【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）飼料中二惡英測定的化學(xué)激活熒光基因表達系統(tǒng)動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)碩士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 飼料中二惡英測定的 化學(xué)激活熒光基因表達系統(tǒng) n 1 I 摘 要 二惡英類化學(xué)物質(zhì)在環(huán)境中廣泛存在，不易降解，毒性高且易于生物富集 /生物放大，能對環(huán)境、人和動物造成嚴重影響。 1999 年比利時肉雞二惡英污染事件后， 起國際社會的廣泛關(guān)注。 二 惡英分析是現(xiàn)代分析的一個重點和難點。目前二惡英類物質(zhì)主要的檢測方法有化學(xué)法（色譜法）、免疫法和生物法三大類。色譜法是目前國際通用的標準方法。但到目前為止，還沒有一種能高通量、低成本進行二惡英檢測的方法。 本研究的目的是利用二惡英類化學(xué)物質(zhì)的毒理機制，建立一種能滿足飼料及畜產(chǎn)品中二惡英監(jiān)測的高通量、低成本需要的方法。本研究構(gòu)建了一個受二惡英應(yīng)答元件（ 控的，以增強型綠色熒光蛋白（ 為報告基因的表達質(zhì)粒，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠肝細胞瘤 選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。二惡英類化學(xué)物質(zhì)與該穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株 接觸可誘導(dǎo) 劑量依賴性的表達，通過檢測 量即可反映二惡英類化學(xué)物質(zhì)的量。 本研究內(nèi)容分兩部分： 一將載體質(zhì)粒 動子去除后，用 接酶分步連接上 動子和 段，構(gòu)成以 報告基因的，對二惡英起特異性應(yīng)答的表達質(zhì)粒 組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染大鼠肝細胞瘤 導(dǎo)綠色熒光蛋白表達，以 導(dǎo)作陰性對照，結(jié)果表明 導(dǎo)綠色熒光蛋白表達為 導(dǎo)的表達量高出約 10 倍左右，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 二將重組質(zhì)粒 定轉(zhuǎn)染大鼠肝細胞瘤 過 4 周培養(yǎng)篩選，得到 1 株具有強誘導(dǎo)活性的重組細胞系 后對該細胞株的檢測條件進行了優(yōu)化。 將 胞每孔約 150， 000 個加入黑色壁、透明底 96 孔培養(yǎng)板（ 603）中， 37培養(yǎng)， 33與 測物）共孵育進行熒光檢測。制定了 導(dǎo) 標準曲線，確定該方法的最低檢測限為 1為 5大誘導(dǎo)劑量為 500性范圍為 1 500 實驗還對一些可能對二惡英檢測產(chǎn)生干擾的 物質(zhì)進行了研究。結(jié)果表明， 激素及 此在樣品處理時應(yīng)除去這些物質(zhì)。 該分析方法和以熒光素酶基因為報告基因的細胞分析方法比較，不但具有相同的靈敏度和特異性，而且更簡單、快速、便宜，還可以實時檢測，從而可滿足飼料及畜產(chǎn)品二惡英監(jiān)測的高通量、低成本需要。 關(guān)鍵詞 ：二惡英，增強型綠色熒光蛋白，報告基因， 環(huán)芳香烴受體，熒光檢測 he to in in 999. C/is it in of is of of of to a be as of in We a 4 of in in a so of in be by be 1. RE RE MV by RE by 4of 0 4in nM 4h). of to to we in 967 3 to in a 1 500 to it is be so a in 錄 第一章 引言 . 1 惡英的結(jié)構(gòu)、理化特性及來源 . 1 二惡英的結(jié)構(gòu)及理化特性 . 1 二惡英的來源及污染 . 3 惡英的毒性及毒性機制 . 4 二惡英的毒性 . 4 惡英毒性及濃度的表示單位 . 7 惡英毒性作用機制 . 8 惡英在食品 /飼料中污染 . 10 惡英食品 /飼料污染事件 . 10 料及食品中二惡英指導(dǎo)原則 . 10 惡英生物檢測方法 . 11 述 . 11 告基因法 . 12 疫分析法 . 13 外 合實驗 . 14 試驗研究目的意義 . 15 究目的 . 15 究意義 . 15 第二章 含綠色熒光蛋白報告基因質(zhì)粒構(gòu)建 . 16 驗設(shè)計 . 16 驗材料與方法 . 18 驗材料與試劑 . 18 驗方法 . 19 果與討論 . 24 動子的制備 . 24 動子和質(zhì)粒載體大片斷連接 . 25 V 段的制備 . 27 段重組質(zhì)粒的制備 . 28 第三章 重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及檢測方法學(xué)研究 . 30 驗設(shè)計 . 30 驗材料與方法 . 30 驗材料與試劑 . 30 胞培養(yǎng)及細胞瞬時、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 . 31 果與討論 . 33 時轉(zhuǎn)染細胞株 導(dǎo)熒光表達 . 33 定轉(zhuǎn)染細胞株 導(dǎo)熒光表達 . 34 定篩選細胞株用于 析的特性及分析條件優(yōu)化 . 35 結(jié) . 41 第四章 全文結(jié)論 . 44 研究結(jié)論 . 44 待進一步研究和解決的問題 . 44 參考文獻 . 46 致謝 . 52 作者簡歷 . 53 文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 香烴羥化酶 香烴受體 hR 香烴受體核轉(zhuǎn) 運蛋白 速溶劑萃取 學(xué)激活熒光基因表達 學(xué)激活熒光素酶基因表達 惡英應(yīng)答元件 聯(lián)免疫吸附試驗 氧基 脫乙基酶 盟 as 相色譜 效 譜 環(huán)芳香烴 氯聯(lián)苯 氯代二苯并 二惡英 氯代二苯并呋喃 久性有機污染物 ,3,7,8， 3， 7， 8對 性當量因子 性當量 國環(huán)境保護總署 界衛(wèi)生組織 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 1 第一章 引言 二惡英（ 一類持久存在的環(huán)境污染物，毒性作用劑量極低且易于生物富集(1980)。二惡英是世界衛(wèi)生組織（ 出的 12 類最嚴重持久性有機污染物（ 一 ,也是類致癌物，其對環(huán)境、動物和人 的危害是近二十年來世界各國普遍關(guān)心的問題。 有史以來，人類活動一直影響著自然環(huán)境和野生動物。工業(yè)革命前，人類活動產(chǎn)生的影響主要是地區(qū)性影響，但隨著工業(yè)活動急劇發(fā)展，人類活動在全球范圍導(dǎo)致嚴重環(huán)境問題。 of s in 出了一些工業(yè)發(fā)展帶來的負面后果，如水和大氣污染、酸雨、臭氧層減少以及全球變暖等。我們過度使用自然資 源，這將導(dǎo)致嚴重后果。伐樹可毀壞森林，但在保護樹木時使用殺蟲劑也可能引起深遠影響：不僅影響森林，而且影響整個世界，如上世紀 60 年代廣泛使用的有機氯殺蟲劑 1,1,1 但殺死人們想殺死的有害生物，而且也影響到許多其他生物，如一些食肉鳥類因為攝食了含 蟲子，繁殖能力大受影響（ 1997）。 1958 年， 到一封抱怨野生動物生存權(quán)力被剝奪的信。她因此寫出一本名叫寂靜的春天 (的書，書中講由于環(huán)境中人為物質(zhì)的影響，將來不再有鳥類歌唱。寂靜的春天對人們的態(tài)度產(chǎn)生了很大影響，并在現(xiàn)代環(huán)境保護論的誕生中扮演一個主要角色。如今，人類越來越關(guān)注環(huán)境，采取了許多環(huán)境策略，如控制某些殺蟲劑的使用量，控制廢氣排放，為環(huán)境有害物質(zhì)制定指導(dǎo)限量。聯(lián)合國環(huán)境署（ 定了三個公約（巴塞爾、鹿特丹和斯德哥爾摩公約），為環(huán)境有害物質(zhì)的有效管理提供了一個國際框架。 2001 年 5 月 23 日在瑞典斯德哥爾摩，包括中國在內(nèi)的 91 國家投贊成票通過斯德哥爾摩公約，該公約旨在控制和治理以二惡英為代表的 12 種在環(huán)境中具有高殘留性、高生物濃縮性和高生物毒性的物質(zhì)，即持續(xù)性有機污染物（ 這 12 種化學(xué)物質(zhì)中，二惡英類物質(zhì)（二惡英、呋喃、多氯聯(lián)苯）和 六六）是農(nóng)藥和多氯聯(lián)苯生產(chǎn)中的伴生物，其他 8 種為人工合成的含氯農(nóng)藥和工業(yè)化合物，其生產(chǎn)都能產(chǎn)生二惡英，所以該公約的一大重點就是遏制和消除二惡英類物質(zhì)。 盡管已經(jīng)采取措施控制有害物 質(zhì)排放，但 將在環(huán)境中長期存在。因此在保護環(huán)境及保障人和動物健康時，首先要具備有害物質(zhì)的相關(guān)知識，如它們的產(chǎn)生、命運、毒理作用，以及在生態(tài)系統(tǒng)中的生物作用過程。在此對二惡英類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、環(huán)境和食品 /飼料中的暴露水平、在各國的立法以及檢測方法作一綜述。 惡英的結(jié)構(gòu)、理化特性及來源 二惡英的結(jié)構(gòu)及理化特性 二惡英（ 一類具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物學(xué)特性的多氯代三環(huán)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 2 芳香族化合物的總稱，包括多氯代二苯并 二惡英（ 多氯代二苯并呋喃（ 類（ 1984）。所有二惡英因為具有芳香環(huán)，都形成一個共平面結(jié)構(gòu)。因其分子中氯原子有不同取代位置和數(shù)目，可生成 75種 135 種 惡英名稱中的數(shù)字代表氫原子被氯原子取代的位置，中文數(shù)字（希臘字母代表氯原子個數(shù)）。毒性較高的二惡英物質(zhì)側(cè)位往往都被氯取代，即 2， 3， 7， 8 位。二惡英類似物包括 209 種共平面多氯聯(lián)苯（ 以 及多溴代二苯并呋喃（ 多溴聯(lián)苯（ 其混合鹵代化合物。表 1出了 系物及異構(gòu)體數(shù)目。二惡英及其類似物總稱為二惡英類化學(xué)物質(zhì)（ 從生物學(xué)效應(yīng)上講，即是那些能與芳香烴受體（ 合，并導(dǎo)致機體生物化學(xué)變化的一大類物質(zhì) (1996)。 2， 3， 7， 8對 2,3,7,82,3,7,8研究最多，也是最典型和毒性最強的二惡英物質(zhì)（ 1982）。 二惡英以 2 個或 1 個氧鍵連結(jié) 2 個苯環(huán)構(gòu)成三環(huán)化合物。 構(gòu)式如圖 1 圖 1）和 構(gòu)式 -1 表 1 同系物及異構(gòu)體 系物（縮寫） 異構(gòu)體數(shù)量 M) 3 2 4 D) 12 10 16 24 14 28 T) 42 22 38 46 14 28 42 10 16 24 2 4 O) 12 1 1 3 1 總計 209 75 135 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 3 二惡英的分子量在 300 左右，物理性質(zhì)相近，如果是純物質(zhì)，常溫下應(yīng)為固態(tài)晶體。二惡英具有相對穩(wěn)定的芳香環(huán)，無色無味，親脂性極強。低揮發(fā)性，蒸汽壓極低，除了在氣溶膠顆粒有吸收外，在大氣中分布極少，而在地面可以持續(xù)存在。無極性，難溶于水，在強酸、強堿及氧化劑中仍能穩(wěn)定存在，可溶于大部分有機溶劑。自然界中的微生物降解、水解及光解作用對其結(jié)構(gòu)影響很小，在高溫 下仍很穩(wěn)定， 750以上才會分解，要大量破壞則需超過 1000（ 1993；1990）。二惡英在土壤中的半衰期為 12 年。氣態(tài)中的二惡英在空氣中光化學(xué)分解的半衰期為 惡英在體內(nèi)穩(wěn)定，半衰期達 。表 1列為 s 典型理化性質(zhì)。 2， 3， 7， 8分子量為 色結(jié)晶，熔點 302 305， 500開始分解， 800時 21s 完全分解（羅少初， 2000）。 表 1s 典型理化性質(zhì) s 同系物蒸汽壓 (25 ) 解度 (mg l1, 25 ) s 07 04 03 010 04 04 011 06 03 011 06 04 013 08 04 08 04 04 09 04 04 010 05 04 011 06 04 012 06 05 二惡英的來源及污染 環(huán)境二惡英污 染的來源有人類來源和自然來源兩種。人類來源包括焚化、造紙工業(yè)、垃圾焚燒、農(nóng)藥、建筑物起火、汽車尾氣排放、含 料的生產(chǎn)和使用、含氯及二惡英制品的回收利用等。自然來源有森林失火和火山爆發(fā)，以及森林土壤和沉積物形成過程等。二惡英的產(chǎn)生是一個非常普遍的化學(xué)過程，其形成機理非常復(fù)雜，目前尚不十分清楚（ 1986）?，F(xiàn)在認識到各種醫(yī)療和城市垃圾的焚燒、煉鐵、酮溶解和 料生產(chǎn)是全球二惡英污染的主要部分（楊小芳， 2000）。對于不同的國家和地區(qū)，各個來源所占的比例各不相同。對于歐美等發(fā)達國家，是以燃燒過程為主要污染源。而在我國則由于工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)的限制，工業(yè)生產(chǎn)過程是主要的污染源。隨著城市化和工業(yè)化的發(fā)展，二惡英產(chǎn)生亦呈增加趨勢。 二惡英主要由含氯有機質(zhì)燃燒時形成，各種工業(yè)生產(chǎn)也微量產(chǎn)生二惡英（ 2003）。 二惡英在所有媒介物質(zhì) (包括空氣、水、沉積物和食物，尤其是奶制品、肉、魚和貝類 )中廣泛存在。因為食品消費是人類接觸毒物的主要途徑，幾乎所有二惡英類物質(zhì)都是通過攝食進入人中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 4 體。尤其肉、奶和魚的脂肪內(nèi)容易富集二惡英。一些土壤、沉積物和動物內(nèi)二惡英含量高，而水和空氣中含量低。 產(chǎn)生的二惡英可通過 空氣、飲水及食物直接經(jīng)呼吸道或口腔進入人體，也可以通過皮膚進入人體。但人類主要因為二惡英在食物鏈的富集作用而直接暴露于二惡英。通過食物鏈傳遞，二惡英在生物體內(nèi)可高度蓄積，造成對人和環(huán)境的危害（ 。 超過 90%的二惡英是通過膳食進入人體，其中大部分膳食為動物產(chǎn)品。由于二惡英的脂溶性和在環(huán)境中的極高穩(wěn)定性，環(huán)境污染通過水生植物、浮游生物 食魚魚類 魚體、家禽及禽蛋富集。動物因為攝食用污染的動物性脂肪和工業(yè)用油生產(chǎn)的飼料，也會造成二惡英蓄積。因此，魚、家禽及禽蛋、肉類 等為主要污染食品。 全球范圍內(nèi)儲存了很多高二惡英含量的工業(yè)廢油。長時間儲存這種廢油可能導(dǎo)致二惡英釋放到環(huán)境中，并污染人和動物的食物供給。二惡英不易在不污染環(huán)境和人類的情況下被處理。 惡英的毒性及毒性機制 二惡英的毒性 目前發(fā)現(xiàn)的無意識合成的副產(chǎn)品中毒性最強的化合物。根據(jù)美國環(huán)境保護署 (994 年 9 月的報告，其中四氯代二苯并 二惡英 (2， 3， 7， 8， 迄今為止所發(fā)現(xiàn)的毒性最強的物質(zhì)，被稱為“地球上毒性最強的毒物”，其毒性相當于氰化鉀 ( 1 000 倍、氰化鈉的 130 倍、砒霜的 900 倍、馬錢子堿的 500 倍以上，比黃曲霉素高 10 倍，比 3,4氯聯(lián)苯和亞硝胺還要高數(shù)倍（張潔， 2000）。 有極強的急性毒性，機體接觸少量就會有明顯的中毒反應(yīng)。因此，國際癌癥研究署 ( 1997 年 2 月 14 日的報告中將 2， 3， 7， 82000）。美國 1995 年對全球二惡英危險的評價報告指出，癌癥病人中萬分之一受二惡英侵害。美國環(huán)境保護局（ 經(jīng)把 為“人類易感致癌物質(zhì)”。 各種二惡英毒性差異大 ，有的毒性相差達萬倍以上。造成毒性差異的原因是氯原子取代數(shù)目和位置不同。二惡英化合物中，含有 4 至 8 個氯原子， 2、 3、 7、 8 位置被氯原子取代的同系物毒性大，這樣的二惡英化合物共 17 種，而其他 1代二惡英的毒性當量因子低于 際純粹化學(xué)和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（ 經(jīng)對所有 209 種 號 (1994)。在這 209 種 3 種具有二惡英樣毒性，這 13 種 有 4 個或 4 個以上氯原子。鄰位沒有氯原子取代的共平面 毒，其中尤以雙對位和多于兩個側(cè)位氯取代的 毒，如 們的結(jié)構(gòu)最接近 2， 3， 7， 8雯， 2001）。 二惡英具有廣泛生物毒性作用，有些毒性作用具種特異性（ 1989）。其毒性大小受動物種屬、品系及年齡影響，其中豚鼠對其最為敏感。二惡英大部分實驗動物半數(shù)致死量（ g/平。不同種屬急性經(jīng)口毒性的 ug/驗結(jié)果如下：豚鼠 2，雞 25 50，恒河猴 30 300，小鼠 114 284，田鼠 505（劉燕群， 2004）。比如對豚鼠的死亡時間為 1 2 周，大鼠為 2 3 周，小鼠為 3 4 周，猴為 6 8 周（ 1991）。 鑒于二惡英毒性巨大，部分國家于上世紀 90 年代陸續(xù)頒布了二惡英安全攝入量標準（ 重），其數(shù)值分別為：瑞典 5；荷蘭 4；德國 10；意大利 1；美國 本 4。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 5 有些國家對食品中二惡英作了最高殘留限量（ ng/定，對于奶制品：比利時 5；荷蘭 6；德國 5；對于脂肪為 5；雞蛋為 20； 定的相應(yīng)食品中二惡英最大含量限量標準為：牛肉 1；雞肉 4；雞蛋 7。美國環(huán)境保護局 規(guī)定日允許攝入量為 重， 則規(guī)定為1堅， 2000）。另外，國的排放標準則為 1.0 大多數(shù)關(guān)于二惡英對健康的影響信息來自對實驗動物的研究。一些影響已經(jīng)在意外暴露人群和暴露于二惡英的工作者觀察到。科學(xué)家已經(jīng)確認了二惡英類物質(zhì)產(chǎn)生這些影響的幾個步驟。 二惡英對環(huán)境的危害特別是對人類健康的影響超過了 20 世紀 60 年代的 惡英主要通過改變機體及細胞內(nèi)平衡發(fā) 揮毒性效應(yīng)。二惡英的毒性表現(xiàn)為急性、慢性和次慢性效應(yīng)。急性作用時，肝臟是主要受害器官。但普通人群不可能接觸到高純度二惡英，也就不大可能急性中毒致死，只可能受到長期低劑量的暴露。由于二惡英特有的物理化學(xué)性質(zhì)，二惡英廣泛存在于環(huán)境中，通過食物鏈的富集作用，對動物和人類造成直接或間接的影響。人類二惡英慢性中毒癥狀包括：氯唑瘡、脫發(fā)、卟啉病、神經(jīng)麻木、肝損傷、體重減輕、身體衰弱、生殖發(fā)育、智力障礙、免疫抑制以及“三致”作用等。 二惡英的毒性作用呈多樣化。典型如： 體重在死亡之前通常急劇下降。實驗動物的體重在死亡前 一般減少三分之一至一半。二惡英急性作用時，動物淋巴組織萎縮，如胸腺和脾。 某些上皮組織增生和 /或異生化。在很多生物，肝臟是二惡英的靶組織（ 1979）。相對低劑量時，可導(dǎo)致肝腫大，此時誘導(dǎo)酶量增加，且肝脂肪含量也改變。在豚鼠，可觀察到二惡英對肝臟的明顯作用（ 1984）。也有胃粘膜、膽管、膀胱上皮細胞增生的報道。眼瞼會出現(xiàn)鱗狀上皮化生，引起眼瞼炎，耳道腺鱗狀上皮化生，引起耳道蠟樣化膿。 氯痤瘡是二惡英毒性的典型表現(xiàn)（ 1984）。這是一種急性囊性痤瘡，皮膚發(fā)生增生和角質(zhì)化改變，以及色素沉著。皮膚或機體系統(tǒng)二惡英暴露均可在敏感生物引起氯痤瘡，包括人、猴、無毛鼠和兔等。氯痤瘡持續(xù)