【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）甘藍型與白菜型油菜無花瓣性狀的遺傳研究-作物遺傳育種碩士論文

1 密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學院 學位論文 甘藍型與白菜型油菜無花瓣性狀的遺傳研究 on 2 on I 摘要 油菜是全世界廣泛種植的重要油料作物。長期以來，提高油菜的產(chǎn)量和增強油菜的抗病性一直都是油菜科學家研究的主要課題。無花瓣油菜特異種質在增強油菜的抗病性和提高油菜產(chǎn)量方面具有潛在的重要利用價值。研究闡明油菜花瓣缺失的遺傳規(guī)律和分子機理，獲得具有較高實用價值的與無花瓣性狀相關的分子標記，對育種中有效利用無花瓣特異種質資源具有重要的指導和促進作用；同時對油菜花瓣缺失遺傳機制的研究還對深入理解植物花器官發(fā)育過程具有重要意 義。 本研究以已發(fā)現(xiàn)的兩種不同類型油菜無花瓣特異種質資源（白菜型無花瓣突變體 藍型無花瓣突變體 實驗材料，開展了兩種突變體花器官形態(tài)解剖特征比較、無花瓣性狀的遺傳分析、花瓣缺失基因等位性和互作、無花瓣性狀的分子標記研究。主要研究結果如下： 1. 兩種突變體材料形態(tài)解剖特征比較分析發(fā)現(xiàn)，兩種材料的突變類型存在本質差異。甘藍型油菜無花瓣突變體 要表現(xiàn)第二輪花瓣缺失；新型白菜型油菜無花瓣突變體 現(xiàn)花瓣轉變?yōu)樾廴锖腿~片卷曲。 2. 對甘藍型無花瓣油菜 三種正?；ò旮仕{型油菜 雜交后代的遺傳分析結果表明：無花瓣性狀受兩對主效隱性基因和一對隱性修飾基因控制，不存在母體細胞質效應。 3. 對白菜型無花瓣油菜 兩種正?；ò臧撞诵陀筒穗s交后代的遺傳分析結果表明：無花瓣性狀受一對隱性基因控制，不存在母體細胞質效應。 4. 通過兩種突變體雜交，對兩種突變體的花瓣缺失機制進行了基因等位性和互作研究。在 瓣雄蕊化雙突變類型的植株。兩種突變體材料的花瓣缺失基因呈現(xiàn)出復雜的遺傳互作關系。 5. 兩種突變體材料雜交，在后代分離群體中首次發(fā)現(xiàn)了雄性不育 植株。群體 （ （ 、 （ 、 ( 中出現(xiàn)育性分離 , 而群體 (、(中卻未出現(xiàn)育性分離。 6. 利用 中雙 4 號雜交構建的 體，對甘藍型油菜的無花瓣性狀進行了分子標記。在 中雙 4 號兩親本間篩選 20 對 物和 170 對 物，進一步通過 得了與 花瓣性狀連鎖的 1 個 記 600 1 個 記 150標記與完全花瓣性狀之間的遺傳距離分別為 5.0 7. 利用含 93 個 株的分離群體 （中雙 4 號 （中雙 4 號 ，構建了一張含 213 個 記、 56 個 記和 1 個形態(tài)標記的甘藍型油菜遺傳圖譜，這些標記被分配到 17 個連鎖群、兩個三聯(lián)體和 4 個連鎖對中，遺傳圖距總長 標記間平均距離為 于花瓣度的完全花瓣性狀（ 為形態(tài)標記定位在第 4 連鎖群 (。 關鍵詞：甘藍型油菜，白菜型油菜，無花瓣突變體，無花瓣性狀，遺傳分析，分子標記，遺傳圖譜 is an in In of of of on of to of of of NA of in on a of of in In an an as to of of of of as 1. of of 2. on by a t in 3. on by t in 4. By of 1 of 5. in It of in （ （ , （ (. it t of in ( 6. 2 to 20 70 to 6003247_15（ 150to be to 7. A a 3 F2 It 13 6 a 7 a on 錄 摘 要 2 一章 文獻綜述 1 菜無花瓣突變體的來源及其利用價值 1 菜無花瓣突變體的來源 1 菜無花瓣突變體的利用價值 2 菜無花瓣性狀的遺傳 3 對隱性基因 3 對隱性基因 3 對隱性基因 3 對隱性基因 3 胞質十 2 對核內隱性基因 4 對主基因十 4 對修飾基因 4 對顯性基因 4 子標記在油菜遺傳改良中的應用 4 見的分子標記 4 菜分子標記遺傳圖譜的構建和重要基因的定位 5 菜無花瓣性狀的分子標記和基因定位 8 在的問題 8 研究的目的意義 9 第二章 兩種無花瓣突變體花器官形態(tài)解剖特征 10 言 10 料和方法 10 驗材料 10 驗方法 10 果與分析 10 種油菜無花瓣突變體植株表現(xiàn) 10 種油菜花瓣缺失突變體的花器官形態(tài)比較 11 種油菜花瓣缺失突變體的花瓣類型 比例比較 11 論 12 第三章 兩種不同無花瓣油菜無花瓣性狀的遺傳分析 13 言 13 料和方法 13 驗材料 13 驗方法 13 果與分析 16 藍型油菜無花瓣性狀的遺傳分析 16 菜型油菜無花瓣性狀的遺傳分析 21 種不同無花瓣油菜雜交后代遺傳分析 23 論 25 V 瓣度 （ 25 藍型油菜無花瓣性狀的遺傳 25 菜型油菜無花瓣性狀的遺傳 25 種無花瓣油菜雜交后代的遺傳 26 第四章 甘藍型油菜無花瓣性狀分子標記與圖譜定位 27 言 27 料和方法 27 料 27 體的構建 27 因組 取及樣品集團的構建 27 析 28 析 30 子標記數(shù)據(jù)、形態(tài)性狀及基因型記載 31 鎖圖構建 31 果與分析 32 果與分析 32 果與分析 32 完全花瓣性狀連鎖的分子標記 35 子標記連鎖圖的構建 35 論 38 第五章 白菜型油菜無花瓣性狀分子標記 39 言 39 料和方法 40 料 40 因組 取及樣品集團的構建 40 析 40 析 40 果與分析 41 物篩選 41 果與分析 41 論 42 第六章 甘藍型無花瓣油菜的應用 43 言 43 料和方法 43 料 43 驗方法 43 果與分析 44 論 44 彩圖版 45 參考文獻 47 致謝 55 作者簡歷 56 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 1 第一章 文獻綜述 油菜是我國乃至全世界廣泛種植的重要油料作物。據(jù)統(tǒng)計，目前全世界油菜（包括甘藍型、白菜型、芥菜型油菜 等，其中以甘藍型油菜分布最廣，面積最大）種植面積為 萬公頃，總產(chǎn) 萬噸，我國種植面積為 萬公頃，總產(chǎn) 萬噸，兩項各約占 1/3（資料來源： 004） 。 由核盤菌 (致的菌核病是世界范圍內的一種重要病害，在我國尤為嚴重，列為油菜第一大病害。菌核病在我國每年的發(fā)病面積在 7000 萬畝以上，直接經(jīng)濟損失在30 億元以上（劉勝毅， 1999）。菌核病的嚴重發(fā)生對我國油料的可持續(xù)發(fā)展構成了 威脅 (陳碧云等， 2001)。由于核盤菌寄主范圍極廣，至今仍未發(fā)現(xiàn)對這一病原菌免疫的抗源材料。對這一病害的防治主要依賴化學防治，這種方式不僅成本高，而且污染環(huán)境（傅壽仲等， 1995）。因此，各國都在積極尋找防御菌核病的新途徑。 花瓣是傳播油菜病害 (如菌核病等 )的重要媒介，它不僅是病原菌的初次侵染源，為病原菌的生長提供重要的能源，而且隨著花瓣飄落在葉片上，形成再次侵染，為病害的擴展和蔓延提供條件（ 1958； 李強生 等， 2000）。無花瓣油菜的形態(tài)避病作用十分明顯。 （ 1981）報 道，油菜花期花瓣能反射和吸收光合有效輻射的 60。 1984）認為，在初花期和盛花期僅有 24和 7的光合有效輻射能到達距地 50植株基部。無花瓣油菜因無需發(fā)育形成花瓣，從而可以節(jié)省大量能量，如果這些節(jié)省的能量全部流向籽粒，則理論上可增產(chǎn) 呂忠進， 1989）。無花瓣油菜可以提高光能利用率，從而具有增加油菜產(chǎn)量的潛力。 提高油菜的產(chǎn)量和增強油菜的抗病性是保障油菜可持續(xù)發(fā)展的重要途徑，提高油菜的產(chǎn)量和增強油菜的抗病性一直都是油菜科學家研究的主要課題。提高油菜的產(chǎn)量和增強油菜的抗病性 有各種不同的途徑 ,利用無花瓣性狀有可能提高油菜的產(chǎn)量和增強油菜的抗病性。 菜無花瓣突變體的來源及其利用價值 菜無花瓣突變體的來源 無花瓣油菜一般是從自然突變和人工雜交或誘變后代中獲得，其產(chǎn)生途徑主要有 4 種：自然突變。 1940）、 1977）、伍曉明等（ 2001）在白菜型油菜中， 1985）在埃塞俄比亞芥中，趙云等（ 2000）在甘藍型油菜中均發(fā)現(xiàn)了無花瓣自然突變體。種間雜交。劉厚利（ 1985）、傅壽仲等（ 1995）在甘藍型油菜白菜型油菜雜交后 代中 ,戚存扣等（ 1989）在甘藍型油菜埃塞俄比亞芥雜交后代中，蔡明等（ 1991）、 （ 1996）在埃塞俄比亞芥甘藍型油菜雜交及回交后代中均發(fā)現(xiàn)了甘藍型無花瓣油菜突變體； （ 1999）在 1989）在人工合成甘藍型油菜后代中發(fā)現(xiàn)了無花瓣材料。品種間雜交。 （ 1999）在甘藍型油菜品種 (3/018 5中獲得了無花瓣突變體，但雜交親本之一 “018”來源于 ( B 國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 2 B 間雜交后代；譚小力等（ 1998； 1999）則在 2 個甘藍型油菜雜交后代中獲得了無花瓣材料。理化誘變。 1990）、 （ 1994）利用 基磺酸乙酯 )誘變，分別在甘藍型油菜和埃塞俄比亞芥中獲得了無花瓣突變體（ 蔣立希 等， 1999； 羅 鵬 ， 1995）。 從無花瓣突變體的來源看，白菜型油菜比較單一，主要是自然突變，這也表明白菜型油菜中普遍存在著花瓣性狀的變異。但是白菜型無花瓣材料大多不夠穩(wěn)定，一般開花早期為無花瓣，中后期產(chǎn)生花瓣，并逐漸恢復正 常。甘藍型油菜主要通過種間雜交獲得無花瓣材料，且研究較多的是甘藍型油菜埃塞俄比亞芥以及甘藍型油菜白菜型油菜。從獲得無花瓣突變體的數(shù)量看，以甘藍型油菜中無花瓣突變體較多，且部分已用于育種中，芥菜型油菜和埃塞俄比亞芥中無花瓣突變體相對較少。 菜無花瓣突變體的利用價值 首先，無花瓣油菜的形態(tài)避病作用十分明顯。 1995）利用掃描電鏡觀察證明，油菜菌核病菌子囊孢子只有落在花瓣上才能萌發(fā)形成菌絲，并侵染葉片和莖稈，如果子囊孢子直接落在葉片上則無法萌發(fā)生長。陳玉卿等（ 1991）觀察油菜花 器帶菌率發(fā)現(xiàn)，其它花器官如花萼和雄蕊的帶菌率也在 90以上，無花瓣油菜因缺少花瓣，花器官的總帶菌率比常規(guī)品種平均下降 從而大大降低了病害的發(fā)生機率。傅壽仲等（ 1996）報道，無花瓣品種發(fā)病率明顯低于有花瓣品種，田間發(fā)病率下降 1999）調查表明，無花瓣品種菌核病發(fā)病率和嚴重度分別為 而對照品種 “ 其次，無花瓣油菜可以提高光能利用率，具有增加油菜產(chǎn)量的潛力。油菜花瓣的形 成、伸展和呼吸都需要消耗大量的光合產(chǎn)物。呂忠進分析有、無花瓣油菜花器官各組分的差異，發(fā)現(xiàn)有花瓣品種每朵單花花瓣發(fā)育所需的干物質為 花器官總重的 無花瓣品種因去除了花瓣，從而節(jié)省了花瓣發(fā)育所需的能量，這些能量主要用于雌蕊與花萼的發(fā)育，使雌蕊占花器官總重的比例從有花瓣品種的 高到 花萼所占比例也從 加到 而雄蕊及花柄所占比例則略有下降（呂忠進， 1989）。譚小力等（ 1998； 1999）亦報道，有、無花瓣近等基因系間的花蕾重量變化不大，但無花瓣系長度增加 花萼、雌蕊和雄蕊重量均顯著增加，有利于傳粉和角果發(fā)育，為獲得高產(chǎn)打下基礎?；ㄆ谡怯筒松L最旺盛的時期，無花瓣油菜因無需發(fā)育形成花瓣，從而可以節(jié)省大量能量，如果這些節(jié)省的能量全部流向籽粒，則理論上可增產(chǎn) 呂忠進， 1989）。 1981）報道，油菜花期花瓣能反射和吸收光合有效輻射的 60； 1984）認為，在初花期和盛花期僅有 24和 7的光合有效輻射能到達距地 50此，選育小花瓣或無花瓣品種，能使光分布更為有效，并實現(xiàn)油菜高產(chǎn)（ 1987）。 1991）比較有、無花瓣油菜在受光態(tài)勢上的差異，發(fā)現(xiàn)盛花期花器官對入射光的反射，無花瓣品種僅為有花瓣品種的 50，而到達植株基部光合層的光合有效輻射量，無花瓣油菜比有花瓣品種提高 30。 1995； 1996）發(fā)現(xiàn)在盛花期，能穿透花冠層的光合有效輻射，無花瓣油菜要比有花瓣材料高 70，因而能夠延長基部葉片的功能期，使無花瓣品種在花期積累的干物質比有花瓣品種多 41，從而增加每角粒數(shù)和千粒重；而有花瓣品種因同化產(chǎn)物的不足，導致 60的角果難以正常成熟。傅壽 仲等（ 1996）比較有、無花瓣近等基因系差中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 3 異，認為無花瓣性狀有利于延長基部葉片功能期，減少基部分枝的退化，形成分枝點低、分枝數(shù)多、角果數(shù)多的較大株型，從而為獲得高產(chǎn)打下基礎。 菜無花瓣性狀的遺傳 研究者對各自獲得的無花瓣油菜的遺傳研究結果存在很大差異?？傮w上講，白菜型油菜無花瓣性狀主要受核內 1 對隱性基因控制（ 1961； 1977）；甘藍型油菜無花瓣性狀的遺傳則較為復雜，除趙云等所獲得的 花瓣材料外，均表現(xiàn)為隱性遺傳，一般由 2隱性核基因控制，可能存在細胞質效應，有的 易受環(huán)境因素的影響（ 1983； et 995；傅壽仲等， 1990， 1993， 1995；呂忠進等， 1991；蔣立希等， 1999， 1998， 2001；趙云等， 2000）。無花瓣性狀的遺傳主要分為以下 7 類。 對隱性基因 1961）、 1977）對白菜型油菜無花瓣突變體的遺傳研究表明，有、無花瓣雜交符合 1對隱性基因控制的遺傳模式。 對隱性基因 1983）報道，無瓣對有瓣為完全隱 性， 0以正常型占多數(shù)，在 60以上， 25植株的花瓣率為 10 僅有少量植株為無花瓣； 無花瓣、中間型與正常型的比例為 1： 2： 1，因而該無花瓣性狀由 2對隱性基因控制。 1995）所獲得的 “花瓣材料 (雄蕊狀花瓣突變體 )，受 2個位點的基因 (制，分別位于甘藍型油菜的 染色體組。 1991）研究芥菜型油菜無花瓣性狀的遺傳，結果同樣符合 2對隱性基因的遺傳模式。 對隱性基因 1995）獲得了另一個無花瓣突變體 “該材料 90的變異由 3個位點 些位點具有加性和上位性互作效應，其中如 制花的形態(tài)，如 制極端表型的表達， 對隱性基因 傅壽仲等（ 1990； 1993； 1995）、呂忠進等（ 1991）研究無花瓣材料 “遺傳后認為，無花瓣材料與大花瓣品種雜交 ，有、無花瓣分離比例 55： 1， 5： 1；與小花瓣材料雜交， 1的分離比例分別為 15： 1和 3： 1，因此該無花瓣材料由 4對隱性基因控制。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 4 胞質十 2對核內隱性基因 蔣立希等（ 1999； 1998； 2001）對無花瓣材料 “遺傳研究結果表明，該性狀由細胞質及核內 2對隱性基因共同控制，只有質核組成為 ，才表現(xiàn)為完全無花瓣。另外，該材料的無花瓣性狀一定程度上還受環(huán)境條件的影響，主要受植株體內生長素和細胞分裂素的影響。 對主 基因十 4對修飾基因 1995）獲得的完全無花瓣材料 “ 6個無花瓣基因位點控制 (其中 性狀具有加性效應；其余為修飾基因位點，受 2個主效基因位點的上位性抑制。 對顯性基因 趙云等（ 2000）報道， “花瓣材料與有花瓣品種雜交 ： 1， 表現(xiàn)為 1： 1的分離比 例，因此， 對顯性基因控制的遺傳模式。 子標記在油菜遺傳改良中的應用 見的分子標記 從孟德爾的豌豆雜交試驗開始，人們就開始有意識地挖掘和利用各種各樣的遺傳標記進行研究，總的來說遺傳標記可以歸納為 4 類，即形態(tài)標記、細胞學標記、生化標記和分子標記。分子標記是隨著分子生物學的發(fā)展而出現(xiàn)的，它直接從分子水平反映出核苷酸序列的任何差異。與其它標記 系統(tǒng) 相比，分子標記具有以下優(yōu)點： 1）不受發(fā)育階段的影響，可以對個體、組織、器官乃至細胞作檢測； 2）不受環(huán)境因素以及基因是否 表達的影響； 2）數(shù)量非常豐富，幾乎無限； 3）有些標記是共顯性標記，對選擇隱性基因控制的性狀十分有利； 4）遺傳穩(wěn)定，表達中性，無表型效應。這些優(yōu)點使分子標記在物種起源與進化、生物多樣性、遺傳圖譜構建、基因定位 以及 分子標記輔助選擇等方面得到了廣泛應用。目前已經(jīng)發(fā)展出十幾種標記技術，比較常用的有 及 ，這里僅對與本課題研究有密切關系的 記和 記加以綜述。 擴增片段長度多態(tài)性 ( 1992 年由荷蘭科學家 展起來的一種新的檢測 態(tài)性的方法。其基本原理是 運用 術 對基因組 限制性 酶切片段進行選擇性擴增 后加以電泳檢測 。擴增片段的數(shù)目 主要 取決于 所 采用的 限制性 內切酶種類、選擇堿性基數(shù)目 和 所研究基因組的復雜程度。通過調整引物選擇性堿基的數(shù)目 ， 可獲得豐富的多態(tài)性 (et 1995)。理論上， 析可以采用的限制性內切酶種類和選擇性堿基的數(shù)目有很多，因此 產(chǎn)生的標記數(shù)目 幾乎 是無限的。利用中國農(nóng)