表面等離子共振 (SPR) 技術(shù)與Biacore原理PPT課件.ppt

表面等離子共振 SPR 技術(shù)與Biacore原理 戴璐 表面等離子共振 SPR 原理 表面等離子共振 SurfacePlasmonResonance SPR 消逝波 當(dāng)光從光密介質(zhì)射入光疏介質(zhì) 入射角增大到某一角度 使折射角達(dá)到90 時(shí) 折射光將完全消失 而只剩下反射光 這種現(xiàn)象叫做全反射 當(dāng)以波動(dòng)光學(xué)的角度來(lái)研究全反射時(shí) 人們發(fā)現(xiàn)當(dāng)入射光到達(dá)界面時(shí)并不是直接產(chǎn)生反射光 而是先透過(guò)光疏介質(zhì)約一個(gè)波長(zhǎng)的深度 再沿界面流動(dòng)約半個(gè)波長(zhǎng)再返回光密介質(zhì) 則透過(guò)光疏介質(zhì)的波被稱(chēng)為消逝波 CompanyLogo 2 表面等離子共振 SPR 原理 等離子波 把金屬表面的價(jià)電子看成是均勻正電荷背景下運(yùn)動(dòng)的電子氣體 其中正 負(fù)帶電粒子數(shù)目幾乎相等 這實(shí)際上也是一種等離子體 當(dāng)金屬受電磁干擾時(shí) 金屬內(nèi)部的電子密度分布會(huì)變得不均勻 因?yàn)閹?kù)侖力的存在 會(huì)將部分電子吸引到正電荷過(guò)剩的區(qū)域 被吸引的電子由于獲得動(dòng)量 故不會(huì)在引力與斥力的平衡位置停下而向前運(yùn)動(dòng)一段距離 之后電子間存在的斥力會(huì)迫使已經(jīng)聚集起來(lái)的電子再次離開(kāi)該區(qū)域 由此會(huì)形成一種整個(gè)電子系統(tǒng)的集體震蕩 而庫(kù)侖力的存在使得這種集體震蕩反復(fù)進(jìn)行 進(jìn)而形成的震蕩稱(chēng)等離子震蕩 并以波的形式表現(xiàn) 稱(chēng)為等離子波 CompanyLogo 3 表面等離子共振 SPR 原理 SPR光學(xué)原理 光在棱鏡與金屬膜表面上發(fā)生全反射現(xiàn)象時(shí) 會(huì)形成消逝波進(jìn)入到光疏介質(zhì)中 而在介質(zhì)中又存在一定的等離子波 當(dāng)兩波相遇時(shí)可能會(huì)發(fā)生共振 當(dāng)消逝波與表面等離子波發(fā)生共振時(shí) 檢測(cè)到的反射光強(qiáng)會(huì)大幅度地減弱 能量從光子轉(zhuǎn)移到表面等離子 入射光的大部分能量被表面等離子波吸收 使反射光的能量急劇減少 可以從反射光強(qiáng)響應(yīng)曲線(xiàn)看到一個(gè)最小的尖峰 此時(shí)對(duì)應(yīng)的入射光波長(zhǎng)為共振波長(zhǎng) 使反射光完全消失的入射角就是SPR角 SPR角隨金膜表面折射率變化而變化 而折射率的變化又與金膜表面結(jié)合的分子質(zhì)量成正比 因此可以通過(guò)對(duì)生物反應(yīng)過(guò)程中SPR角的動(dòng)態(tài)變化獲取分子之間相互作用的特異信號(hào) CompanyLogo 4 SPR生物傳感器 SPR生物傳感器的光源為偏振光 polarizedlight 傳感芯片 sensorchip 表面鍍有一層金膜 實(shí)驗(yàn)時(shí) 先將一種生物分子 ligand 固定在金膜表面 然后將與之相互作用的分子 analyte 溶于溶液 或混合液 流過(guò)芯片表面 SPR檢測(cè)器能跟蹤溶液中的分子與芯片表面的分子結(jié)合 解離整個(gè)過(guò)程的變化 不同角度的反射光的光強(qiáng)被記錄后得到角度 光強(qiáng)曲線(xiàn)圖 每條曲線(xiàn)的波谷即為該曲線(xiàn)的共振角 共振角對(duì)應(yīng)的角度為共振信號(hào) resonancesignal 時(shí)間與對(duì)應(yīng)共振信號(hào)的曲線(xiàn)即為SPR傳感圖 sensorgram CompanyLogo 5 SPR生物傳感器 以免疫學(xué)分析為例 在金膜表面固定某種受體 如抗體 然后流過(guò)含相應(yīng)配體 如抗原 的樣品 配體與受體的結(jié)合將使金膜與溶液界面的折射率上升 從而導(dǎo)致共振角發(fā)生變化 為了表述的方便 共振角 或共振信號(hào) 可以用共振單位 resonanceunits RU 來(lái)表示 對(duì)大多數(shù)生物分子而言 1000RU大約等于1mm2的面積上有1ng的質(zhì)量變化 相當(dāng)于溶液中蛋白濃度為6mg ml SPR生物傳感器通過(guò)檢測(cè)獲得共振角的改變程度 便可以對(duì)配體濃度進(jìn)行定量 CompanyLogo 6 SPR生物傳感技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域 生物大分子的相互作用 腫瘤研究免疫學(xué)和傳染病神經(jīng)科學(xué)生物制藥蛋白質(zhì)組學(xué) CompanyLogo 7 Biacore可研究的生物分子范圍 蛋白質(zhì)DNA RNA脂類(lèi) 脂質(zhì)體 生物膜多糖多肽小分子全細(xì)胞 病毒 微生物 CompanyLogo 8 可分析的對(duì)象 CompanyLogo 9 Biacore核心組件 CompanyLogo 10 Biacore提供的生物分子相互作用信息 有無(wú)結(jié)合 YesorNo 結(jié)合的特異性和選擇性 Specificity 兩種分子的結(jié)合強(qiáng)度 親和力 Affinity 結(jié)合和解離的快慢和復(fù)合體的穩(wěn)定性 動(dòng)力學(xué) Kinetics 功能復(fù)合體形成的參與者 協(xié)同者和組裝順序 Mechanism 分子結(jié)合的溫度與熱力學(xué)特征 Thermodynamics 目標(biāo)分子活性含量的檢測(cè) Concentration CompanyLogo 11 SPR光學(xué)組件 CompanyLogo 12 微流控系統(tǒng) IFC 集成化 自動(dòng)化的微流路控制系統(tǒng)樣品消耗量低為互相作用分析而設(shè)計(jì)優(yōu)化 CompanyLogo 13 微流控系統(tǒng) IFC 流動(dòng)池 IFC上有4個(gè)流動(dòng)池可選擇單獨(dú) 配對(duì) 串聯(lián)使用 流動(dòng)池為配對(duì)使用進(jìn)行了優(yōu)化 Fc1 Fc2 Fc3 Fc4 CompanyLogo 14 傳感芯片 CompanyLogo 15 傳感芯片 CompanyLogo 16 葡聚糖表面 親水性溫和型 和2 濃度的葡聚糖水溶液環(huán)境相似非特異性結(jié)合量低高結(jié)合容量易于進(jìn)行共價(jià)結(jié)合出色的化學(xué)穩(wěn)定性 CompanyLogo 17 傳感芯片的選擇 11種不同的芯片種類(lèi)CM5 CM4 CM3 芯片 蛋白 肽段 小分子等CM7 小分子化合物研究SA芯片 生物素標(biāo)記的分子 如核酸 糖類(lèi)等BiotinCAP芯片 可逆性生物素捕獲芯片NTA芯片 His重組蛋白L1芯片 模擬脂質(zhì)雙分子層環(huán)境HPA芯片 實(shí)現(xiàn)膜系統(tǒng)相關(guān)的互作分析C1芯片 研究細(xì)胞 病毒等大顆粒分子Au裸金芯片 客戶(hù)定制表面 材料 高分子等 30余種不同的試劑盒及緩沖液產(chǎn)品 氨基偶聯(lián)試劑盒 巰基偶聯(lián)試劑盒 GST捕獲試劑盒GST重組蛋白分析 NTA捕獲試劑盒His重組蛋白分析 CompanyLogo 18 最常用的傳感芯片 CM5傳感芯片 CompanyLogo 19 Biacore實(shí)驗(yàn)的基本流程 CompanyLogo 20 分析物和配體的定義 固定配體 Immobilization CompanyLogo 21 樣品進(jìn)樣 Injection 分析物 Analyte 進(jìn)樣后 以恒定的流速和濃度流過(guò)芯片表面樣品中的待分析物與固定在芯片表面上的配體發(fā)生結(jié)合 芯片表面物質(zhì)的質(zhì)量發(fā)生改變 儀器記錄下對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值 response 的改變進(jìn)樣結(jié)束后 切換緩沖液流過(guò)芯片表面 分析物由配體上自發(fā)解離 解離的進(jìn)程由響應(yīng)值實(shí)時(shí)監(jiān)控 CompanyLogo 22 芯片再生 Regeneration 將自發(fā)解離后仍然結(jié)合于配體的分析物徹底洗掉 配體的結(jié)合活性必須保留 CompanyLogo 23 傳感圖 TheSen