【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）RNAi介導(dǎo)的抗RSV轉(zhuǎn)基因水稻研究分子植物病理學(xué)博士論文

密級(jí) 論文編號(hào) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 導(dǎo)的抗 基因水稻研究 on on I 摘 要 水稻條紋葉枯病是熱帶和亞熱帶地區(qū)最重要的病毒病之一。 在我國的 粳稻 產(chǎn)區(qū)一般會(huì)造成20 30的減產(chǎn)。 近年來 由于氣候和耕作的變化以及水稻品種的抗病性較差，我國江蘇、山東、河南等地 種植的水稻遭受嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。水稻條紋葉枯病由水稻條紋病毒 （ 引起， 是纖細(xì)病毒屬（ 代表種 ，主要由灰飛虱 （ 其 它 3 種 飛虱 持久性傳播。 電鏡下觀察呈絲狀粒體，以折疊、分枝和超螺旋等形式存在。 寄主植物和介體昆蟲體內(nèi)都能進(jìn)行復(fù)制。 一種重要基因沉默現(xiàn)象， 當(dāng)表達(dá)來源于病毒某一基因或核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物發(fā)生 默時(shí)，能對(duì)入侵的同一病毒或同屬中相近病毒的 行降解，使入侵的病毒不能在植物中積累，從而賦予轉(zhuǎn)基因植物病毒抗性。 本實(shí)驗(yàn)室對(duì)我國北方 34 個(gè) 離物 因 進(jìn)行 分析，結(jié)果表明 因的 核苷酸序列一致性在 100之間 ，說明 我國北方粳稻產(chǎn)區(qū)所發(fā)生的 P 基因非常保守 ， 有利于識(shí)別 。 因此，本研究 探索 利用 理構(gòu)建 P 基因全長片段或部分片段介導(dǎo)的干涉載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化水稻， 篩選對(duì)水稻條紋病毒產(chǎn)生抗性的轉(zhuǎn)基因水稻 后代 ，利用品種自身的抗性達(dá)到主動(dòng)防治的目的。 本研究首先利用 體 上的多克隆位點(diǎn)將 P 全長或部分片段的正義鏈、反義鏈、正反鏈分別連接到載體上，其中正反鏈之間由一段載體上的內(nèi)含子作為間隔，從而形 成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。再根據(jù)農(nóng)桿菌 導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻的需要，將初步構(gòu)建的載體上包含目的基因結(jié)構(gòu)的片段酶切后連接到水稻轉(zhuǎn)化常用載體 終構(gòu)建成適合農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻的載體，構(gòu)建了含 P 全長和部分基因片段的正義鏈、反義鏈和正反義干涉載體。 此外，通過對(duì) 載體 和 體的改造， 構(gòu)建了既可用于干涉，又能直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化 成一種新 載體。 利用農(nóng)桿菌 介導(dǎo)將構(gòu)建的干涉載體轉(zhuǎn)入水稻模式品種愛知旭和推廣品種皖粳 97及秀水 11 的 成熟胚愈傷組織 ， 利用 方法對(duì)轉(zhuǎn)化得到的水稻進(jìn)行目的基因檢測，初步鑒定獲得 以 愛知旭 為受體的 轉(zhuǎn)基因水稻 8 棵（其中轉(zhuǎn) P 載體 5 棵，轉(zhuǎn) 體3 棵），皖粳 97 為受體的 轉(zhuǎn)基因水稻 1 棵（轉(zhuǎn) P 載體），秀水 11 為受體的 轉(zhuǎn)基因水稻 2 棵（轉(zhuǎn) P 載體）。 對(duì) 轉(zhuǎn)基因水稻再進(jìn)行 35S、 幾種載體上存在的元件進(jìn)行 檢測，初步判斷轉(zhuǎn)入水稻的元件 基因是否發(fā)生 丟失 。 對(duì) 皖粳 97 轉(zhuǎn)基因水稻的后代 隨機(jī)抽取樣品 （ 20 棵、 約 66 棵） 進(jìn)行目的基因檢測和元件檢測， 初 步 鑒定其中的70 棵為陽性 轉(zhuǎn)基因水稻后代。 為了保證接種壓力，首先 對(duì)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的帶毒灰飛虱種群進(jìn)行檢測，測得其帶毒率為 。 利用帶毒灰飛虱 進(jìn)行接種 實(shí)驗(yàn) ，每株水稻接種 10 12 頭灰飛虱，接種7 天后 將灰飛虱轉(zhuǎn)移或殺死 ，將植株移栽大田或溫室 。 對(duì) 獲得的 愛知旭 為受體的 轉(zhuǎn)基因水稻 （ 其后代（ 皖粳 97 為受體的 轉(zhuǎn)基因水稻 （ 及其后代（ 行 接種實(shí)驗(yàn)，接種后大約 55 60 天 進(jìn)行抗病性調(diào)查。 病情調(diào)查結(jié)果表明， 轉(zhuǎn)基因愛知旭水稻有 5 棵表現(xiàn)高抗，有 2 棵表現(xiàn)免疫。 與非轉(zhuǎn)基因水稻 皖粳 97 相比，轉(zhuǎn)基因 皖粳 97 植株發(fā)病延遲， 大部分轉(zhuǎn)基因水稻的發(fā)病癥狀明顯減輕或者 未出現(xiàn) 癥狀。 參照抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抗病性分析，對(duì)照皖粳 97 植株 現(xiàn)高感， 皖粳 97 為受體的 轉(zhuǎn)基因水稻中的 3 個(gè)株系表現(xiàn)中感， 7 個(gè)株系表現(xiàn)中抗， 5 個(gè)株系表現(xiàn)高抗 （其中 3 個(gè)株系的 植株 表現(xiàn) 免疫 ） 。通過對(duì) 皖粳 97 轉(zhuǎn)基因植株的連續(xù)抗病性調(diào)查，可以看出 轉(zhuǎn)基因 植株對(duì) 抗性可以遺傳給 代。 接種后發(fā)病等級(jí)為 0 的轉(zhuǎn)基因水稻植株中病毒 含量及其 累量與非轉(zhuǎn)基因水稻相比明顯 較低。 此外， 抽取不同轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行外源插入結(jié)構(gòu)的 左右邊界分析及其旁側(cè)序列測定。 轉(zhuǎn)基因秀水 11 水稻 0有不完整的左邊界和右邊界，通過右邊界的序列分析 初步推測 在 0外源片段是多拷貝插入 。轉(zhuǎn)基因水稻 0因組中既發(fā)生了外源載體與水稻基因組的重組，還存在載體之間的重組。通過分析初步確定了外源載體在所擴(kuò)增到的秀水 11 基因組序列中的位置，但尚不能定位。同時(shí)，分析結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因皖粳 97 水稻 有完整的右邊界和斷裂的左邊界，其后代 有與其相同的分析結(jié)果。 關(guān)鍵詞 ： 水稻條紋病毒 灰飛虱 干涉載體 農(nóng)桿菌介 導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 is of in 0in In to in of is of is in by As a of in an it in P SV in 4 of P of cp by In P CP In of 969or 223 P an in to a 69 23 of P as of a A of P, P as as in to to A P P) on be to . CP At a on be to . to by of . CR to 5S et or in by as In to of of 4.3 0to or of 5 0 of of by as to of a IV or no to of SV of 7(on of SV 0, T1 2 of 1 be to 2 P in In on NA to of in of V 目 錄 第一章 文獻(xiàn)綜述 . 1 稻條紋病毒的生物學(xué) . 1 稻條紋病毒的分類地位及病毒粒體形態(tài) . 1 稻條紋葉枯病的分布與危害 . 1 基因組結(jié)構(gòu) . 3 關(guān)抗 水稻研究 . 6 稻基因資源的利用 . 6 害控制的分子生物學(xué)策略 . 6 發(fā)現(xiàn)及其在水稻抗病毒基因工程中的重要性 . 7 發(fā)現(xiàn)及其特點(diǎn) . 7 可能機(jī)制 . 9 物病毒外殼蛋白介導(dǎo)的抗性及 水稻抗 病毒中的重要性 . 11 用病毒外殼蛋白進(jìn)行的抗病毒研究 . 11 基因植物研究中存在的問題 . 12 水稻抗病毒基因工程中的應(yīng)用前景 . 13 桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化技術(shù)研究 . 14 桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化 (. 14 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻等單子葉植物的嘗試 . 15 響根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻的因素 . 15 化過程中的選擇標(biāo)記基因 . 16 化過程中的基因沉默及其對(duì)策 . 16 癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物的優(yōu)點(diǎn) . 17 研究的目的意義 . 18 第二章 適合農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化干涉載體的構(gòu)建 . 19 P 基因的克隆測序 . 19 材料和試劑 . 19 實(shí)驗(yàn)方法 . 19 果與分析 . 22 適合農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻轉(zhuǎn)化的干涉載體的構(gòu)建 . 23 驗(yàn)材料 . 23 驗(yàn)方法 . 24 果與分析 . 26 論 . 29 第三章 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的兩種干涉載體的水稻轉(zhuǎn)化 . 31 料與方法 . 31 料 . 31 驗(yàn)方法 . 31 果與分析 . 33 桿菌轉(zhuǎn)化子的鑒定 . 33 稻成熟胚愈傷組織的培養(yǎng) . 34 傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng) . 35 基因水 稻植株的獲得 . 35 化效率分析 . 39 論 . 39 四章 轉(zhuǎn)基因水稻的分子鑒定及其抗病性研究 . 41 料與方法 . 41 基因水稻品種 . 41 基因水稻所轉(zhuǎn)化的載體 . 41 稻葉片 小量提取 . 41 測 . 42 用設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行構(gòu)造檢測 . 42 聯(lián)免疫吸附法間接 . 42 子的潮霉素平板抗性篩選 . 44 稻葉片總 提取 . 44 析 . 44 交分析 . 44 基因水稻抗病性鑒定 . 46 果與分析 . 48 知旭為受體得到的轉(zhuǎn)基因水稻 . 48 粳 97 受體所得轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定與分析 . 51 論 . 56 第五章 轉(zhuǎn) P 基因水稻的插入位點(diǎn)解析 . 58 料與方法 . 58 稻材料 . 58 涉載體的物理圖譜 . 58 載體構(gòu)造 . 59 據(jù) 體所設(shè)計(jì)的引物 . 59 法 . 60 鏈 . 61 列測定和分析 . 61 果與分析 . 61 基因水稻 提取 . 61 基因水稻左右邊界的檢測 . 62 轉(zhuǎn)基因水稻 0 1 結(jié)構(gòu)基因檢測及其旁側(cè)序列分析 . 63 粳 97 受體所得轉(zhuǎn)基因水稻結(jié)構(gòu)基因的檢測 及其旁側(cè)序列分析 . 68 論 . 69 第六章 全文結(jié)論 . 71 參考文獻(xiàn) . 73 附錄 . 83 致 謝 . 91 作 者 簡 介 . 92 文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 芐 青霉素 As 酰丁香酮 bp 基對(duì) 補(bǔ) 瓜花葉病毒 CP 殼蛋白 d 蒸水 氧核苷 三磷酸 腸桿菌 EB 化乙錠 二胺四乙酸 聯(lián)免疫吸附法 h 時(shí) 霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 際病毒分類委員 會(huì) IR 因間隔區(qū) MP 動(dòng) 蛋白 使 I I 霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 苷酸 開放閱讀框架 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 復(fù)制酶蛋白 錄后 水平的 基因沉默 乙烯吡咯烷酮 NA 依賴 合酶 稻矮縮病毒 導(dǎo)的病毒抗性 NA 涉 分鐘轉(zhuǎn)速 稻條紋病毒 轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 稻黃斑駁病毒 SP 病害特異性蛋白 鏈 GS 錄水平上的基因沉默 編碼區(qū) 毒義互補(bǔ)鏈 義鏈 干涉 43中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博 士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 第一章 文獻(xiàn)綜述 稻 條紋病毒的 生物學(xué) 稻條紋病毒的分類地位及病毒粒體形態(tài) 水稻條紋病毒（ 纖細(xì)病毒屬（ 代表種。纖細(xì)病毒在1983 年才首次被確認(rèn)為植物病毒的一個(gè)組，在 1993 召開的國際病毒分類委員會(huì) (六次會(huì)議上，改為纖細(xì)病毒屬（ ， 1995），歸入無包膜的 毒中。根據(jù)傳 毒介體、寄主范圍、 分?jǐn)?shù)目及大小和相應(yīng)基因編碼蛋白的氨基酸序列的同源性（ 85%）以及相應(yīng)基因間隔區(qū)（ 列的同源性（ 60%），已將 草白葉病毒（ 玉米條紋病毒（ 水稻白葉病毒（ 水稻草矮病毒（ 尾稃草白葉病毒（ 明確歸入纖細(xì)病毒屬（ ， 2000） 。 有關(guān) 體形態(tài)的報(bào)道很多。 1975 年以前，水稻條紋葉枯病的病原 一直 被 認(rèn)為是直徑約3050球狀病毒（ ， 1974）。