色譜技術(shù)親和色譜.ppt

常見親合作用體系 1 離子強(qiáng)度 一般來(lái)說(shuō) 提高離子強(qiáng)度 親和作用減弱或完成破壞 2 PH 在適當(dāng)?shù)腜H下 親和結(jié)合作用較高 在其它PH下 親和作用減弱或完成破壞 3 抑制氫鍵形成的物質(zhì) 脲和鹽酸胍的存在可減弱親和作用4 溫度 提高溫度 靜電作用 氫鍵 配位鍵減弱 但是 疏水性相互作用增強(qiáng)5 液體離子 SCN I CIO4 的存在 疏水性相互作用減弱6 螯合劑 影響配位鍵 使親和作用消失 影響親和作用的因素 利用生物分子之間的專一性識(shí)別或特定的相互作用進(jìn)行分離的技術(shù)為親和分離技術(shù)親和配基是對(duì)生物分子具有專一性識(shí)別或特定的相互作用的物質(zhì) 5 找與底物專一可逆結(jié)合的配基 將配基通過(guò)共價(jià)鍵偶聯(lián)到基質(zhì) 配基與底物吸附 洗脫目標(biāo)物 6 親和純化技術(shù) 親和層析 Affinitychromatography 親和過(guò)濾 膜分離 親和分配 雙水相萃取 親和反膠團(tuán)萃取 反膠團(tuán)萃取 親和沉淀 沉淀 親和電泳 電泳 配基 生物特異性配基擬生物親和配基親和配基必須具備的條件 1 專一性識(shí)別或特異性作用必須是可逆的2 結(jié)合常數(shù)要適當(dāng)3 穩(wěn)定性好 可進(jìn)行化學(xué)改性 專一性和特異性決定著分離純化的產(chǎn)品純度相互作用的強(qiáng)弱決定著吸附和解吸的難易程度 親和配基的分類 單專一性的小分子配基基團(tuán)專一性的小分子親和配基專一性的大分子親和配基免疫親和配基基團(tuán)專一性的大分子親和配基 親和配基的選擇 組合化學(xué)肽庫(kù)選擇親和配基目標(biāo)肽 反義肽 組合合成 親和篩選 優(yōu)選序列噬菌體展示技術(shù)目標(biāo)蛋白 可結(jié)合噬菌體 擴(kuò)增 多輪篩選單克隆群體 氨基酸序列SELEX技術(shù)隨機(jī)序列 PCR擴(kuò)增 特異性結(jié)合 重復(fù)篩選 親和洗脫 目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫方法有特異性洗脫和非特異性洗脫 特異性洗脫劑含有與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物具有親和結(jié)合作用的小分子化合物 通過(guò)與親和配基或目標(biāo)產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 洗脫目標(biāo)產(chǎn)物 非特異性洗脫通過(guò)調(diào)節(jié)洗脫液的pH 離子強(qiáng)度 離子種類或溫度等降低目標(biāo)產(chǎn)物的親和吸附作用 親和色譜 親和層析 AffinityChromatography AC 是利用生物大分子具有對(duì)一類生物大分子特異識(shí)別和可逆結(jié)合的特性而建立起來(lái)的一種分離的色譜方法 也叫做生物親和或生物特異性親和色譜 是親和分離技術(shù)中最具優(yōu)勢(shì)的方法 親和層析的基本特點(diǎn) 1 純化過(guò)程簡(jiǎn)單 迅速 且分離效率高2 特別適用于分離純化一些含量低 穩(wěn)定性差的生物大分子3 純化倍數(shù)大 產(chǎn)物純度高4 必須針對(duì)某一分離對(duì)象制備專一的配基及尋求穩(wěn)定的層析條件5 價(jià)格相對(duì)較昂貴 6 在洗脫中 交聯(lián)在層析介質(zhì)上的配基可能脫落并進(jìn)入產(chǎn)品中 從而造成不良影響 如抗體 染料等配基 基質(zhì)的選擇理想的基質(zhì)應(yīng)符合下面的要求 1 極低的非特異性吸附 2 高度的親水性 3 較好的理化穩(wěn)定性 4 大量的化學(xué)基團(tuán)能被有效地活化 而且容易和配體結(jié)合 5 適當(dāng)?shù)亩嗫仔?一般親和吸附劑采用的基質(zhì)有纖維素 聚丙烯酰胺凝膠 交聯(lián)葡聚糖 瓊脂糖 交聯(lián)瓊脂糖 多孔玻璃珠等 親和色譜介質(zhì)的制備 配基的選擇 根據(jù)配體對(duì)待分離物質(zhì)的親和性的不同 可以將其分為兩類 特異性配體 specificligand 和通用性配體 generalligand 特異性配體一般是指只與單一或很少種類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體 如生物素和親和素 抗原和抗體 酶和它的抑制劑 激素 受體等 它們結(jié)合都具有很高的特異性 用這些物質(zhì)作為配體都屬于特異性配體 配體的特異性是保證親和層析高分辨率的重要因素 但尋找特異性配體一般是比較困難的 尤其對(duì)于一些性質(zhì)不很了解的生物大分子 要找到合適的特異性配體通常需要大量的實(shí)驗(yàn) 通用性配體一般是指特異性不是很強(qiáng) 能和某一類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體 如各種凝集素 lectine 可以結(jié)合各種糖蛋白 核酸可以結(jié)合RNA 結(jié)合RNA的蛋白質(zhì)等 通用性配體對(duì)生物大分子的專一性雖然不如特異性配體 但通過(guò)選擇合適的洗脫條件也可以得到很高的分辨率 而且這些配體還具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 偶聯(lián)率高 吸附容量高 易于洗脫 價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn) 所以在實(shí)驗(yàn)中得到了廣泛的應(yīng)用 20 配基的濃度 對(duì)親和勢(shì)比較低的時(shí)候 KL 10 4mol L 增加配基濃度有利于吸附 增加親和柱的長(zhǎng)度來(lái)提高吸附率 配基濃度太高使吸附力太強(qiáng) 洗脫困難 理想的配基濃度為1 10 mol L 21 配基偶聯(lián)的位置 配基固定化時(shí) 其不參與親和結(jié)合的部位與載體進(jìn)行偶聯(lián) 腺嘌呤N6 氨基接到載體上 對(duì)脫氫酶和甘油激酶有吸附力 磷酸基接到載體上 對(duì)甘油醛 3 磷酸脫氫酶有吸附力 22 配基分子的大小 選用大分子配基 小分子物質(zhì)作為配基 載體和配基間插入一個(gè) 手臂 以消除空間障礙 親和吸附介質(zhì)的配基 1 酶的抑制劑一些物質(zhì) 它們并不引起酶蛋白變性 但能使酶分子上的某些必需基團(tuán) 主要是指酶活性中心上的一些基團(tuán) 發(fā)生變化 因而引起酶活力下降 甚至喪失 致使酶反應(yīng)速度降低 能引起這類抑制作用的物質(zhì)稱為酶的抑制劑 inhibitor 在生物體內(nèi)蛋白酶的抑制劑可與蛋白酶的活性部位結(jié)合 抑制酶的活性 必要時(shí)保護(hù)生物組織不受蛋白酶的損害 酶的抑制劑在分子大小和形態(tài)上分布較廣 有天然的生物大分子 也有小分子化合物 2 抗體利用抗體為配基的親和層析又稱為免疫親和層析 Immunoaffinitychromatography 抗體與抗原之間具有高度特異性結(jié)合能力 結(jié)合常數(shù)一般為107 1012L mol 因此 利用免疫親和層析法 特別是以單抗為配基的免疫親和層析法是高度純化蛋白質(zhì)類生物大分子的有效手段 3 A蛋白A蛋白 proteinA 為分子量約42KD的蛋白質(zhì) 存在于黃色葡萄球菌 Staphylococcusaureus 的細(xì)胞壁中 占該細(xì)胞壁構(gòu)成成分約5 A蛋白在確定其為蛋白質(zhì)之前稱A抗原 與動(dòng)物免疫球蛋白G immunogloblinG IgG 具有很強(qiáng)的親和結(jié)合作用 結(jié)合部位IgG分子的Fc片斷 Y字型IgG分子的主干部分 A蛋白不與抗體 IgG 的抗原結(jié)合部位結(jié)合 而且任何抗體的Fc片斷的結(jié)構(gòu)都非常相似 因此A蛋白可作為各種抗體的親和配基 但不同抗體的結(jié)合常數(shù)有所不同 4 凝集素凝集素 lectin 是與糖特異性結(jié)合的蛋白質(zhì) 酶和抗體除外 的總稱 大部分凝集素為多聚體 含有兩個(gè)以上的糖結(jié)合部位 不同的凝集素與糖結(jié)合的特異性不同 例如 常用做親和配基的伴刀豆球蛋白A concanavalinA conA 與葡聚糖和甘露糖的親和結(jié)合作用較強(qiáng) 而麥芽糖凝集素 wheatgermagglutinin WGA 與N 乙酰葡糖胺 N acetyl glucosamine 的親和結(jié)合作用較強(qiáng) 5 輔酶和磷酸酰苷各種脫氫酶和激酶需要在輔酶 coenzyme 的存在下表現(xiàn)其生物催化活性 即脫氫酶和激酶與輔酶之間具有親和作用 輔酶主要有輔酶 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 nicotinamideadeninedinucleotide NAD 輔酶 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 NADphosophate NADP 和三磷酸腺苷 adenosinetriphosphate ATP 等 這些輔酶可用做脫氫酶和激酶的親和配基 此外 磷酸腺苷 adenosine5 monophosphate AMP 二磷酸腺苷 adenosine2 5 diphosphate ADP 的腺苷部分與上述輔酶的結(jié)構(gòu)類似 與脫氫酶和激酶同樣具有親和結(jié)合作用 可用做這些酶的親和配基 6 過(guò)渡金屬離子Cu2 Ni2 Zn2 Co2 等過(guò)渡金屬離子可與N S和O等供電原子 electrondonoratom 產(chǎn)生配位鍵 因此可與蛋白質(zhì)表面的組氨酸 His 的咪唑基 半胱氨酸 Cys 的巰基和色氨酸 Trp 的吲哚基發(fā)生親和結(jié)合作用 其中以His的咪唑基的結(jié)合作用最強(qiáng) 過(guò)渡金屬離子與咪唑基的結(jié)合強(qiáng)弱順序是Cu2 Ni2 Zn2 Co2 7 組氨酸在各種氨基酸中 組氨酸的性質(zhì)比較獨(dú)特 具有弱疏水性 咪唑環(huán)為弱電性 因此組氨酸可與蛋白質(zhì)發(fā)生親和結(jié)合作用 雖然這種親和作用的機(jī)理尚不十分清楚 但利用固定化組氨酸吸附蛋白質(zhì)以及吸附蛋白的洗脫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 靜電和疏水性相互作用均有可能參與親和結(jié)合 在鹽濃度較低和pH約等于目標(biāo)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的溶液中 固定化組氨酸的親和吸附作用最強(qiáng) 隨著鹽濃度增大 親和吸附作用降低 因此利用組氨酸為配基可親和分離等電點(diǎn)相差較大的蛋白質(zhì) 洗脫則可采用增大鹽濃度的梯度洗脫法 8 肝素肝素 heparin 是存在于哺乳動(dòng)物的肝 肺 腸等臟器中的酸性多糖類物質(zhì) 分子量一般為5 30KD 具有抗凝血作用 肝素與脂蛋白 脂肪酶 甾體受體 限制性核酸內(nèi)切酶 抗凝血酶 凝血蛋白質(zhì)等具有親和作用 可用作這些物質(zhì)的親和配基 肝素的親和結(jié)合作用在中性pH和低濃度鹽溶液中較強(qiáng) 隨著鹽濃度的增大結(jié)合作用降低 活化基質(zhì)的活化是指通過(guò)對(duì)基質(zhì)進(jìn)行一定的化學(xué)處理 使基質(zhì)表面上的一些化學(xué)基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)橐子诤吞囟ㄅ潴w結(jié)合的活性基團(tuán) 溴化氰活化法溴化氰活化法是最常用的活化方法之一 活化過(guò)程主要是生成亞胺碳酸活性基團(tuán) 它可以和伯氨 NH2 反應(yīng) 主要生成異脲衍生物 反應(yīng)如下 介質(zhì)活化與耦聯(lián) 活化耦聯(lián)過(guò)程 20ml 2mol L碳酸氫鈉 20g濕瓊脂糖 冰浴4 5min 攪拌過(guò)程中加入溴化氰 4 5 10min 過(guò)濾 冷蒸餾水和緩沖液洗滌 加入溶于緩沖液中的配基 攪拌2h 4 保存 這種方法的缺點(diǎn)是溴化氰活化法的基質(zhì)和配體偶聯(lián)后生成的異脲衍生物中氨基的pKa 10 4 所以通常會(huì)帶一定的正電荷 從而使基質(zhì)可能有陰離子離子交換作用 增大了非特異性吸附 影響親和層析的分辨率 另外溴化氰活化的基質(zhì)與配體結(jié)合不夠穩(wěn)定 尤其是當(dāng)與小配體結(jié)合時(shí) 可能會(huì)出現(xiàn)配體脫落現(xiàn)象 另外溴化氰有劇毒 易揮發(fā) 所以操作不便 環(huán)氧基活化法在熱的濃堿溶液中 多糖類化合物與環(huán)氧氯丙烷作用生成環(huán)氧化合物 在堿性條件下 其環(huán)氧化合物又能與氨基酸或蛋白質(zhì)上氨基偶聯(lián) 這種活化方法的優(yōu)點(diǎn)是活化后不引入電荷基團(tuán) 而且基質(zhì)與配體形成的N C O C和S C鍵都很穩(wěn)定 所以配體與基質(zhì)結(jié)合緊密 親和吸附劑使用壽命長(zhǎng) 而且便于在親和層析中使用較強(qiáng)烈的洗脫手段 另外這種處理方法沒有溴化氰的毒性 它的缺點(diǎn)是用環(huán)氧氯丙烷活化的基質(zhì)在與配體偶聯(lián)時(shí)需要堿性條件 pH為9 13 溫度為20 40 這樣的條件對(duì)于一些比較敏感的配體可能不適用 上面兩種方法是比較常用的方法 另外還有甲苯磺酰氯法 雙功能試劑法 親和配基耦聯(lián)密度測(cè)定 耦聯(lián)密度決定了介質(zhì)的吸附容量分光光度法量差法分析水解作用分析元素分析法 間臂分子 當(dāng)配基的分子量較小時(shí) 將其直接固定在載體上 會(huì)由于載體的空間位阻 配基與生物大分子不能發(fā)生有效的親和吸附作用 如果在配基與載體之間連接間隔臂 可以增大配基與載體之間的距離 使其與生物大分子發(fā)生有效的親和結(jié)合 加入間臂的長(zhǎng)度要恰當(dāng) 太短則效果不明顯 太長(zhǎng)則容易由疏水性非特異吸附造成彎曲 反而降低吸附效率 間臂的疏水性也需要考慮 應(yīng)盡量減小對(duì)配基的影響 如間臂和配基疏水性較強(qiáng) 則效果不明顯 常見的親和色譜 核苷酸及輔酶親和色譜固定化金屬離子親和色譜染料親和色譜免疫親和色譜基團(tuán)專一性大分子親和色譜 核苷酸及輔酶親和色譜 指將核苷酸 或輔酶 作為親和配基固定在色譜介質(zhì)上進(jìn)行親和色譜的技術(shù) 主要利用核苷酸特別是輔酶因子和蛋白質(zhì)之間的專一性識(shí)別達(dá)到分離純化目的 介質(zhì)制備 碳二亞胺直接法偶聯(lián)溴化氫活化瓊脂糖 連接氨基己酸 加入核苷酸 溶液中保存 洗滌 偶聯(lián)間接偶聯(lián)法間臂分子和核苷酸 活化的介質(zhì) 吸附和解吸 選擇合適的緩沖液條件下吸附一般采用輔酶或鹽溶液進(jìn)行梯度洗脫 固定化金屬離子親和色譜 蛋白質(zhì)上的氨基酸殘基 如組氨酸的咪唑基 半胱氨酸的巰基和色氨酸的吲哚基 有利于蛋白質(zhì)與固定化金屬離子結(jié)合 從而達(dá)到分離的目的 金屬離子如鋅和銅 46 將活化的介質(zhì)與金屬螯合劑偶聯(lián) 再用金屬離子溶液處理制成金屬螯合親和層析柱 金屬螯合劑 亞氨二醋酸 氨基水楊酸 8 羥基喹啉 羧甲基氨基酸等 親和作用機(jī)理 靜電作用配位鍵結(jié)合共價(jià)鍵生產(chǎn) 鍵 吸附 采用50mmol L的金屬鹽溶液通過(guò)色譜柱 直至色譜介質(zhì)吸附飽和 平衡緩沖溶液洗去未螯合的金屬離子加入適宜濃度的NaCl和選擇合適pH值有利于減少非特異性吸附 解吸 吸附蛋白質(zhì)解吸的方法 改變pH值競(jìng)爭(zhēng)性洗脫采用50 100mmol L的EDTA洗脫 可將蛋白質(zhì)和金屬離子解吸 洗滌 重新上柱平衡 固定所需的金屬離子 pH與氯化銨濃度的影響 固定化親和離子色譜的應(yīng)用 基因修飾蛋白質(zhì)的純化遺傳修飾 具親和尾蛋白 色譜分離 親和尾切除 色譜分離 酶切位點(diǎn) 親和尾大小 52 染料親和色譜 有機(jī)染料具有類似于NAD 的結(jié)構(gòu) 需核苷酸類物質(zhì)為輔酶的酶 對(duì)染料具有一定親和力 染料共價(jià)偶聯(lián)到瓊脂糖載體上 能制得親和層析柱 染料親和層析已成功的分離純化了多種酶 染料親和色譜介質(zhì)的制備 配基性質(zhì) 染料結(jié)構(gòu)和染料取代度是制備過(guò)程中需要考慮的主要因素 以下途徑可以實(shí)現(xiàn)制備 采用瓊脂糖凝膠 染料連接在 OH上 該過(guò)程可在一定條件下直接完成 染料也可通過(guò)活性基團(tuán)和基質(zhì)偶聯(lián) 該方法可引入高密度的染料 吸附蛋白質(zhì)量增多 選擇親和作用力較小的染料有利于解吸 吸附與解吸 采用磷酸鹽緩沖液 在pH6 0 7 0條件下吸附常用解吸方法 增加鹽濃度改變pH值采用水溶性高聚物親和洗脫最后對(duì)雜蛋白進(jìn)行變性處理 洗滌 緩沖液平衡再生介質(zhì) 免疫親和色譜 抗原和抗體的作用具有高度的專一性 并且它們的結(jié)合親和力極強(qiáng) 因此用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒖乖蚩贵w結(jié)合到吸附劑上 便可有效地分離和純化免疫物質(zhì) 特點(diǎn) 分離效率高 成本高 而且蛋白質(zhì)親和配基不穩(wěn)定 容易降解 免疫親和色譜過(guò)程 目標(biāo)蛋白質(zhì) 抗體制備 上樣與洗脫 介質(zhì)制備 單抗制備復(fù)雜 成本高 但