代謝組學(xué)研究進(jìn)展.doc

代謝物組學(xué)（metabonomics）一詞是英國(guó)倫敦大學(xué)帝同學(xué)院的Nicholson教授于1999年首次提出，指的是通過(guò)分析生物的體液、組織中的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物話（metabonome，代謝物組或代謝物圖譜）的變化來(lái)研究整體的生物學(xué)狀況和基因功能調(diào)節(jié)的現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)分支學(xué)科。與傳統(tǒng)的代謝研究相比，代謝物組學(xué)通過(guò)現(xiàn)代化學(xué)的儀器分析技術(shù)檢測(cè)機(jī)體整個(gè)代謝產(chǎn)物譜的變化，并通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析方法研究整體的生物學(xué)功能狀況。代謝物組學(xué)與細(xì)胞代謝物組學(xué)（metabolomics）的區(qū)別是細(xì)胞代謝物組學(xué)研究單個(gè)細(xì)胞或一個(gè)相對(duì)獨(dú)立系統(tǒng)中的小分子成分因外界環(huán)境改變而發(fā)生的代謝變化，主要應(yīng)用于植物生理和細(xì)胞學(xué)研究。其實(shí)早在20世紀(jì)60年代，代謝物組學(xué)的核心技術(shù)核磁共振技術(shù)（NMR），就已經(jīng)被應(yīng)用到代謝研究中。但直到20世紀(jì)90年代，隨著模式識(shí)別分析技術(shù)的發(fā)展，代謝譜的定量分析才得以實(shí)現(xiàn)，并應(yīng)用于藥物和基因功能的研究。利用代謝物組學(xué)研究藥物對(duì)整體的作用主要依賴于多參數(shù)檢測(cè)外源物質(zhì)攻擊所導(dǎo)致的機(jī)體新陳代謝改變。這種方法也適合研究基因突變和轉(zhuǎn)基因所產(chǎn)生的代謝改變以及疾病診斷和療效評(píng)價(jià)。在藥物發(fā)現(xiàn)階段，它可以進(jìn)行體內(nèi)毒性研究、先導(dǎo)藥物的篩選和目標(biāo)化合物的優(yōu)化及體內(nèi)動(dòng)物模型的藥效篩選。在藥物開發(fā)階段，它可以在臨床前安全性評(píng)價(jià)方面進(jìn)行生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和毒性機(jī)制的研究，從而可有效地利用動(dòng)物模型研究人類疾病的治療，發(fā)現(xiàn)與臨床安全性和有效性有關(guān)的生物標(biāo)志物。 1 研究的對(duì)象生物體液 許多生物體液都可以進(jìn)行代謝物組學(xué)研究，包括唾液、血液、血漿、尿液、乳液、腦脊液、組織萃取液等。不同體液的器官分布及功能各不相同，因此包含的代謝產(chǎn)物成分也存在較大差異。每種體液都具有特異性的NMR指紋譜，其中可溶性物質(zhì)的濃度和分子間的相互作用決定了峰譜的密度和分布。如血漿、腦脊液和尿液的代謝譜能夠反映某些藥物或某種發(fā)生在單一器官或多個(gè)器官的疾病所產(chǎn)生的代謝變化。NMR譜很適于體液的生化分析，因?yàn)槠潇`敏度高（檢測(cè)限達(dá)ng級(jí)），檢測(cè)速度快，樣品無(wú)需預(yù)處理，并且?guī)缀跛写x物都具有特有的1H NMR譜。利用特定的軟件可以很容易地把所有可溶性體液中所存在的最大的障礙信號(hào)（水峰譜）除去而不影響結(jié)果分析。 藥物毒性篩選和臨床診斷中對(duì)體液的要求首先是量足、易得，且對(duì)機(jī)體不會(huì)產(chǎn)生損傷，這樣尿液和血漿都適合代謝物組學(xué)研究。利用血漿進(jìn)行代謝物組學(xué)研究的樣品和?，F(xiàn)生化分析以及藥動(dòng)學(xué)研究是一致的，而尿液在代謝物組學(xué)的研究中有其自身的優(yōu)點(diǎn)。首先，如果不處死動(dòng)物，通過(guò)靜脈血管采集血液將對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生損傷和一定程度的應(yīng)激，影響結(jié)果。更為關(guān)注的是血液采集的時(shí)間和頻率的限制，大大影響了血漿大規(guī)模的使用；而尿液就不存在以上問(wèn)題，通過(guò)代謝籠可以定時(shí)、隨時(shí)收集尿液，并不會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生任何影響。尿液一維1HNMR譜圖（600MHz或更大）由成千上萬(wàn)條線組成，其中包含了數(shù)千種代謝物。尿液的1HNMR譜主要由低分子物質(zhì)組成，因?yàn)镹MR主要測(cè)定的是相對(duì)分子質(zhì)量低于20104的小分子物質(zhì)。而血漿中含有大量的高分子物質(zhì)，像蛋白質(zhì)和脂蛋白將會(huì)產(chǎn)生較寬的信號(hào)峰，小分子物質(zhì)的信號(hào)也有可能整合到大分子的信號(hào)峰上。這樣血漿樣品必須經(jīng)過(guò)除蛋白處理，或通過(guò)自旋回波（Spinecho）處理以降低由于蛋白質(zhì)或其他大分子產(chǎn)生的寬信號(hào)峰對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，而這樣的處理也會(huì)對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。因此，代謝物組學(xué)研究中最常用的體液為尿液。在收集時(shí)應(yīng)該使尿液保持低溫，并要添加一定量的防腐劑（一般選用疊氮鈉，因?yàn)樵贜MR分析中疊氮鈉不會(huì)產(chǎn)生有影響的信號(hào)）。 2 研究的核心核磁共振技術(shù) 早在20世紀(jì)60年代，NMR就已經(jīng)應(yīng)用到代謝研究中，但當(dāng)時(shí)質(zhì)子工作頻率低（小于300MHz），能分析的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物較少；隨著質(zhì)子工作頻率和測(cè)量靈敏度的提高（大于400MHz）以及模式識(shí)別技術(shù)的發(fā)展，NMR技術(shù)可分析測(cè)定更多的小分子物質(zhì)，并發(fā)展成為代謝物組學(xué)研究的核心技術(shù)。對(duì)于疾病、毒性反應(yīng)、基因突變等病理過(guò)程引起的復(fù)雜的代謝成分改變，NMR無(wú)疑是一種非常好的技術(shù)手段。首先，NMR是物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)研究中的重要剖析工具，H，F(xiàn)等原子的原子核如同小磁體，當(dāng)置于外界磁場(chǎng)中時(shí)，即按磁場(chǎng)方向取向。NMR譜就是以測(cè)定改變這種取向所需要的射頻能為基礎(chǔ)。其中最常用的是1HNMR，它能反映有機(jī)分子結(jié)構(gòu)中處于不同位置的H原子的信息。在外加磁場(chǎng)的作用下，分子中多個(gè)H原子所處的電子環(huán)境也完全不同，其共振頻率也不相同，因此，其原子就會(huì)有不同的化學(xué)位移。相反，在不同的分子中，處于相同電子環(huán)境的質(zhì)子（也稱等性質(zhì)子）都有大致相同的化學(xué)位移。通過(guò)辨析各種質(zhì)子的吸收峰并根據(jù)各自的化學(xué)位移，就可初步推斷其分子結(jié)構(gòu)。其次，魔角自旋核磁共振技術(shù)magic angle spinning（MASNMR）可用于研究完整組織和細(xì)胞的代謝變化，實(shí)驗(yàn)后的樣品還可以被用于別的試驗(yàn)研究。除NMR外，質(zhì)譜（MS）、氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC/MS）、高效液相色譜（HPLC）和其他光譜分析技術(shù)都曾應(yīng)用于代謝物組學(xué)研究。 從生物分析角度上看，MS和NMR都是進(jìn)行代謝物組學(xué)研究比較好的工具。但在鑒定完整的生物材料上，因?yàn)镹MR對(duì)生物材料沒(méi)有任何損傷性，在復(fù)雜混合樣品分析時(shí)可以得到更豐富的生物學(xué)信息，所以被廣泛應(yīng)用。與NMR相比，MS技術(shù)更加靈敏，但其產(chǎn)生的離子化抑制比較難消除，導(dǎo)致模式定量分析比較困難，并且試驗(yàn)前樣品還需要進(jìn)行萃取和衍生化處理。因?yàn)榇x物組研究中測(cè)定方法的發(fā)展方向最終將要實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的樣品處理和數(shù)據(jù)的自動(dòng)化分析，所以，一般選用比較方便的NMR技術(shù)，尤其是在藥物毒理和臨床研究中。最近研究表明，基于NMR技術(shù)的代謝物組學(xué)能夠在哺乳動(dòng)物上區(qū)分出由于基因的突變而引起代謝表型的改變，鑒定出由于基因和環(huán)境因素作用而產(chǎn)生的特定的代謝型（metabotypes）。代謝物組學(xué)技術(shù)也可以鑒定出動(dòng)物突變體和疾病狀態(tài)下人的一些異常的代謝變化。Griffin等利用基于NMR的代謝物組學(xué)技術(shù)研究了在基因突變情況下動(dòng)物的代謝表型。Moolenaar等利用基于NMR的代謝物組學(xué)技術(shù)檢測(cè)尿液，研究疾病狀態(tài)下人的代謝表型。3 研究的支柱模式識(shí)別技術(shù) 生物體液NMR譜圖的復(fù)雜性是妨礙得到有用的生物學(xué)信息的限制因素，因?yàn)榧词故且粡堃痪S1H NMR譜圖就可能含有幾千條可分辨的譜線，從中得到可以區(qū)分不同代謝狀態(tài)的信息是代謝物組研究的關(guān)鍵。顯然這幾千條譜線不可能都作為參數(shù)研究，所以代謝物組研究所要做的分析方法主要是數(shù)據(jù)降維。因?yàn)閷?duì)于含有n個(gè)參量的模式矢量，每個(gè)關(guān)量是n維空間中的一個(gè)點(diǎn)。如n=2或3，則可直接用圖形顯示這些模式矢量，人眼也可以直接對(duì)其進(jìn)行區(qū)分判別。但n3時(shí)，這種直接顯示顯然是不可能的，這就涉及到數(shù)據(jù)降維的問(wèn)題。如何將 n維空間的圖景在2維或3維空間顯示出來(lái)，并盡可能減少原n維空間中分類信息的丟失，是數(shù)據(jù)降維處理的核心所在。 數(shù)據(jù)降維的分析方法很多，大致可分為有監(jiān)督的（supervised）模式識(shí)別方法和無(wú)監(jiān)督的（unsupervised）的模式識(shí)別方法。屬于有監(jiān)督的模式識(shí)別方法有SIMCA（Soft Independent Modeling of Class Analogy），PLS（Partial Least Squares）和PLS-DA （PLS-Discriminant Analysis）方法等。無(wú)監(jiān)督的模式識(shí)別方法有PCA（Principal Component Analysis）法、非線性作圖（Nonlinear Mapping，NLM）和分層聚類分析（Hierarchical Cluster Analysis，HCA）等。通過(guò)數(shù)據(jù)降維模式識(shí)別分析方法的一般過(guò)程是首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的模式分析，然后選定某一類樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)建模，再對(duì)變量進(jìn)行加權(quán)處理，選定主成分建模的主成分?jǐn)?shù)目，最后利用有監(jiān)督性統(tǒng)計(jì)的方法判別未知樣本。 目前，最常用的模式識(shí)別方法是PCA法。PCA 是一種將分散在一組變量上的信息集中到某幾個(gè)綜合指標(biāo)（主成分，PC）上的探索性統(tǒng)計(jì)分析方法，利用PC描述數(shù)據(jù)集內(nèi)部結(jié)構(gòu)，實(shí)際上也起著數(shù)據(jù)降維的作用。PC是由原始變量按一定的權(quán)重經(jīng)線性組合而成的新變量。這些新變量具有以下性質(zhì)： 每個(gè)PC之間都是正交的。第1個(gè)PC包含了數(shù)據(jù)集的絕大部分方差，第2個(gè)次之，依此類推。這樣，由頭2個(gè)PC作圖，就能夠很好地代表數(shù)據(jù)集所包含的生物學(xué)變化。這樣的PC圖能夠直觀地描述藥物作用到器官之后，根據(jù)其作用機(jī)制而表現(xiàn)內(nèi)在的集束行為，每個(gè)樣本在PC圖上的位置完全由它的代謝反應(yīng)所決定。這樣根據(jù)PC圖中所得到的發(fā)生改變的譜峰的位置，經(jīng)過(guò)一定生物信息學(xué)分析得到發(fā)生改變的物質(zhì)，從而可以了解發(fā)生毒性作用的機(jī)制。 基于NMR的代謝物組研究分析方法的基本步驟是：首先測(cè)定一系列NMR譜圖，不用對(duì)譜峰進(jìn)行指認(rèn)，把譜看作是一個(gè)n維對(duì)象，直接將譜圖分解成 2501000個(gè)區(qū)域進(jìn)行積分，得到積分強(qiáng)度；然后將這些簡(jiǎn)化的數(shù)據(jù)輸入程序，利用PCA等方法進(jìn)行分析，得到PC圖。處于相似生理狀態(tài)的樣本通常具有相似的組分，因此在PC圖中處于相鄰位置。通過(guò)生物信息學(xué)分析可以得到不同狀態(tài)下的生物標(biāo)志物，然后再根據(jù)這些生物標(biāo)志物進(jìn)行機(jī)制或篩選研究。 4 研究的應(yīng)用 4.1 在藥物毒理研究中的應(yīng)用 通常情況下，藥物通過(guò)與遺傳物質(zhì)直接作用而產(chǎn)生毒性，或通過(guò)誘導(dǎo)系統(tǒng)合成與藥物代謝有關(guān)的酶，從而產(chǎn)生有毒的產(chǎn)物。在這種情況下，用基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)方法來(lái)評(píng)價(jià)毒性是有用的。然而，生物異源物質(zhì)有可能只在藥理學(xué)水平上產(chǎn)生作用，因而可能不會(huì)影響基因的調(diào)節(jié)和表達(dá)。再者，某些毒理學(xué)效應(yīng)可能與基因的改變和蛋白質(zhì)的合成完全不相關(guān)。因此，在許多情況下，從基因組和蛋白質(zhì)組角度考慮到的反應(yīng)并不能預(yù)測(cè)藥物毒性。然而，藥物引起的生理紊亂都會(huì)產(chǎn)生直接的生化反應(yīng)，或通過(guò)與控制代謝的酶相結(jié)合而引起內(nèi)源性生化物質(zhì)在比例、濃度、代謝通量等方面的改變。如果這種變化足夠大的話，就會(huì)影響整個(gè)生物體的功能。生物體液中的代謝物與細(xì)胞和組織中的代謝物處于動(dòng)態(tài)平衡。因此，生物體中由于中毒或代謝損害而引起的細(xì)胞功能異常一定會(huì)反映在生物體液成分的變化上。這樣通過(guò)檢測(cè)血漿、尿液、膽汁等生物體液中的一些具有特殊意義的微量物質(zhì)，經(jīng)過(guò)合適的分析方法就能區(qū)分出不同的代謝狀態(tài)，從而也能根據(jù)不同的代謝表型區(qū)分出不同的藥物作用。Anthony等利用NMR技術(shù)通過(guò)測(cè)定尿中代謝成分的變化研究不同腎毒性藥物的作用機(jī)制。 在藥物毒理研究中，由1HNMR譜檢測(cè)到的生物體液中的內(nèi)源性代謝物模式完全依賴于藥物毒性的類型。每一種類型的藥物都會(huì)在生物體液中產(chǎn)生特征的內(nèi)源代謝物濃度和模式變化，這種特征給我們提供了藥物毒性作用機(jī)制和毒性靶器官?？梢岳么x物組學(xué)進(jìn)行毒性標(biāo)志物研究、毒理機(jī)制研究和藥物毒性篩選。 因?yàn)槟蛞旱氖占粫?huì)對(duì)機(jī)體造成任何損傷，故通過(guò)測(cè)定尿液的代謝物組研究很適合藥物的篩選。進(jìn)行藥物篩選需要滿足3個(gè)方面的信息：首先，要能夠鑒定出單個(gè)或?qū)φ战M的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否為正常狀態(tài)；其次，通過(guò)模式識(shí)別分析與對(duì)照組和模型藥物產(chǎn)生的代謝譜相比較，能夠鑒定出受試化合物的“毒性狀態(tài)”；最后通過(guò)分析鑒定出毒性作用的生物標(biāo)志物。很明顯，NMR技術(shù)能夠在復(fù)雜的混合物中檢測(cè)出小分子物質(zhì)。因此，可以利用代謝物組學(xué)技術(shù)進(jìn)行毒性標(biāo)志物研究。Holmes等利用代謝物組學(xué)研究腎小管S3段損傷性化合物HgCl2和HCBD，結(jié)果隨腎小管S3段損傷的加劇，尿中葡萄糖、乳酸、羥丁酸鹽、馬尿酸鹽、肌酐和酮戊二酸顯著升高，表明尿中這些物質(zhì)可以作為腎小管S3段損傷性藥物的生物標(biāo)志物。硝酸雙氧鈾引起腎毒性的標(biāo)志物為尿中高濃度的羥丁酸。 國(guó)際知名的制藥公司輝瑞、羅氏、諾和諾德、百時(shí)美施貴寶以及禮來(lái)于2003年在英國(guó)倫敦大學(xué)的帝國(guó)學(xué)院成立了毒理代謝物組學(xué)國(guó)際研究協(xié)作組（The Consortium on Metabonomic Toxicology，COMET）。建立該協(xié)作組的目的是為在藥物發(fā)現(xiàn)階段應(yīng)用代謝物組學(xué)對(duì)藥物進(jìn)行毒性篩選，從而有效地降低藥物的不良反應(yīng)，以提高研發(fā)成功率。 4.2 在基因功能研究中的應(yīng)用 利用代謝物組技術(shù)檢測(cè)生物體液，根據(jù)其代謝表型可以把不同類動(dòng)物（像大小鼠）區(qū)分開。動(dòng)物種類不同，沉默基因（silent gene）所表現(xiàn)的功能就不同，從而影響了代謝過(guò)程，以致產(chǎn)生了不同的代謝表型。這樣的研究結(jié)果也許可以解釋藥物在不同種類動(dòng)物中毒性的差異，由于代謝產(chǎn)物和受體數(shù)量的不同，而造成內(nèi)源代謝途徑活性的差異，從而引起藥物在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的毒性不同。這也說(shuō)明了利用代謝物組技術(shù)可以研究轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和動(dòng)物突變體代謝的表型，進(jìn)而可以研究基因的功能作用。Griffin等的研究表明，通過(guò)肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染破壞宿主細(xì)胞膜可以引起明顯的代謝變化，這種干涉過(guò)程對(duì)細(xì)胞系統(tǒng)或機(jī)體本身所產(chǎn)生的作用也許引起一部分或一類基因的功能發(fā)生改變。結(jié)果表明可以應(yīng)用代謝成分的改變研究基因的功能。Lonie等利用代謝成分的改變研究沉默基因突變所導(dǎo)致表型發(fā)生改變，結(jié)果表明代謝物組是研究基因功能的一個(gè)很好的途徑，因?yàn)闄C(jī)體在同種狀態(tài)下的基因和蛋白質(zhì)數(shù)量要比代謝成分的數(shù)量多許多。代謝物組學(xué)還可以應(yīng)用在疾病的診斷、發(fā)生過(guò)程的研究、植物代謝等方面。 5 結(jié)語(yǔ) 總之，代謝物組學(xué)已經(jīng)作為一種獨(dú)立的技術(shù)被廣泛應(yīng)用于藥物的毒性研究和基因功能研究中，還被幾家制藥公司納入其藥物研發(fā)方案中。許多生物化學(xué)、藥物毒理學(xué)和臨床化學(xué)的問(wèn)題都可以用基于高分辨1HNMR的整體代謝物組學(xué)來(lái)加以闡述。從生物體液1HNMR譜圖可以得到大量的代謝物數(shù)據(jù)，并由此確定毒性的靶器官，推導(dǎo)出毒性的作用機(jī)制，損傷發(fā)生、發(fā)展和消失過(guò)程中的生物標(biāo)記物。代謝物組學(xué)還能提供生物體的代謝指紋圖譜（“代謝型”），因而可以應(yīng)用于藥物臨床研究的設(shè)計(jì)、疾病的終點(diǎn)、疾病發(fā)生機(jī)制等研究。但代謝物組學(xué)