載脂蛋白CIII鏈接高脂血癥與血管內(nèi)皮細胞功能障礙

歡迎大家參加讀書報告會 三亞市人民醫(yī)院陳林2013 08 載脂蛋白CIII鏈接高脂血癥與血管內(nèi)皮細胞功能障礙 Contents Background 富含甘油三酯的VLDLapoCIII在IR MS合并富含甘油三酯的LDL血脂異常 PKC 損害血管內(nèi)皮細胞對胰島素的反應激活血管內(nèi)皮細胞的炎癥和動脈粥樣硬化的信號建立假說apoC 影響血管內(nèi)皮細胞胰島素信號和其功能 MethodsandResults apoC 抑制胰島素誘導IRS 1酪氨酸磷酸化 減少HUVECsPI3K Akt的活化 apoC 使eNOS活化受到影響 減少NO釋放到介質(zhì)中 1 2 3 4 apoC 激活HUVECs的PKC 導致IRS 1通過絲氨酸磷酸化功能障礙 apoC 通過PKC 激活絲裂原活化蛋白激酶 MethodsandResults PKC 抑制劑或MEK1抑制劑修復受損胰島素信號 apoC 和富含apocIII的VLDL損害了小鼠主動脈和HUVECs胰島素信號 但他可被PKC 抑制劑修復 總結(jié) 5 6 7 同時 它們還抑制小鼠主動脈內(nèi)皮依賴性舒張 VLDL中的apoCIII激活PKC 抑制IRS 1 PI3K Akt eNOS通路 損害血管內(nèi)皮細胞 誘導血管內(nèi)皮功能紊亂 損害胰島素刺激NO的產(chǎn)生 Conclusion 對于AS來說 apoCIII是鏈接血脂代謝紊亂和胰島素抵抗對血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生間接有害影響的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié) Foreword 載脂蛋白CIII是一種小分子蛋白 以多種形式存在于VLDL表面 少部分存在于LDL表面 apoC 抑制VLDL和LDL從血漿中清除 造成致AS的脂蛋白和富含apoC 的LDL TG CH在血漿中集聚 延長AS脂蛋白在血漿中停留時間 這些在DM和AS血脂異常中更為明顯 人群研究表明apoC 與CHD風險之間的相關(guān)性可能歸因于apoC 直接參與了AS的形成 血漿中含有apoC 的VLDL和LDL水平用來預測CVD的風險 Foreword 我們最近研究表明 1 富含apoC 的VLDL比無apoCIII停留時間長 2 apoC 對血管細胞有直接的促炎 致AS的作用 3 apoC 激活了單核細胞和內(nèi)皮細胞增加他們在AS中的相互黏附作用 ClinicalPerspective 內(nèi)皮障礙 NO利用 EH AS 舒張 抗AS 正常 異常 IR IRS1 PI3K 胰島素靶組織 胰島素 NO生物利用度 eNOS激活 NO 強效舒血管抗AS 絲裂原活化蛋白激酶激活 胰島素抵抗 高胰島素血癥 內(nèi)皮素1 刺激分泌 ET1 強效血管收縮劑 胰島素 x 內(nèi)皮細胞功能障礙 血脂異常 MS apoCIII apoCIII apoCIII apoCIII apoCIII apoCIII apoCIII 啟動子負向調(diào)控胰島素 胰島素作用受損 有聯(lián)系 PKC 激活 抑制胰島素激活 損傷胰島素信號 NO apoCIII導致AS和其連接的血脂異常與血管內(nèi)皮細胞功能紊亂機制 apoCIII Methods1CellCultureandReagents 人臍靜脈內(nèi)皮細胞 HUVEC 培養(yǎng)并檢測 載脂蛋白用高效液相色譜和免疫親和柱色譜法從人血漿中純化 載脂蛋白中內(nèi)毒素水平采用鱟變形細胞溶解產(chǎn)物顯色試驗法測定 小于0 03EU ml 載脂蛋白中游離脂肪酸 FFA 使用酶法測定水平 20nmol l 抗載脂蛋白抗體PD98059 渥曼青霉素 PKC 特異性抑制劑胰島素 Methods2LipoproteinPreparation 10名健康志愿者 禁食12小時采血 受試者沒有服用心血管藥物 抗氧化劑 激素 涉及人體受試者倫理問題遵守東京醫(yī)科齒科大學人權(quán)委員會協(xié)議的準則 VLDL中的載脂蛋白水平通過ELISA進行測定 通過酶法測定VLDL甘油三酯水平 VLDL中內(nèi)毒素水平 0 03EU ml 分離 含apoCIII的VLDL 無apoCIII的VLDL EDTA Methods3Immunoblotting 使用apoC 和有apoCIII的VLDL來孵育HUVECs 然后使用胰島素刺激 使用抗PKC I抗體 抗PKC II抗體與膜結(jié)合的蛋白對PKC的激活進行檢測 Methods4 量化NO和ET 1培養(yǎng)基中或血漿NO水平測定按照制造商試劑盒的說明書通過一氧化氮比色法進行測試 培養(yǎng)基中的ET 1水平測定通過ELISA試劑盒 酶聯(lián)免疫試劑盒 進行測定 體內(nèi)apoC 刺激請參閱在線數(shù)據(jù)補充的材料和方法部分 等距張力測量請參閱補充材料和方法部分 Methods5StatisticalAnalysis 結(jié)果采用平均值 標準差 用非配對t檢驗對數(shù)據(jù)進行分析或雙因素方差分析 P 0 05認為有統(tǒng)計學意義 Results1 ApoCIIIInhibitsInsulin StimulatedIRS 1TyrosinePhosphorylationinHUVECs 通過胰島素刺激 胰島素受體激活血管內(nèi)皮細胞PI3K Akt信號 使IRS 1酪氨酸磷酸化 A 使用不同濃度apoCIII來孵育HUVECs30分鐘后 使用胰島素刺激 劑量依賴性 B 使用相同濃度apoCIII用不同時間來孵育HUVECs 然后使用胰島素刺激 孵育時間不同C 使用apoCIII來孵育HUVECs然后使用胰島素刺激 加入apoCIII變化不大 說明apoCIII不影響IR 磷酸化 胰島素增加IR 磷酸化 間接推出apoCIII影響下游的IR Results2 ApoCIIIInhibitsInsulin StimulatedPI3K AktandeNOSActivationinHUVECs 圖 使用一定濃度的apoC 或渥曼青霉素 wort 來孵育HUVECs 然后使用胰島素刺激 apoCIII濃越高PI3K磷酸化越低 apoCIII影響胰島素刺激PI3K的磷酸化 PI3K抑制劑wort消除了胰島素誘導eNOS活化以及NO釋放 A 不同濃度的apoC 孵育HUVECs PKC I II B C apoC 孵育HUVECs 然后使用胰島素刺激 對照組在孵育前30分鐘 向培養(yǎng)液中加入PKC 特異性抑制劑 Results3 ApoCIIIActivatesPKC inHUVECs PKC II是apoC 損傷胰島素信號轉(zhuǎn)導中心環(huán)節(jié) 不同亞型PKC介導炎癥和細胞事件 PKC活化 抑制胰島素誘導eNOS激活 導致血管舒張功能受損 apoC 激活PKC 誘導粘附分子表達上調(diào) A apoC 孵育HUVECs 然后使用胰島素刺激 B 對照組在孵育前30分鐘培養(yǎng)液中加入PKC 特異性抑制劑 胰島素誘導ERK活化 apo增強胰島素誘導ERK活化 apoCIII使pERK 抑制劑部分逆轉(zhuǎn) Results4ApoCIIIActivatesMAPKinaseinHUVECs C apoC 孵育HUVECs 在孵育前30分鐘向培養(yǎng)液中加入PKC 特異性抑制劑或PD98059 D E F apoC 孵育HUVECs 然后使用胰島素刺激 在孵育前30分鐘加入PKC 特異性抑制劑或PD98059 apoC 誘導IRS 1的Ser616磷酸化 被PKC 特異性抑制劑阻斷 被PD98059部分逆轉(zhuǎn) PD98059部分逆轉(zhuǎn)apoC 抑制NO釋放 提示ERK參與這一過程 apoC 增加了培養(yǎng)液中ET 1水平 可以被PKC 特異性抑制劑清除也可以被PD98059清除 這些結(jié)果表明apoC 通過胰島素抵抗這一特殊途徑促使或增加血管舒張和血管收縮之間的不平衡 Results4ApoCIIIActivatesMAPKinaseinHUVECs A B 使用不同濃度的apoC IV給小鼠 30分鐘后收集小鼠主動脈 C 使用apoC IV小鼠 在注射前30分鐘 IV PKC 特異性抑制劑 30分鐘后 收集主動脈 D F 使用apoC 靜脈注射給小鼠 在apoC 注射前30分鐘 使用PKC 特異性抑制劑IV 在30分鐘后 小鼠腹膜腔內(nèi)使用胰島素刺激 PKC 特異性抑制劑逆轉(zhuǎn)apoC 的抑制作用 它還修復了被apoC 減少的血漿NO水平 apoCIII在500ug時激活PKC II ERK apoC 使IRS 1Ser612磷酸化 被PKC 特異性抑制劑抑制 D E F 胰島素使pIRS 1Ser612 peNOS NO 被apoCIII抑制 PKC 抑制劑使其恢復 Results5ApoCIIIInhibitsInsulinSignalingintheAortasofC57BL 6JMice A B 對小鼠靜脈注射含有apoCIII的VLDL和無apoCIII的VLDL 30分鐘后 收集主動脈和血液 C 給小鼠靜脈注射含有apoCIII的VLDL 在注射apoC 的前30分鐘 使用PKC 特異性抑制劑IV 30分鐘后 收集主動脈 D E 對小鼠靜脈注射含有apoCIII的VLDL或無apoCIII的VLDL 在注射apoC 的前30分鐘使用PKC 特異性抑制劑IV 30分鐘后 使用胰島素腹膜內(nèi)注射 10分鐘后收集血液和主動脈 Results6VLDLCIII InhibitsInsulinSignalingintheAortasofC57BL 6JMice A B 含apoCIII的VLDL刺激PKC II激活和小鼠主動脈中IRS 1的Ser612的磷酸化 不含apoCIII的VLDL對此影響小 C 含apoCIII的VLDL刺激IRS 1的Ser612的磷酸化 PKC 抑制劑可部分抑制這一效應 D 胰島素使pTyr989 VLDLCIII 抑制這一效應 PKC 抑制劑使其恢復 E 胰島素使NO VLDLC 影響不明顯 VLDLC 使NO明顯 PKC 抑制劑使其恢復 A 將apoC 靜脈注射小鼠體內(nèi) 在注射apoC 的前30分鐘 使用PKC 特異性抑制劑 30分鐘后 分離主動脈做等距張力測量 B 靜脈注射含有apoCIII的VLDL或無apoCIII的VLDL 30分鐘后 分離主動脈做等距張力測量 PE 去氧腎上腺素CCh 卡巴膽堿 Results7ApoCIIIInhibitsEndothelium DependentRelaxationintheAortasofMice apoC 刺激小鼠離體主動脈環(huán)顯著地損傷了內(nèi)皮依賴性舒張 這些可被PKC 特異性抑制劑所修復 VLDLCIII 損傷了內(nèi)皮依賴性舒張 相反 不含apoCIII的VLDL對其影響小 Discussion1 目前第一次報道 apoCIII和富含apoCIII的VLDL引起血管內(nèi)皮細胞的胰島素抵抗 我們的證據(jù) 暴露于血管內(nèi)皮細胞中的apoCIII抑制胰島素刺激eNOS活性和NO產(chǎn)生 臨床研究 MS T2DM中胰島素抵抗與apoCIII相關(guān) 據(jù)報道 肝細胞中胰島素抵抗通過異常Foxo1造成apo產(chǎn)生過剩 我們研究結(jié)果表明 血清中apoC 的增加不只是胰島素抵抗的臨床表現(xiàn) 而且也是內(nèi)皮細胞中胰島素抵抗過程中的一個致病因子 Discussion2 VECs IRS1 PI3K Akt PKC 胰島素 激活 eNOS 胰島素抵抗 激活 Akt eNOS apoCIII 細胞黏附分子1表達 絲氨酸磷酸化 IRS 1功能 功能障礙 增加 apoCIII通過PKC 造成VECs功能障礙 apoCIII通過eNOS途徑激活MAPK 我們發(fā)現(xiàn) apoCIII ERK MAPK 胰島素 抑制劑逆轉(zhuǎn) MAPK影響eNOS通路 ET 1 NO apoC 造成血管收縮 血管舒張之間不平衡 Discussion3 肝細胞中的胰島素抵抗增加apoCIII產(chǎn)生和其分泌到血液中 富含甘油三酯脂蛋白中apoC 通過抑制IRS 1在血管內(nèi)皮細胞的功能又削弱胰島素誘導NO的產(chǎn)生 apoC 抑制NO產(chǎn)生的作用 可能是間接通過激活PKC II 部分是ERK 從而誘發(fā)IRS 1的絲氨酸磷酸化 Discussion4apoC 引起血管內(nèi)皮細胞胰島素抵抗的機制 Discussion5apoCIII誘導VECs功能障礙 本實驗 小鼠 apoCIII損傷 VECs中 胰島素信號 先前實驗 人 口服負荷量脂肪 血脂異常者 健康受試者 VECs功能紊亂 細胞粘附分子 現(xiàn)有理論 apoCIII影響脂肪分解代謝 高脂血癥 VECS急性直接影響 apoCIII induced 內(nèi)皮細胞功能障礙 鼠主動脈胰島素信號 內(nèi)皮依賴性舒張 Discussion6apoCIII的濃度相關(guān)性 研究表明 apoC 在100微克 毫升時損傷血管內(nèi)皮細胞胰島素信號 造成血管內(nèi)皮功能障礙 流行病學研究 apoCIII的風險從較低水平開始呈梯度分布 apoCIII越高 風險越高 臨床研究支持 apoC 濃度與內(nèi)皮細胞的功能相關(guān) Discussion7apoCIII與胰腺細胞 研究表明 apoC 使小鼠胰島素分泌受到損傷 這與apoCIII造成培養(yǎng)基中胰腺 細胞凋亡相一致 本研究還發(fā)現(xiàn) apoC 對胰島素信號的影響與細胞類型的特異性相關(guān) Conclusion 高甘油三酯血癥與VECs功能障礙的相關(guān)性已經(jīng)明白 FFA和富含甘油三酯的脂蛋白削弱胰島素的作用和 或內(nèi)皮功能障礙 我們的研究闡明了一個新機制 富