【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）水稻第6染色體短臂產(chǎn)量性狀QTL的分解與遺傳驗證生物化學(xué)與分子生物學(xué)博士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士學(xué)位論文 水稻第 6 染色體短臂產(chǎn)量性狀 分解與遺傳驗證 on rm on rm I 摘 要 本實驗室 前期 利用珍汕 97B/密陽 46 重組自交系群體 ， 經(jīng)初步定位，發(fā)現(xiàn)第 6 染色體短臂上的 研究群體的產(chǎn)量形成具有重要作用。 經(jīng) 548 個 記檢測，兩親本在 座位上呈多態(tài)。 本研究 選取第 6 染色體短臂 目標區(qū)間多態(tài)性標記 8 個和其它區(qū)間標記 18 個，檢測 461個 系各 1 個單株 ， 篩選出一個在 間（約 雜合，在其他區(qū)間呈純合的單株。進而以 208 個多態(tài)性 記檢測該單株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該單株 除了在第 6 染色體短臂 間呈雜合，還在第 1 染色體長臂 間、第2 染色體長臂 間、第 4 染色體短臂 間、第 5 染色體短臂 間呈雜合。 但同一組合的前期研究未在這些背景區(qū)間檢測到產(chǎn)量性狀 這說明背景雜合區(qū)間對目標區(qū)間產(chǎn)量 位的影響較小。利用該單株衍生了一套由 221 個株系組成的 群體，建立 記連鎖圖 分解產(chǎn)量性狀 并進而由此群體衍生了 4 個次級 生群體 ，進行進一步的驗證和分解 。主要結(jié)果如下： 1 應(yīng)用原始 生的 群體 ，發(fā)現(xiàn)完整目標區(qū)域中（即 在 3 個以上控制產(chǎn)量性狀的區(qū)間。 將由 221 個株系組成的 體，種植于海南和浙江兩地，考察每株穗數(shù)、每穗實粒數(shù)、每穗總粒數(shù)、千粒重、結(jié)實率和單株產(chǎn)量，應(yīng)用 測 解水稻第 6 染色體短臂上控制產(chǎn)量性狀的 結(jié)果表明， 在所分析的 6 個性狀中，除穗數(shù)外 均 在第 6染色體短臂上的目標區(qū)間均檢測到 別座落于目標區(qū)域中 3 個以上的不同區(qū)間中，單個群體性狀表型變異的貢獻率為 控制產(chǎn)量構(gòu)成因子的 本以加性作用為主； 同一區(qū)間控制不同性狀的 同區(qū)間控制同一個性狀的 遺傳作用模式、效應(yīng)方向和效應(yīng)大小上存在一定差異。 2 應(yīng)用覆蓋 目標區(qū)域中 間的三套近等基因系材料，分解出 3 個控制產(chǎn)量性狀的 別位于 區(qū)間中 。 從上述 體中篩選獲得 三套 次級 對 間 ，構(gòu)建了三套 近等基因系 。經(jīng)等位基因效應(yīng)分析和交迭重組染色體片段代換系分析，分解出 3 個控制每穗實粒數(shù)的 2個控制單株產(chǎn)量的 些 別位于物理 距離 為 區(qū)間中，全部表現(xiàn)為加性作用為主，增效等位基因除 自父本密陽 46 外，均來自母本珍汕 97B。提出了構(gòu)建新型 遺傳材料 、 提高水稻 細定位效率的策略。 3 應(yīng)用覆蓋 間的次級 生群體，驗證了目標區(qū)域底部產(chǎn)量性狀 從原始 體篩選出在 間雜合，其他區(qū)間純合的一個 交獲得484 個 株，經(jīng)標記檢測后挑選在目標區(qū)間發(fā)生重組的 134 個株系和不發(fā)生重組的 20 個株系， 種植其 體。經(jīng)分析，在 6 個產(chǎn)量性狀上都在目標區(qū)間底部或近底部區(qū)域檢測到顯著的效應(yīng)。這些 部表現(xiàn)為加性作用為主 ， 單個 群體性狀表型變異的貢獻率為 最大 坐落于 間 。 關(guān)鍵詞 產(chǎn)量性狀； 余雜合體（ 第 6 染色體短臂；水稻（ ） n in of by IL 7B/ 6. In of of in 61 IL 6 a to a in we 08 HL is in 7 in of . on of , on of , on of , on of . to TL in of of to TL of 2:3 21 a 2:3 by 21 2:3 in on of . as 1. in to or a 21 a HL 7 21 F3 .5 to of of of 1000 on of . of by TL as or in TL TL a in a 2. to of in of in of 21 F3 on in IL in at at at an of to TL in 3. a in of A a in 21 F3 A 84 by 34 0 no in 54 F3 TL by as by a TL in on of , in on of . of ; .） V 目 錄 摘 要 . I . 文縮略表 . 一章 文獻 綜述 . 1 分子標記的種類及其在水稻上的應(yīng)用 . 1 分子標 記得類型及特點 . 2 子標記在水稻遺傳研究中的應(yīng)用 . 4 位的原理與常用方法 . 5 構(gòu)建圖譜 . 6 圖方法 . 8 位的精度 . 10 位的閾值 . 10 細定位 . 10 候選基因克隆 . 11 以性狀和分子標記為基礎(chǔ)的目標區(qū)域 等基因系 . 12 水稻 位的研究 . 12 水稻 位研究現(xiàn)狀 . 13 水稻產(chǎn)量相關(guān)性狀 位研究進展 . 13 本研究的目的和意義 . 14 第二章 第 6 染色體短臂產(chǎn)量性狀 分解 . 15 材料和方法 . 15 生群體的構(gòu)建和性狀考察 . 15 取 . 17 分子標記的篩選和基因型鑒定 . 17 數(shù)據(jù)分析 . 19 結(jié)果與分析 . 19 表型變異 . 19 遺傳連鎖圖的構(gòu)建 . 21 目標區(qū)間的（ 定位結(jié)果 . 22 背景分離區(qū)間的 位結(jié)果 . 24 討論 . 25 第三章 對 間內(nèi)水稻產(chǎn)量性狀 遺傳驗證 . 27 材料與方法 . 27 實驗材料 . 27 取 . 28 標記檢測 . 29 性狀考查和數(shù)據(jù)分析 . 29 結(jié)果與分析 . 29 表型表現(xiàn) . 29 以等位基因效應(yīng)為基礎(chǔ)的 解 . 30 以染色體片段代換系效應(yīng)差異為基礎(chǔ)的 解 . 31 討論 . 34 第四章 對 間內(nèi)水稻產(chǎn)量性狀 遺傳驗證 . 36 材料和方法 . 36 實驗材料與性狀考察 . 36 取 . 36 標記檢測 . 36 數(shù)據(jù)分析 . 36 結(jié)果與分析 . 36 表型變異 . 36 遺傳連鎖圖的構(gòu)建 . 38 對 間產(chǎn)量性狀 定位 . 38 討論 . 39 第五章 結(jié)論及進一步的研究展望 . 41 結(jié)論 . 41 三個相關(guān)實驗分別得到的結(jié)論 . 41 全文結(jié)論 . 42 展望 . 42 參考文獻 . 43 致 謝 . 56 作者簡歷 . 57 英文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 增片段長度多態(tài)性 BC 交系 合區(qū)間作圖法 色體片斷代換系 DH 倍雙倍體 株產(chǎn)量 IM 間作圖法 子標記輔助選擇 于標記的分析方法 of 穗實粒數(shù) 等基因系 NP of 株穗數(shù) 合酶鏈式反應(yīng) 量性狀座位 機擴增多態(tài)性 制性片段長度多態(tài)性 余雜合體 組自交系 異 序列擴增區(qū)域 SF 實率 單序列重復(fù) 列標簽位點 于性狀的分析方法 000粒重 of 穗總粒數(shù) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 文獻綜述 1 第 6 染色體短臂產(chǎn)量性狀 分解與驗證 水稻 （ .） 是人類賴以生 存的主要糧食作物 ， 全世界約有 1/2 的人口以其為主要的食物來源。隨著世界人口的不斷增長 ， 糧食生產(chǎn)持續(xù)受到嚴峻的挑戰(zhàn) ， 因此 ， 高產(chǎn)育種今后仍然是育種工作的主要目標 ， 傳統(tǒng)育種工作圍繞這一目標已取得了豐 碩 的成果 ， 使農(nóng)作物的產(chǎn)量潛力得到了高水平的發(fā)揮 ， 但 社會的發(fā)展對品種的產(chǎn)量提出了更高的要求。由于產(chǎn)量性狀是由微效多基因控制的數(shù)量性狀 ， 表現(xiàn)為連續(xù)變異 ， 受環(huán)境的影響較大 ， 不能依照質(zhì)量性狀的處理方法將單個基因的效應(yīng)區(qū)分開來 ， 因此目前要想單獨依靠傳統(tǒng)育種方法和技術(shù)在現(xiàn)有基礎(chǔ)上有大的突破 ， 難度越來越大。近年來 ， 數(shù)量遺傳學(xué)和現(xiàn)代生 物技術(shù)的發(fā)展為作物育種賦予了新的活力 ， 借助 子標記和 圖 ， 復(fù)雜的數(shù)量性狀可剖分為若干孟德爾因子所決定的組分 ， 進而確定其在染色體上的位置及其與其他基因的關(guān)系 （ ， 1988） ， 分子標記輔助選擇 （ 和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)手段的應(yīng)用 ， 使作物育種的再次高速發(fā)展成為可能。 水稻不僅是重要的糧食作物 ， 而且還是單子葉植物分子生物學(xué)研究的模式植物。水稻是二倍體 （ 2n=24） 植物 ， 基因組是禾谷類作物中最小的 ， 單倍體基因組含有約有 38995%完 成測序 （ 2005） ； 并且 水稻中已經(jīng)建立了高密度的分子標記連鎖圖 （ 和高效的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng) （ ， 1991； 1994） 。水稻基因組與其他禾本科作物如小麥、玉米等有很高的共線性和基因間的同源性 ，在比較基因組研究中有 較大的利用價值 （ ， 1998， ， 2003） ；因此 ， 水稻己被認為是單子葉植物遺傳、發(fā)育和基因組研究的模式植物。 第一章 文獻綜述 分子標記的種類及其在水稻上的應(yīng)用 遺傳學(xué)的發(fā)展在很大程度上是建立在遺傳標記的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展基礎(chǔ)上的。遺傳標記 （ 是指可以明確反映遺傳多態(tài)性的生物特征 ， 是基因型的特殊的易于識別的表現(xiàn)形式。在經(jīng)典遺傳學(xué)中 ， 遺傳多態(tài)性是指等位基因的變異 ， 在現(xiàn)代遺傳學(xué)中 ， 遺傳多態(tài)性是指基因組中任何座位上的相對差異。在現(xiàn)代分子育種研究中 ， 遺傳標記的應(yīng)用已 成為基因定位和輔助選擇的主要手段。 遺傳標記在經(jīng)過了以基因表達產(chǎn)物為基礎(chǔ)的形態(tài)標記、細胞生物學(xué)標記和生化標記之后 ， 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展又產(chǎn)生了一類重要的直接以基因為基礎(chǔ)的遺傳標記 ， 即分子標記。由于形態(tài)、生理和生化性狀等遺傳標記數(shù)量有限及可能存在的多效作用 ， 目前用于基因定位的標記主要為分子標記。與形態(tài)標記、細胞標記和生化標記相比 ， 分子標記具有以下優(yōu)點 :（ 1） 直接以式表現(xiàn) ， 在植物的各個組織、各發(fā)育時期均可檢測到 ， 不受季節(jié)、環(huán)境限制 ， 不存在表達與否的問題； （ 2） 數(shù)量極多 ， 遍及整個基因組； （ 3） 多態(tài)性高 ； （ 4） 不影響目標性狀的表達 ，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 文獻綜述 2 與不良性 狀無必然的連鎖； （ 5） 許多 分子標記表現(xiàn)為共顯性 ， 能夠鑒別出純合和雜合的基因型 （ 賈繼增 ， 1996） 。 由于這些特點 ， 分子標記廣泛用于遺傳圖譜和物理圖譜 構(gòu)建 、生物進化 和 遺傳多樣性研究 、基因定位與克隆、分子標記輔助育種 等許多方面 的 研究。 分子標記的類型及特點 20 世紀 60 年代初 ， 1961） 提出在分離群體中利用足夠數(shù)量的標記構(gòu)建數(shù)量性狀遺傳圖譜的可能性和方法。由于實驗手段的限制 ， 經(jīng)典數(shù)量遺傳學(xué)一直把數(shù)量性狀的多基因作為一個遺傳整體用統(tǒng)計學(xué)的方法加以分析 ， 不能確定單個基因效應(yīng)及其在染色體的位置。自從 作為遺傳標記研究人類基因組 ， 隨后用于植物基因組研究開始 ， 分子標記技術(shù)迅猛發(fā)展 ， 先后產(chǎn)生了 、 、 又稱 和 等各種類型的 標記。根據(jù)分析手段和方法 ， 可將分子標記分為三類 （ ， 1999） ： （ 1） 基于雜交的分子標記 ， 如 （ 2） 基于 分子標記 ， 如 、 等。 （ 3） 基于 列和芯片的分子標記 ， 如 。但 圖使用的分子標記主要為 限制性片段長度多態(tài)性 （ 是最早應(yīng)用于圖譜構(gòu)建和基因定位的 子標記。 交的分子標記的方法 ， 它是指用限制性內(nèi)切酶酶切不同個體基因組 酶切片段長度的差異。這一技術(shù)用放射性同位素 生化反應(yīng)物 標記 段作為同源序列探針 ， 與經(jīng)限制酶消化并轉(zhuǎn)移到支持膜上的基因組總 交 ， 通過放射性自顯影 （ 或非同位素技術(shù) ）來顯示酶切片段的大小 ， 檢測不同遺傳位點的等位變異 （ 多態(tài)性 ） 。 術(shù)首先在人類基因組作圖中發(fā)展起來 （ ， 1980， 1987） ， 以后被廣泛用于植物基因組作圖（ ， 1986； ， 1988； ， 1991； ， 1992； ，1993） 。 術(shù)應(yīng)用于水稻基因組研究 ， 已構(gòu)建了相當飽和的水稻分子連鎖圖譜 ， 如美國 16 個 記 （ ， 1994） ；我國熊立仲等構(gòu)建了含 612 個標記位點的水稻連鎖圖 譜 ， 其中 記有 312 個 （ 熊立仲等 ， 1998） ；沈利爽等 （ 1998） 利用 體構(gòu)建了含 444 個標記位點的連鎖圖譜 ， 其中 276 個分子標記為 些圖譜的構(gòu)建為基因定位 ， 基因克隆及外源染色體 （ 片段 ） 的準確鑒定打下了堅實的基礎(chǔ)。水稻上應(yīng)用的 記主要包括水稻隨機基因組 針、以及來自水稻、小麥、大麥、玉米等作物的 針等。由于 記是共顯性標記 ， 檢測可靠性高 ， 重復(fù)性好 ， 故 術(shù)對 求量大 ， 技術(shù)復(fù)雜 ，需要同位素 標記探針 ， 實驗周期長 ， 信息量少 ， 限制了這一技術(shù)的應(yīng)用 （ 伊佟明等 ， 1997） 。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 文獻綜述 3 隨機擴增多態(tài)性 技術(shù) 就是用一個 （ 有時用兩個 ） 隨機引物 （ 一般 8堿基 ） 非定點地擴增基因組 然后用凝膠電泳分開擴增片段。由于 物不受種屬特異性和基因結(jié)構(gòu)限制 ， 一套引物可用于任何物種 ， 非常適合群體遺傳學(xué)、種質(zhì)資源鑒定分類、生物多樣性分析及目標基因標記篩選等研究。其操作簡便易行 ， 不涉及同位素 ， 對 備的純度要求不高 ， 且具有分析快、所需 品量小等優(yōu)點 ， 因而已被廣泛應(yīng)用于基因定位、品種鑒別 （ 1994） 、群體或種的遺傳變異 （ ， 1992； ， 1995） 及遺傳圖譜的構(gòu)建 （ ， 1992） 等研究。 但是 由于 記是顯性標記 ， 不能有效地鑒別雜合子 ，且易受反應(yīng)條件的影響 ， 穩(wěn)定性較差 ， 主要應(yīng)用于連鎖標記的初步篩選 （ ， 1995） 。 簡單重復(fù)序列 （ 又稱微衛(wèi)星 （ ， 是一類以幾個 （ 一般 1 ） 核苷酸為單位串聯(lián)重復(fù)而成的 其長度一般在 200 1984； ， 1996） 。這種簡單序列的重復(fù)次數(shù)存在豐富的多態(tài)性 ， 不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)的可變性 ， 導(dǎo)致了 度的高度變異性 ， 這一變異性正是 記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。盡管微衛(wèi)星 布于整個基因組的不同位置 ， 但其兩端序列多是保守的單拷貝序列 ， 術(shù)就是根據(jù)微衛(wèi)星序列兩側(cè)的保守序列設(shè)計引物 ， 擴增 段 ， 從而檢測出重復(fù)次數(shù)不同而導(dǎo)致長度變化的多態(tài)性。 記用于作圖不但簡化了遺傳分析過程 ， 且利于不同作圖群體間的標記轉(zhuǎn)換（ ， 1997） ， 已經(jīng)成為目前構(gòu)建完整遺傳連鎖圖譜時的首選標記。 記一般按照孟德爾方式分離 ， 呈共顯性遺傳 ， 重復(fù)性好 ， 穩(wěn)定性好。 因其 具有 記的所有優(yōu)點 ， 且多態(tài)性豐富 ， 是進行品種指紋分析、構(gòu)建遺傳圖譜、研究目的基因連鎖關(guān)系、開展基因定位和分子標記輔助選擇的理想標記 （ ， 2002） 。 擴增片段長度多態(tài)性 （ 是一項結(jié)合了 術(shù)優(yōu)點的 紋技術(shù) ， 通過對基因組 切片段的選擇性擴增來檢測 切片段長度的多態(tài)性 ， 是目前為止作圖效率最高的一種標記。典型的 析每次的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測到的譜帶數(shù)在 50之間 ， 所以一次分析可以同時檢測到多個座位 ， 且多態(tài)性極高 （ ， 1998） 。它具有 穩(wěn)定性和 術(shù)的高效性 （ ， 1995） ；此外還具有分辯率高 ， 結(jié)果可靠的優(yōu)點 ， 理論上講 ， 不管所研究的基因組有多復(fù)雜 ， 用 法都可以檢測出任何 間的多態(tài)性 （ 王斌等 ， 1996） 。 術(shù)的主要不足是 ， 需要使用同位素或非同位素標記引物 ， 實驗條件要求較高 ， 相對比較費時耗財。 前廣泛應(yīng)用于基因組研究、遺傳圖譜及指紋圖譜構(gòu)建、目的基因標記定位、基因組文庫篩選、品種識別等領(lǐng)域 （ ， 1998； ， 1999； ， 1999； ， 2000） ， 它同 記 ， 起到補充 記的作用。 序標簽位點 （ 是從一個隨機選擇的 隆進行 5端和 3端單一次測序獲得的短的分序列 ， 代表一個完整基因的一小部分。 基因組中只出現(xiàn)一次 ， 任何單拷貝的多態(tài)性標記都可作為基因組的界標轉(zhuǎn)變?yōu)?記 ， 例如 1994 年 將水稻 記轉(zhuǎn)變成 63 個 記。用 行物理作圖 ， 可通過 雜交途徑來完成 ， 其分析結(jié)果穩(wěn)定可靠。它 的突出優(yōu) 點是共顯性遺傳 ， 很容易在不同組合的遺傳圖譜間進行標記轉(zhuǎn)移 （ ， 2003） 。不同的 染色體上的排列構(gòu)成了染色體的 譜 ， 對基因組研究 、 新基因的克隆以及基中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 文獻綜述 4 因圖譜向物理圖譜的轉(zhuǎn)化研究具有重要意義。 特異序列擴增區(qū)域 （ 是基于 術(shù)發(fā)展起來的一種標記方法。首先對 然后根據(jù)此序列設(shè)計一對新的引物 ， 擴增特異的多態(tài)性片段 ， 用較高濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測。它可以克服 記穩(wěn)定性和重復(fù)性差的缺點 ， 大大提高了標記的可用性 ， 具有快速、簡便、準確等優(yōu)點。隨著研究工 作的發(fā)展 ， 會有越來越多重要作物農(nóng)藝性狀的 記被開發(fā)出來 ， 它們將在分子標記輔助育種方面發(fā)揮巨大作用。 子標記在水稻遺傳研究中的應(yīng)用 水稻分子遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建 分子標記的出現(xiàn) ， 大大促進了遺傳圖譜的構(gòu)建。水稻中第一張遺傳圖譜是由美國康乃爾大學(xué)以秈稻 /爪哇稻 體構(gòu)建的 ， 所用探針為 總 譜由 135 個探針構(gòu)成 ， 覆蓋 1389探針間平均距離接近 1988） 。第二張圖譜仍然由康乃爾大學(xué)構(gòu)建 ， 采用的是 （ 非洲型陸稻 /長 雄蕊野生稻 ） / 秈型陸稻的回交群體。探針標記達到 722 個 ， 覆蓋基因組 1491標記間距離為 1994） 。 1994 年 ， 日本水稻基因組計劃完成了含有 1383 個分子標記的高密度分子連鎖圖譜 （ ， 1994） ， （ 1998） 將圖譜的分子標記加密到 2275 個 ， 總遺傳距離達到 平均每 有 1 個分子標記 ， 同時構(gòu)建了水稻 和物理圖譜；到 2001年定位到該圖譜上的分子標記己達 3000 多。 水稻基因的定位