài)特征。二、實驗原理如何知道我們周圍“看不見”的微生物變得可以看得見。通過“放大”成子細胞群體（菌落），使我們看得到它們的存在，即通過培養(yǎng)的方法使肉眼看不見的單個菌體在固體培養(yǎng)基上，經(jīng)過生長繁殖形成幾百萬個菌聚集在一起的肉眼可見的菌落,來檢查實驗室環(huán)境和人體表面的微生物，從而使我們牢固樹立“無菌概念”。平板培養(yǎng)基含有細菌生長所需要的營養(yǎng)成分，當(dāng)取自不同來源的樣品接種于培養(yǎng)基上，在適宜溫度下培養(yǎng)，1-2d內(nèi)每一菌體既可以通過很多次細胞分裂而進行繁殖，形成一個可見的細胞群體的集落，稱為菌落。每一種細菌所形成的菌落都有它自己的特點，例如菌落的大小，表面干燥或濕潤、隆起或扁平、粗糙或光滑、邊緣整齊或者不整齊，菌落透明或半透明，顏色以及質(zhì)地疏松或緊密等。因此可以通過平板培養(yǎng)基來檢查環(huán)境中細菌的數(shù)量和類型。三、實驗材料：1、培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨瓊脂平板2、酒精燈、記號筆、培養(yǎng)皿、恒溫培養(yǎng)箱、打火機等四、實驗步驟1、標(biāo)記培養(yǎng)皿標(biāo)記時在其邊緣寫上自己的實驗項目、名字和日期，如果同一培養(yǎng)皿有多個小區(qū)時，要在各個小區(qū)內(nèi)分別標(biāo)記待處理的樣品名，為了不影響觀察，可用符號或者數(shù)字表示。注意：不能在皿蓋上作標(biāo)記，因為在微生物學(xué)試驗中，經(jīng)常需要同時觀察很多平板，很容易錯蓋皿蓋。分別在兩套塑料一次性平板底部用記號筆劃分出4個小區(qū)，在4個小區(qū)內(nèi)分別標(biāo)上平皿1：A、B、C、D平皿2：E、F、G、H另外2個玻璃培養(yǎng)皿平板分別在標(biāo)簽上標(biāo)記空氣1、空氣22、人體表面微生物的檢查（1）手指表面：在火焰旁，半開皿蓋，用洗前的手指在平板A區(qū)輕輕按一下，迅速蓋上皿蓋。然后用洗手2次，自然干燥后，在平板B區(qū)輕輕按一下，迅速蓋上皿蓋。（2）頭發(fā)：將你的1-2根頭發(fā)輕輕放在平板C區(qū)，迅速蓋上皿蓋。（3）鼻腔：取出滅菌的濕棉簽在自己鼻腔內(nèi)滾動數(shù)次后，立即在平板D區(qū)輕輕摩擦2-3次，蓋上皿蓋。3、實驗室環(huán)境的檢查（1）將標(biāo)有“空氣1”的平板在實驗室打開皿蓋，使培養(yǎng)基表面完全暴露在空氣中，20分鐘后蓋上皿蓋。（2）將另一標(biāo)有“空氣2”的平板同樣操作，置于一個你認為空氣中微生物數(shù)量較多的環(huán)境內(nèi)，20分鐘后蓋上皿蓋。注意：在記錄本上記下“空氣X分別代表的含義。（3）按同樣方法取滅菌濕棉簽，在實驗臺等4個你認為微生物較多的地方擦拭，再分別在第2個塑料平板的E、F、G、H相應(yīng)區(qū)域滾動接種。（注意做好取樣地點記錄）4、培養(yǎng)將所有的瓊脂平板翻轉(zhuǎn)，使皿底朝上，置37攝氏度培養(yǎng)1天。5、菌落特征描述如下（1）大?。捍?、中、小、針尖狀?？上葘⒄麄€平板上的菌落粗略觀察一下，再決定大、中、小的標(biāo)準(zhǔn)；（2）顏色：黃色、金黃色、灰色、乳白色、紅色、粉紅色等；（3）干濕情況; 干燥、濕潤、粘稠；（4）形態(tài)：圓形、不規(guī)則等；（5）高度：扁平、隆起、凹下；（6）透明程度：透明、半透明、不透明；（7）邊緣：整齊、不整齊。五、實驗結(jié)果菌落ABCDEFGH空氣1空氣2數(shù)量*大小顏色干濕情況形態(tài)高度透明程度邊緣簡要說明*菌落數(shù)量可用+和-符號表示，從多到少依次為：+，+，+，+，+，-六、思考題1、列舉2-3類微生物，說明它們在本實驗條件下（肉膏蛋白胨瓊脂平板，37）不能生長。2、比較各種來源的樣品，哪一種菌落數(shù)和菌落類型最多？為什么？實驗五 普通光學(xué)顯微鏡的使用及微生物形態(tài)觀察一、實驗?zāi)康?、復(fù)習(xí)普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)、各部分功能和使用方法；2、學(xué)習(xí)掌握油鏡的使用方法及油鏡使用中的注意事項；3、利用油浸系物鏡觀察細菌。二、實驗原理微生物的個體微小，必須借助顯微鏡才能觀察到。因此，顯微鏡就成為微生物學(xué)研究工作者不可缺少的基本工具。顯微鏡的結(jié)構(gòu)1、機械裝置（1）鏡座：是顯微鏡的底座，支持整個鏡體，使顯微鏡放置穩(wěn)固。（2）鏡柱：鏡座上面直立的短柱，支持鏡體上部的各部分。（3）鏡臂：彎曲如臂，下連鏡柱，上連鏡筒，這取放鏡體時手握的部位。鏡臂的下端與鏡柱連接處有一活動關(guān)節(jié)，可使鏡體在一定范圍內(nèi)后傾，便于觀察。（4）鏡筒：為顯微鏡上部圓形中空的長筒，其上端放置目鏡，下端與物鏡轉(zhuǎn)換器相連，并使目鏡和物鏡的配合保持一定的距離，其作用是保護成象的光路與亮度。（5）物鏡轉(zhuǎn)換器：接于鏡筒下端的圓盤，可自由轉(zhuǎn)動，盤上有3-4個螺旋圓孔，為安裝物鏡的部位，當(dāng)旋動轉(zhuǎn)換器時，物鏡即可固定在使用的位置上，保證物鏡與目鏡的光線合軸。（6）載物臺：為放置玻片標(biāo)本的平臺，中央有一圓孔，以通過光線。兩旁裝有壓片夾或移動器，可固定玻片標(biāo)本和移動玻片。（7）調(diào)節(jié)器：為了得到清晰的物像，必須調(diào)節(jié)物鏡與標(biāo)本之間的距離，使它與物鏡的工作距離相等。這種操作叫調(diào)焦。在鏡臂兩側(cè)有粗、細調(diào)焦螺旋各一對，旋轉(zhuǎn)時可使鏡筒上升或下降。大的一對是粗調(diào)焦螺旋，調(diào)動鏡筒升降距離大，旋轉(zhuǎn)一周可使鏡筒移動2毫米左右。小的一對是細焦螺旋，調(diào)動鏡筒的升降距離很小，旋轉(zhuǎn)一周可使鏡筒移動約0.1毫米。在用低倍物鏡觀察時，使用粗調(diào)焦螺旋；用高倍物鏡觀察時，用細調(diào)焦螺旋。2、光學(xué)系統(tǒng)（1）光源（2）聚光器（或鏡）：裝在載物臺下，由聚光鏡（幾個凸透鏡）和虹彩光圈（可變光欄）等組成。它可將平行的光線匯集成束，集中在一點，以增強被檢物件。聚光器可以上下調(diào)節(jié)，如用高倍鏡時，視野范圍小，則需上升聚光器，用低倍物鏡時，視野范圍大，可下降聚光器。（3）光圈：裝在聚光器內(nèi)，位于載物臺下方，撥動操縱桿，可使光圈擴大或縮小，借以調(diào)節(jié)通光量。 3、光學(xué)部分（1）物鏡：這是決定顯微鏡質(zhì)量的最主要部件，安裝在鏡筒下端的物鏡轉(zhuǎn)換器上，一般有三個放大倍數(shù)不同的物鏡，即低倍（10）、高倍（40）、油鏡（100）。使用油鏡時，必須在蓋玻片上和聚光器上滴加一滴香柏油（鏡油），然后才能使用。在物鏡上，有鏡口率(N.A.)的標(biāo)志，它反應(yīng)該鏡頭分辨力的大小，其數(shù)字越大，表示分辨率越高，各物鏡的鏡口率如下表：物鏡鏡口率（N.A.）工作距離（mm）100.257.0400.650.651001.300.15（2）目鏡：安裝在鏡筒上端，它的作用是將物鏡所成的像進一步放大，使之便于觀察。其上刻有5、10、16等，表示不同放大倍數(shù)，可根據(jù)當(dāng)時需要選擇使用。目鏡內(nèi)的光欄上可裝一段頭發(fā)，在視野中則為一黑線，叫指針，可以用它指示要觀察的部分。顯微鏡的放大倍數(shù)和分辨率：放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)接目鏡放大倍數(shù)顯微鏡的分辨率：表示顯微鏡辨析物體（兩端）兩點之間距離的能力，可用公式表示為：D=/2nsin。式中D：物鏡分辨出物體兩點間的最短距離，l：可見光的波長（平均0.55mm)，n：物鏡和被檢標(biāo)本間介質(zhì)的折射率，a：鏡口角（即入射角）。與其他物鏡不同，油鏡需在載玻片與鏡頭之間加滴鏡油，原因有二：1）增加照明亮度。油鏡的放大倍數(shù)可達100，焦距很短，直徑很小，但所需要的光照強度卻最大。為了不使通過的光線有所損失，必須加入與玻璃的折射率（n=1.55）相仿的鏡油。通常用香柏油（n=1.52）。2）增加顯微鏡的分辨率，油鏡的分辨率可達到0.2m左右。三、實驗材料：1、自制觀察玻片；2、香柏油、二甲苯等；3、普通光學(xué)顯微鏡等。四、實驗步驟（一）顯微鏡的使用操作1、顯微鏡的安置；2、光源調(diào)節(jié)；3、調(diào)節(jié)雙筒顯微鏡的目鏡；4、聚光器數(shù)值孔徑的調(diào)節(jié)；5、觀察。（二）顯微鏡觀察的操作順序1、低倍鏡觀察觀察任何標(biāo)本，都必須先用低倍鏡，因為低倍鏡的視野范圍大，容易發(fā)現(xiàn)目標(biāo)和確定觀察的部位。兩眼從側(cè)面注視物鏡，并慢慢按順時針方向轉(zhuǎn)動粗調(diào)焦螺旋，使鏡筒徐徐下必至物鏡玻片約5毫米處，接著用左眼注視鏡筒內(nèi)，同是按反時針方向，向右、向內(nèi)轉(zhuǎn)動粗調(diào)焦螺旋使鏡筒緩慢上升，直到看見清晰的物像為止（注意不可在調(diào)焦點時邊觀察邊下必鏡筒，否則會使物鏡和玻片觸碰，壓碎破片，損壞物鏡）。如一次調(diào)節(jié)看不到物像，應(yīng)重新檢查材料是否在光軸線上，重新移正材料，再重復(fù)上述操作過程直至物像出現(xiàn)和清晰為止。為了使物像更加清晰，此時可使用細調(diào)焦螺旋，輕微轉(zhuǎn)動到使物像最清楚時為止，但切忌連續(xù)轉(zhuǎn)動多圈，以免損傷儀器的精確度。當(dāng)細調(diào)焦螺旋向上或向下轉(zhuǎn)不動時，就是轉(zhuǎn)到了極限，千萬不能再硬擰，而應(yīng)重新調(diào)粗調(diào)焦螺旋，把物鏡與標(biāo)本的距離稍稍拉開后，再反擰細焦螺旋，約10圈左右（因一般可動范圍為20圈）。2、高倍鏡觀察先用低倍鏡找到要觀察的物像，然后把物像移至視野中央，最后換用高倍鏡，再調(diào)節(jié)細準(zhǔn)焦螺旋對焦，調(diào)清物像，同時應(yīng)調(diào)節(jié)光圈以增加通光量。在換用高倍鏡觀察時，視野變小變暗，所以要重新調(diào)節(jié)視野的亮度，此時或升高聚光器或放大虹彩光圈。3、油鏡觀察（1）用前檢查：零件是否齊全，鏡頭是否清潔；（2）調(diào)節(jié)光亮度；（3）低倍鏡觀察：粗調(diào)、細調(diào)；（4）依次再進行中倍、高倍觀察；（5）油鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，提升聚光鏡，在標(biāo)本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細調(diào)至看清物象為止；（6）換片：另換新片，必須從第三條開始操作；（7）用后復(fù)原：觀察完畢，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少量二甲苯擦去殘留的油，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，后將鏡體全部復(fù)原。（三）觀察玻片的制作1）取一干凈載玻片；2）在載玻片中間滴一小滴水；3）用接種環(huán)取少量斜面培養(yǎng)基上的細菌于水中；4）自然干燥；5）火焰固定；6）染色：用染液染色一分鐘；7）水洗；8）自然干燥。五、注意事項:1.顯微鏡使用中的注意事項（1）不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞； （2）鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度；（3）觀察標(biāo)本時，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當(dāng)目視接目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面：（4）觀察時，兩眼睜開，養(yǎng)成兩眼能夠輪換觀察的習(xí)慣，以免眼睛疲勞，并且能夠在左眼觀察時，右眼注視繪圖；（5）拿顯微鏡時，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿；（6）顯微鏡應(yīng)存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。2.油鏡使用注意（1）在使用油鏡之前，必須先經(jīng)低、高倍鏡觀察，然后將需進一步放大的部分移到視野的中心。（2）轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，使高倍鏡頭離開通光孔，在需觀察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢轉(zhuǎn)動油鏡，在轉(zhuǎn)換油鏡時，從側(cè)面水平注視鏡頭與玻片的距離，使鏡頭浸入油中而又不以壓破載玻片為宜。六、實驗結(jié)果取上次實驗得到的2-3個菌落制片，繪制你的觀察結(jié)果。七、思考題1、用油鏡觀察時應(yīng)注意哪些問題？在載玻片和鏡頭之間滴加香柏油有什么作用？2、根據(jù)你的實驗體會，談?wù)剳?yīng)如何根據(jù)所觀察微生物的大小選擇不同的物鏡進行有效的觀察。實驗六 革蘭氏染色法一、實驗?zāi)康?、了解革蘭氏染色原理；2、鞏固顯微鏡操作技術(shù)；3、學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏染色法。二、實驗原理革蘭氏染色與細胞壁密切相關(guān)，是C. Gram（革蘭）于1884年發(fā)明的一種鑒別不同類型細菌的染色方法。通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物。革蘭氏陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現(xiàn)縫隙，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。 革蘭氏陰性桿菌革蘭氏陽性桿菌 Procedures of Gram Staining初染1min結(jié)晶紫媒染1min碘液脫色30s復(fù)染2min復(fù)紅/番紅95%乙醇G+G-革蘭氏染色三、實驗材料：1、菌種：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、環(huán)境中分離得到的菌種；2、試劑：草酸銨結(jié)晶紫、盧戈碘液、95%乙醇、番紅染液；3、儀器材料：顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環(huán)、擦鏡紙、二甲苯、香柏油、生理鹽水等。附：實驗相關(guān)試劑配制方法1、結(jié)晶紫染色液(Huclker改訂)A液：結(jié)晶紫 2.5g，95%酒精 25.0ml；B液：草酸銨 1.0g，蒸餾水 100ml。將結(jié)晶紫研細后，加入95%酒精，使之溶解，配成A液。將草酸銨溶于蒸餾水，配成B液。兩液混合即成。2、盧戈氏碘液的成份為5%碘、10%碘化鉀的清水。碘本身很難在水中溶解，但是假如水中已經(jīng)有被溶解了的碘離子的話，那么碘可以通過形成多碘離子而被溶解；碘很容易溶解在乙醇中，但是由于乙醇易燃、易揮發(fā)、有時會導(dǎo)致副作用，因此有時乙醇不宜作為溶液。溶有碘的乙醇被稱為碘酒。試劑配方：碘化鉀 2g；蒸餾水 300ml；碘 1g。先將碘化鉀溶于少量蒸餾水中，待全溶解后再加碘，振蕩溶解后稀釋至300ml，保存在棕色玻璃瓶內(nèi)。用時可將其稀釋2-10倍，這樣染色不致過深，效果更佳。四、實驗步驟（1）涂片：常規(guī)方法涂片；（2）干燥：讓涂片自然晾干；（3）固定：手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2-3次固定（以不燙手為宜）；（4）初染：加適量（以蓋滿細菌涂面）的結(jié)晶紫染色液染色40s；水洗至流出水無色，吸去殘水；（5）媒染：用碘液覆蓋菌膜1min，水洗至流出水無色；（6）脫色：將玻片上殘留水用吸水紙吸去，在白色背景下將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇脫色（一般20-30s）至流出液無色，立即用水洗去乙醇；（7）復(fù)染：將玻片上殘留水用吸水紙吸去，滴加番紅復(fù)染3min；水洗，吸去殘水；（8）晾干；（9）鏡檢：鏡檢時先用低倍，再用高倍，最后用油鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色反應(yīng)性。五、注意事項:1、革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴格規(guī)定；2、染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果；3、盡量選用幼齡的細菌。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。六、實驗結(jié)果描述你所處理的至少4種菌的染色效果。七、思考題1、革蘭氏染色是否成功，有哪些問題需要注意，為什么？2、為什么用老齡菌進行革蘭氏染色會造成假