AFLP原理和操作.docx

AFLP原理和操作步驟AFLP是通過限制性內(nèi)切酶片段的不同長(zhǎng)度檢測(cè)DNA多態(tài)性的一種DNA分子標(biāo)記技術(shù)。本AFLP 技術(shù)主要特點(diǎn) ：分析所需 DNA 量少，僅需 0.5g；可重復(fù)性好；多態(tài)性強(qiáng)；分辨率高；不需要 Southern 雜交；樣品適用性廣；穩(wěn)定的遺傳性。在技術(shù)特點(diǎn)上，AFLP 實(shí)際上是 RAPD 和 RFLP 相結(jié)合的一種產(chǎn)物。它既克服了 RFLP 技術(shù)復(fù)雜、有放射性危害和 RAPD穩(wěn)定性差，標(biāo)記呈現(xiàn)隱性遺傳的缺點(diǎn)，同時(shí)又兼有二者之長(zhǎng)。近幾年來，人們不斷將這一技術(shù)完善、發(fā)展，使得 AFLP 迅速成為迄今為止最有效的分子。一、 AFLP原理AFLP也是通過限制性內(nèi)切酶片段的不同長(zhǎng)度檢測(cè)DNA多態(tài)性的一種DNA分子標(biāo)記技術(shù)。但AFLP是通過PCR反應(yīng)先把酶切片段擴(kuò)增，然后把擴(kuò)增的酶切 片段在高分辨率的順序分析膠上進(jìn)行電泳，多態(tài)性即以擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度不同被檢測(cè)出來。實(shí)驗(yàn)中酶切片段首先與含有與其共同粘末端的人工接頭連接，連接后的粘末 端順序和接頭順序就作為以后PCR反應(yīng)的引物結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)需要通過選擇在末端上分別填加了13個(gè)選擇性核苷的不同引物，可以達(dá)到選擇性擴(kuò)增的 目的。這些選擇性核苷酸使得引物能選擇性地識(shí)別具有特異配對(duì)順序的內(nèi)切酶片段，進(jìn)行結(jié)合，導(dǎo)致特異性擴(kuò)增。二、實(shí)驗(yàn)試劑Taq酶、EcoRI/ MseIEcoRI/ MseI接頭、E+A引物M+C引物、T4DNALigaseE和M引物、瓊脂、過硫酸胺、丙烯酰胺、尿素、硝酸銀、甲酰胺、 dNTPs、 二甲苯青、冰醋酸、玻璃硅烷、50bpMark三、操作步驟（一）基因組DNA提取和純化參考DNA實(shí)驗(yàn)方法DNA的純化：用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB0.5g/ml）電泳檢測(cè)片段大小，取出其中的1/3已提取的基因組DNA進(jìn)行純化，首先用TE緩沖液補(bǔ)滿 至總體積50ul，再等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）、氯仿/異戊醇（241）各抽提一次， 離心吸上清液于Eppendorf管中，加入1/10體積的NaAC和二倍體積預(yù)冷的無水乙醇，20放置2h以上，10000g離心10min，用 70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次 ，風(fēng)干后溶于30lTE緩沖液中，UV-2401PC（島津）紫外分光光度計(jì)檢測(cè)A260、A280值并定量，再用0.8%瓊脂糖凝膠（含 EB0.5g/ml）電泳檢測(cè)片段大小。注：0.1-0.2g組織可用100ul溶液E溶，0.5g組織，溶液E可增加至300ul，此時(shí)DNA濃度大約為100ng/ul。（二）限制性酶切及連接在0.2ml離心管中加入：模板量約為250ng，2.5l 10酶切緩沖液， 2.5l 10T4DNA連接酶切緩沖液，5U EcoR， 5U Mse，2U T4連接酶，50pmol Mse接頭，雙蒸水補(bǔ)至25l。用PE公司PCR擴(kuò)增儀設(shè)定37過夜反應(yīng)后，于6520min滅酶活，20保存，作為預(yù)擴(kuò)增模板。（三）預(yù)擴(kuò)增取3l酶切連接產(chǎn)物，加入75ng E+A，75ng M+C引物，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1U Tag酶，3l 10PCR緩沖液，加雙蒸水補(bǔ)至30l。反應(yīng)參數(shù)為：9490s；9430s，561min，721min，30循環(huán)；7210min（PE公司PCR儀）。反應(yīng)結(jié)束后，用0.8%瓊 脂糖凝膠（含EB0.5g/ml）電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，取3l產(chǎn)物釋稀50倍，用作選擇性擴(kuò)增模板。（四）選擇性PCR擴(kuò)增取釋稀后的產(chǎn)物3l，加入EcoR選擇性引物、Mse選擇性引物各75ng，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs， 1UTag酶，3l 10PCR緩沖液，加雙蒸水補(bǔ)至30l。反應(yīng)參數(shù)為：9490s；9430s，651min，721min，13循環(huán)（每循環(huán)降0.7）；9430s， 561min， 721min，25循環(huán)；725min（PE公司PCR儀），先用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB0.5g/ml）電泳檢測(cè)先擇性擴(kuò)增產(chǎn)物。（五）凝膠電泳擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺膠（厚度0.5mm）和1TBE電泳緩沖液電泳分離（BIO-RAD公司測(cè)序電泳儀）。拔出梳子，140W恒功率預(yù)電泳 30分鐘，溫度達(dá)到4749。務(wù)必使每個(gè)孔清洗出尿素。選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物中加入等體積上樣緩沖液（98%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.25% 二甲苯青，0.25%溴酚藍(lán)）94變性5min（PE公司PCR儀），結(jié)束后迅速置于冰上直到點(diǎn)樣。每個(gè)泳道加樣8l。一開始用100W恒功率電泳約 2分鐘，使樣品迅速集中到孔底部，再調(diào)到60W恒功率電泳，溫度保持在43左右，至二甲苯青FF至玻璃板2/3處，結(jié)束電泳。（六）銀染固定液：取100ml冰醋酸到900ml去離子水或雙蒸水中。染色液：1g AgNO3 ，1.5ml 37% 甲醛，加去離子水至1L。顯色液：30g Na2CO3，1.5ml 37% 甲醛，2mg硫代硫酸鈉，加去離子水至1L。1、電泳完畢后，將粘有凝膠的玻璃板置入用于銀染的塑料盤中。2、固定：加入固定液，在搖床上輕微震蕩30min。固定結(jié)束后，固定液保留。3、加入去離子水漂洗3次，每次2min。4、染色：將凝膠放入染色盤中，倒入染色液（4），在搖床上輕微震蕩30min。用去離子水漂洗凝膠10秒鐘后，置入顯色