生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)大綱-四川農(nóng)業(yè)大學(xué)課程.doc

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)本科課程教學(xué)大綱一、課程名稱：生物化學(xué)實(shí)驗(yàn) 總學(xué)時(shí)：36學(xué)時(shí)二、課程的性質(zhì)、地位和和任務(wù)生物化學(xué)是一門實(shí)踐性很強(qiáng)的課程，按照我?！按蠡A(chǔ)教育，寬口徑培養(yǎng)，按需要選擇，主輔修結(jié)合，強(qiáng)能力訓(xùn)練，重素質(zhì)培養(yǎng)”的本?？迫瞬排囵B(yǎng)總體思路，生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)從理論教學(xué)中剝離出來，單獨(dú)行課，單獨(dú)考核。按照四川農(nóng)業(yè)大學(xué)1998年公布的本科教學(xué)計(jì)劃，原基礎(chǔ)生物化學(xué)、動(dòng)物生物化學(xué)、食品生物化學(xué)合并為一門課生物化學(xué)及分子生物學(xué)基礎(chǔ)。其中的實(shí)驗(yàn)部分單列為一門課，名稱為基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)，36學(xué)時(shí)，1學(xué)分。本課程的任務(wù)是教授生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的基礎(chǔ)理論及應(yīng)用，并通過具體的實(shí)驗(yàn)教學(xué)使學(xué)生掌握常用的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)理論和方法，并能進(jìn)行獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)操作，從而促進(jìn)學(xué)生從事科學(xué)研究和技術(shù)工作的基本素質(zhì)的提高和創(chuàng)新意識(shí)的培養(yǎng)。據(jù)此，我們對(duì)原三門實(shí)驗(yàn)教學(xué)大綱進(jìn)行綜合修改。新大綱由兩部分組成，一部分系統(tǒng)介紹常用生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的基本原理和應(yīng)用；第二部為具體的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)。在原已開設(shè)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，新增添了部分生物化學(xué)大實(shí)驗(yàn)和一些綜合性實(shí)驗(yàn)等新內(nèi)容。將動(dòng)物、植物、食品生化實(shí)驗(yàn)內(nèi)容綜合，實(shí)驗(yàn)材料可根據(jù)不同的專業(yè)而選定，由此建立生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的完整體系，拓寬學(xué)生的知識(shí)面。本門實(shí)驗(yàn)課最初以自編的基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法為教材，該教材根據(jù)我校的專業(yè)特色選取的實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過多年不斷完善，收到了很好的使用效果。在此基礎(chǔ)上，為適應(yīng)專業(yè)和教學(xué)內(nèi)容的調(diào)整，我校楊婉身教授主編了全國(guó)高等農(nóng)業(yè)院校教材現(xiàn)代生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，其中收錄了許多我校自編實(shí)驗(yàn)課教材的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。該書的使用，不僅增加了本課程開設(shè)實(shí)驗(yàn)的選擇面，也進(jìn)一步提高了實(shí)驗(yàn)的總體質(zhì)量。經(jīng)過近幾年的實(shí)施和改進(jìn)，證實(shí)這種基礎(chǔ)加綜合性實(shí)踐教學(xué)課程的設(shè)置，不僅加深了各個(gè)專業(yè)學(xué)生對(duì)生物化學(xué)的基本概念和基本技術(shù)的理解和掌握，使學(xué)生的理論學(xué)習(xí)和實(shí)踐過程有機(jī)結(jié)合，同時(shí)，也為學(xué)生提供了參與綜合性實(shí)驗(yàn)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)的機(jī)會(huì)，提高了學(xué)生的實(shí)踐能力和思考能力，為其專業(yè)課的學(xué)習(xí)打下了扎實(shí)的基礎(chǔ)。三、課程教學(xué)目標(biāo)與基本要求第一部分：生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介 4學(xué)時(shí)第二部分：基本實(shí)驗(yàn)操作 23學(xué)時(shí)第三部分：綜合性、設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn) 9學(xué)時(shí)四、實(shí)驗(yàn)綱要第一部分 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)介(4學(xué)時(shí))一、生化實(shí)驗(yàn)樣本的制備1、動(dòng)物樣本的制備2、植物材料的處理3、微生物材料的處理二、分光光度法1、分光光度法2、分光光度法在生物化學(xué)中的應(yīng)用3、常用分光光度計(jì)：721型、752型紫外分光光度計(jì)的使用三、層析法1、層析法的原理及應(yīng)用2、常用的幾種層析方法及原理：（1）紙層析；（2）薄面層析；（3）凝膠層析；（4）親和層析四、電泳法1、電泳的基本原理及應(yīng)用2、常見的幾種電泳方法（1）聚丙烯酰胺凝膠電泳（2）瓊脂糖凝膠電泳（3）醋酸纖維薄膜電泳（4）毛細(xì)管電泳3、影響電泳的主要因素五、離心分離技術(shù)1、離心分離技術(shù)的原理和應(yīng)用2、常用離心機(jī)的使用六、生物大分子的分離純化的一般原理和步驟第二部分 生物化學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一 蛋白質(zhì)的兩性解離及等電點(diǎn)的測(cè)定（2學(xué)時(shí)）目的和要求：認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)，了解等電點(diǎn)的意義及其與蛋白質(zhì)分子沉降的關(guān)系，學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測(cè)定方法。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：氨基酸通過肽鍵連接成多肽鏈，除N-端和C-端外，還有一定數(shù)量的可解離的側(cè)鏈基團(tuán)，因此蛋白質(zhì)也是兩性電解質(zhì)。蛋白質(zhì)分子上可解離基因的解離程度與溶液的pH值有關(guān)。在一定pH條件下，就會(huì)解離而帶電，帶電的性質(zhì)和多少?zèng)Q定于蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)及溶液的pH。在某一pH條件下，蛋白質(zhì)分子所帶的正電荷數(shù)恰好等于負(fù)電荷數(shù)，即凈電荷等于零。此時(shí)蛋白質(zhì)質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中不移動(dòng)，溶液的這一pH值稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）。如果溶液的pHpI，則蛋白質(zhì)分子會(huì)解離一部分H+而帶負(fù)電荷，此時(shí)蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中就會(huì)向正極移動(dòng)。 COOH COO- COO- +H+ -H+ Pr Pr Pr -H+ +H+ NH3+ NH3+ NH2 陽離子 兩性離子 陰離子 pHpI 在電場(chǎng)中： 帶正電，向負(fù)極移動(dòng) 不移動(dòng) 帶負(fù)電，向正極移動(dòng)由于各種蛋白質(zhì)解離基團(tuán)的種類和數(shù)量不同，因此等電點(diǎn)也不相同。蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)凈電荷為零，溶解度最低，易發(fā)生聚沉。配制不同pH的緩沖溶液，通過觀察蛋白質(zhì)在這些緩沖液中的溶解情況，即可大致確定其等電點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)二 可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定雙縮脲法（3學(xué)時(shí)）目的和要求：掌握測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量常規(guī)測(cè)定的原理和操作方法，熟悉分光光度計(jì)的使用。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：本實(shí)驗(yàn)介紹雙縮脲法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)的含量。雙縮脲(H2NOC-NH-CONH2)可由兩分子尿素加熱至180左右生成，它在堿性條件下能與Cu2+結(jié)合生成紫紅色絡(luò)合物（稱雙縮脲反應(yīng)）。而蛋白質(zhì)分子中含有兩個(gè)以上相鄰的肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲類似，因此也能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，生成紫紅色絡(luò)合物，其反應(yīng)后溶液顏色的深淺與蛋白質(zhì)（濃度）含量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，符合比爾定律，而且與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸成分無關(guān)，受蛋白質(zhì)特異性影響較小，故可利用此反應(yīng)通過比色法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，該法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度范圍為1-10g/L。實(shí)驗(yàn)三 薄層層析法分離鑒定植物組織中游離氨基酸（3學(xué)時(shí)供選作）目的和要求：了解層析技術(shù)的一般原理，分類及應(yīng)用范圍。重點(diǎn)掌握薄層層析法的原理及操作技術(shù)，用以分離鑒定植物組織中游離氨基酸組分。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：本實(shí)驗(yàn)以硅膠G制成薄板來分離鑒定植物組織中的游離氨基酸組分。硅膠G加有1015%的煅石膏粉作為粘合劑，是微酸性的吸附劑，以它作為固定相，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┳髁鲃?dòng)相，由于各種氨基酸的極性不同，被硅膠G吸附的程度和在流動(dòng)相中的溶解度不同。層析時(shí)，點(diǎn)在硅膠G薄板上的混合氨基酸被不同程度地吸附，當(dāng)流動(dòng)相從固定相上流過時(shí)，各組分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，從而以不同速度隨流動(dòng)相向前移動(dòng)。一般來說，酸性氨基酸和中性氨基酸受吸附力較弱，移動(dòng)距離較長(zhǎng)；堿性氨基酸所受吸附力較強(qiáng)，移動(dòng)距離較短。經(jīng)過一段時(shí)間，即可將混合物中各組分分離開。展層后用茚三酮溶液顯色，將樣品各顯色斑點(diǎn)的Rf值與同時(shí)展層的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的Rf值比較，即可判斷樣品中含有何種氨基酸。實(shí)驗(yàn)四 血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳（3學(xué)時(shí)）目的和要求：了解電泳技術(shù)的原理、分類和應(yīng)用范圍，重點(diǎn)掌握醋酸纖維薄膜電泳分離蛋白質(zhì)的原理和基本技術(shù)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：醋酸纖維薄膜電泳是以醋酸纖維薄膜作為支持物的一種電泳方法。醋酸纖維薄膜由二乙酸纖維素制成，具有均一的泡沫樣的結(jié)構(gòu)，厚度僅120m，滲透性強(qiáng)，對(duì)分子移動(dòng)阻力小。本實(shí)驗(yàn)將其用于分離血清蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子是兩性電解質(zhì)，在pH小于其等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)分子結(jié)合一部分H+而帶正電，在電場(chǎng)中向負(fù)極移動(dòng)，在pH大于其等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)分子解離出H+而帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。血清中含有各種蛋白質(zhì)，將少量新鮮血清用點(diǎn)樣器點(diǎn)在浸有緩沖液的醋酸纖維薄膜上，薄膜兩端經(jīng)過濾紙與電泳槽中緩沖液相連，所用緩沖液pH 值為 8.6，血清蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都小于7.5在此緩沖液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中移向正極，血清中不同蛋白質(zhì)由于帶有的電荷數(shù)量及分子量不同而泳動(dòng)速度不同，帶電荷多及分子量小者泳動(dòng)速度快，帶電荷少及分子量大者泳動(dòng)速度慢。經(jīng)過一定的時(shí)間后，取消電場(chǎng)，將薄膜取出，立即將其浸入氨基黑10B染色液中，使蛋白質(zhì)固定并染色。隨后將薄膜移入漂洗液中，洗至背景無色為止。此時(shí)薄膜顯示出藍(lán)色區(qū)帶，每條帶代表一種蛋白質(zhì)，按泳動(dòng)快慢順序，各區(qū)帶分別為清蛋白，1，2，和-球蛋白。實(shí)驗(yàn)五 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離預(yù)染血清脂蛋白（5學(xué)時(shí)）目的和要求：學(xué)習(xí)了解盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作與原理，掌握用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、鑒定蛋白質(zhì)的技術(shù)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide gel elevtrophoreis,縮寫PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作支持物的一種區(qū)帶電泳，常用于生物高分子物質(zhì)的分離鑒定。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱Acr）和交聯(lián)劑NN-甲叉雙丙烯酰胺（簡(jiǎn)稱Bis）在催化劑作用下，聚合而成，具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠，并以此為支持物在垂直的玻璃管中進(jìn)行電泳。本實(shí)驗(yàn)采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)分離鑒定血清中的脂蛋白。脂蛋白是一類結(jié)合蛋白質(zhì)，血清脂蛋白包括-脂蛋白、-脂蛋白、前-脂蛋白、乳糜微粒等組分。將預(yù)先用蘇丹黑染色的血清樣品加入凝膠管中電泳后即可直接觀察到上述各組分的顯色區(qū)帶，若用光密度掃描儀則可定量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)六 酶促轉(zhuǎn)氨反應(yīng)（4學(xué)時(shí)）目的和要求：利用紙層析方法定性測(cè)定植物（動(dòng)物）組織中轉(zhuǎn)氨酶的活性，掌握分配層析的原理以及層析法研究代謝的基本方法。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：本實(shí)驗(yàn)以谷氨酸和丙酮酸混合溶液在GPT作用下的反應(yīng)來觀察酶促轉(zhuǎn)氨基作用，其反應(yīng)式為：丙氨酸 -酮戊二酸 丙酮酸 谷氨酸 反應(yīng)結(jié)果可利用紙層析分離分析鑒定。實(shí)驗(yàn)七 影響酶作用的因素（3學(xué)時(shí)）目的和要求：了解pH。溫度、抑制和激活劑以及酶濃度對(duì)酶的影響，加深對(duì)酶的基本性質(zhì)和特點(diǎn)的認(rèn)識(shí)和理解。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：本實(shí)驗(yàn)借淀粉酶對(duì)淀粉的水解作用來觀察，溫度、pH值、激活劑等對(duì)酶促反應(yīng)的影響，根據(jù)淀粉及其水解產(chǎn)物與碘呈色的不同，指示淀粉的水解程度，作為酶活性大小的指標(biāo)。脲酶大量存在于植物組織中，能專一性催化尿素分解。若體系存在NaH2PO4 則反應(yīng)如下： O H2O H2O NaH2PO4 CCO2+2NH3（NH4）2CO3NaHCO3+(NH4)2HPO4 脲酶 NH2 NH2在底物尿素足量時(shí)，酶濃度越大，溶液pH升高越快，這可用酚紅指示劑（pK=7.81，pH顏色范圍6.88.4，黃紅）指示。指示劑變成標(biāo)準(zhǔn)管溶液（pH特定）的顏色所需時(shí)間t（秒）越短，1/t可以表示反應(yīng)速度大小，本實(shí)驗(yàn)用目視比色法就可明顯地觀察到酶濃度與酶促反應(yīng)速度約成正比例關(guān)系。實(shí)驗(yàn)八 過氧化氫酶活力測(cè)定（3學(xué)時(shí)）目的和要求：掌握酶活力測(cè)定的方法，加深對(duì)酶促反應(yīng)速度及活力單位的理解實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：過氧化氫酶能把過氧化氫分解成水和氧，其活力大小以一定時(shí)間內(nèi)一定量的酶所分解的過氧化氫量來表示。被分解的過氧化氫量可用碘量法間接測(cè)定。當(dāng)酶促反應(yīng)進(jìn)行一定時(shí)間后，終止反應(yīng)，然后以鉬酸銨作催化劑，使未被分解的過氧化氫與碘化鉀反應(yīng)放出游離碘，再用硫代硫酸鈉滴定碘。其反應(yīng)為： 過氧化氫酶2H2O22H2O+O2 鉬酸銨H2O2+2KI+H2SO4I2+K2SO4+2H2OI2+2Na2S2O32NaI+Na2S4O6反應(yīng)完后，以樣品溶液和空白溶液的滴定值之差求出被酶分解的過氧化氫量，即可計(jì)算出酶的活力。五、綜合性實(shí)驗(yàn)的開設(shè)（2選1）實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目名稱：SOD的分離純化、活力測(cè)定及同工酶分析學(xué)時(shí)：9學(xué)時(shí)1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模菏煜纳飿悠分刑崛∨c純化酶的一般方法。掌握超氧化物歧化酶活性測(cè)定的原理和方法。掌握超氧化物歧化酶同工酶活性染色及鑒定2、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及課時(shí)安排(1)、SOD的分離純化：3學(xué)時(shí)(2)、SOD活力測(cè)定：3學(xué)時(shí)(3)、SOD同工酶分析：3學(xué)時(shí)3、實(shí)驗(yàn)材料、試劑和器材 （1）SOD的提取 ACD抗凝劑：檸檬酸10g，檸檬酸鈉30g，葡萄糖25g，用適量蒸餾水溶解并稀釋至1000ml. 0.9% NaCl：稱取NaCl 0.9g，溶于100ml蒸餾水中。 丙酮 95% 乙醇 氯仿（2）考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)蛋白質(zhì) 考馬斯亮藍(lán)G-250試劑：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%（W/V）的磷酸，蒸餾水定容至1000ml。此試劑常溫下可保存30天。 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：精確稱取結(jié)晶牛血清白蛋白25mg，加蒸餾水溶解并定容至100ml。吸取上述溶液40ml，用蒸餾水稀釋至100ml，即為100ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。（3）SOD活力測(cè)定 50mmol/L pH 8.3 磷酸緩沖液 10mmol/L EDTA鈉鹽溶液 3mmol/L 鄰苯三酚溶液（用10mmol/L鹽酸配制）（4）SOD同工酶活性染色實(shí)驗(yàn)器材：紫外分光光度計(jì) 分析天平 離心機(jī)（4,000rpm）高速臺(tái)式離心機(jī)（10,000rpm） 電動(dòng)攪拌機(jī) 電泳儀一套（穩(wěn)壓電源及垂直板狀電泳槽） 40W日光燈 4、操作步驟SOD的提取： 取新鮮豬血20ml（預(yù)先按0.15:1（V/V）的比例加入ACD抗凝劑），4000rpm，10min，去上層血漿，取下層紅血球粘稠液,并量其體積，然后加入2倍體積的0.9%NaCl溶液清洗，4000rpm，10min，棄上層清液，再加入2倍體積的0.9%NaCl溶液重復(fù)清洗一次，4000rpm，10min，得洗凈的紅血球濃稠液。 向洗凈的紅血球中加入等體積的蒸餾水，劇烈攪拌30min，使其充分溶血。再向溶血液中緩慢加入預(yù)冷的0.25倍體積的95%乙醇溶液和0.15倍體積的氯仿，再繼續(xù)攪拌15min，4000rpm，10min，去變性蛋白沉淀物，得上層液。將上層液用多層紗布進(jìn)行粗濾，以除去上層液中的漂浮物，然后將清液在65-70恒溫水浴中進(jìn)行熱處理，15分鐘后取出迅速冷卻至室溫，4000rpm，5min除沉淀，得淺黃色粗酶液。 向粗酶液中加入等體積的丙酮溶液，冰箱中靜置過液，4000rpm，10min棄上清液，得沉淀。將沉淀物用等體積預(yù)冷的丙酮溶液洗二次，離心收集沉淀，冷凍干燥即得淡藍(lán)綠色成品。蛋白質(zhì)含量測(cè)定考馬斯亮藍(lán)G-250法）： 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取6支具塞試管，編號(hào)，按下表加入試劑：管 號(hào)試 劑123456 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液(ml)00.20.40.60.81.0 蒸餾水(ml)1.00.80.60.40.20 考馬斯亮藍(lán)G-250(ml)555555 蛋白質(zhì)含量(ug)020406080100蓋上塞子，搖勻。注意各管振蕩程度盡量一致。放置10分鐘，在595nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定光吸收值，比色應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)完成。以牛血清白蛋白含量（ug）為橫座標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 樣品中蛋白含量的測(cè)定將待測(cè)的SOD溶解并稀釋到一定濃度，取1支試管，準(zhǔn)確加入0.1ml樣品提取液，加入0.9ml蒸餾水和5ml考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，其余操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作相同。 結(jié)果計(jì)算根據(jù)所測(cè)樣品提取液的光吸收值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量(ug)。SOD活力測(cè)定：鄰苯三酚自氧化率的測(cè)定取4.5ml 50mmol/L pH8.3的磷酸緩沖液，4.2ml蒸餾水和1ml 10mmol/L EDTA-Na2溶液，混勻后在25水浴保溫20分鐘，取出后立即加入25預(yù)熱過的鄰苯三酚溶液0.3ml，迅速搖勻，倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)，用10mmol/L HCl作空白，325nm波長(zhǎng)下每隔30秒鐘測(cè)光吸收值一次，整個(gè)操作在4分鐘內(nèi)完成，計(jì)算出每分鐘A325的增值，此即為鄰苯三酚自氧化率。要求自氧化速率控制在0.070/min左右。 酶活力測(cè)定操作與基本一致，加入鄰苯三酚前，先加入一定體積的SOD樣液，蒸餾水則減少相應(yīng)的體積，同理測(cè)其光吸收值，計(jì)算加酶后鄰苯三酚自氧化率。 酶活性單位的計(jì)算根據(jù)酶活性單位的定義，按下列公式計(jì)算酶活性：其中，A0：為鄰苯三酚自氧化率；Am：加酶后鄰苯三酚自氧化率；V總：反應(yīng)總體積；V樣：加入樣品液的體積；V定義：活性單位定義體積1ml；樣品SOD比活力（U/mg）=單位體積活力（U/ml ）/Cpr CPr：每ml樣品液蛋白質(zhì)含量(mg)。SOD總活性(U)單位活性酶原液總體積 SOD結(jié)果處理將測(cè)得的數(shù)據(jù)或計(jì)算結(jié)果填入下表：提純步驟酶液總體積ml蛋白質(zhì)mg/ml酶活性(U/ml)總活性(U)比活性U/mg. pr回收率(%)純化倍數(shù)除血蛋白上清熱變性后上清丙酮沉淀后的SOD同工酶鑒定：(1) 樣品制備： 取一定濃度（約0.5mg SOD/ml）酶液，按酶液40% 蔗糖液=11（VV）的比例配成樣品液，待用。(2)上樣及電泳： 將電泳槽注滿電極緩沖液，分別在各樣品槽中加1020L樣品液。在上槽加入少量0.025%溴酚藍(lán)溶液作指示劑，接通電源（樣品側(cè)為負(fù)極），調(diào)電壓至150V電泳，待樣品全部進(jìn)膠后，調(diào)電壓至200V，至示蹤染料下行距膠底1cm處停止電泳，取出玻璃板（含膠）。(3) 顯帶： 用扁平藥匙輕輕揭去一塊玻璃板，另一板上的凝膠膠面朝下，再啟膠一角注水，使膠緩緩落入培養(yǎng)皿中。將電泳后的凝膠在嚴(yán)格避光的NBT溶液內(nèi)浸泡20min，再放在2.810-3mol/L的EDTA-Na2溶液中，40W日光燈下直射，至藍(lán)色背景上出現(xiàn)多條透明酶帶為止。(4) 干膠制備：在浸濕的兩張玻璃紙（比膠大）中夾入凝膠，平置在一塊玻璃板上，趕除其間的氣泡，將玻璃紙四周邊緣折向玻璃板底，用另一塊同樣大小的玻璃板壓住，再用鐵夾將兩塊板邊緣夾緊，室溫下放置至干，修剪后保存。實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目名稱：植物（動(dòng)物）組織中的DNA的提取和純度鑒定、DNA的瓊脂糖凝膠電泳學(xué)時(shí)：9學(xué)時(shí)1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮怂崾巧顒?dòng)最主要的物質(zhì)基礎(chǔ)，不僅通過控制蛋白質(zhì)合成影響細(xì)胞組成成分和代謝類型，而且又以核苷酸在物質(zhì)代謝中起著活化和載體作用，在揭示生命本質(zhì)的研究中占有重要地位。通過從植物組織中提取總DNA，并進(jìn)行純度鑒定和凝膠電泳分析，使學(xué)生初步系統(tǒng)地掌握從生物材料中獲取核酸及其鑒定較為復(fù)雜的整個(gè)過程，掌握其基本原理和方法，能正確掌握幾種儀器的使用，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果做出綜合的分析和判斷，為今后更為復(fù)雜的核酸操作奠定良好的基礎(chǔ)。2、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及課時(shí)安排(1)、DNA的提?。?學(xué)時(shí)(2)、DNA含量測(cè)定和純度鑒定：3學(xué)時(shí)(3)、DNA的瓊脂糖凝膠電泳：3學(xué)時(shí)3、實(shí)驗(yàn)材料、試劑和器材(1)、材料以小麥、高粱、玉米、黃豆、胡豆等植物為材料提取DNA。(2)、試劑DNA提取液（pH8.0）；5MKAc； TE (pH8.0)；氯仿：異戊醇（241）；95%乙醇溶液；瓊脂糖；DNA染料（Golden View）；載樣緩沖液；TBE電泳緩沖液；分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA（DNA/Hind）。(3)、器材研缽、離心機(jī)、恒溫水浴鍋、752紫外光柵分光光度計(jì)、制膠板、水平電泳槽、電泳儀、紫外透射檢測(cè)儀。4、操作步驟(1)、DNA的提取稱取2g植物幼嫩組織剪碎，放入研缽，加入8ml預(yù)熱的DNA提取液，充分研磨，65保溫2030min，不時(shí)搖晃以免成團(tuán)。加入等體積氯仿/異戊醇（24:1）充分搖勻35min，4000rpm，離心5min。收集上清，在72水浴5min后迅速冰浴，隨后加入1/4體積的5M KAC混勻，冰浴20min，4000rpm，離心5min。收集上清，按2.5