抗體工程要點(diǎn)ppt課件

抗體工程 抗原的來源 生物組織純化蛋白的純化方法 1 離子交換2 凝膠過濾3 親和層析4 輸水作用層析等 抗原的來源 人工合成 化學(xué)方法 1 半抗原的合成2 抗原多肽的合成 多肽合成儀 抗原的來源 蛋白的重組表達(dá)1 原核細(xì)胞的表達(dá)方法 大腸桿菌 枯草桿菌 2 酵母細(xì)胞的真核表達(dá)方法 甲醇畢赤酵母的重組表達(dá) 3 昆蟲細(xì)胞的表達(dá) 桿狀病毒表達(dá)載體 4 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá) CHO HEK293 5 抗原的單獨(dú)表達(dá)和融合表達(dá) 6 表達(dá)標(biāo)簽 TAG Fc標(biāo)簽 HIS標(biāo)簽 FLAG標(biāo)簽 DYKDDDDK C MYC標(biāo)簽 GST標(biāo)簽等 原核表達(dá)系統(tǒng) 質(zhì)粒 1 多克隆位點(diǎn) MCS 2 抗性基因3 啟動(dòng)子 P 4 復(fù)制起始位點(diǎn) Ori 原核細(xì)胞的表達(dá) 操縱子表達(dá)模型與啟動(dòng)子 酵母真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn) 操作簡便 表達(dá)量高 培養(yǎng)條件簡單 易于純化 N 端可能會(huì)有氨基酸缺失 存在過量糖基化的可能 昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系 CHO細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞系 293細(xì)胞載體 原核載體骨架真核啟動(dòng)子增強(qiáng)子多克隆位點(diǎn)PolyA信號(hào)真核細(xì)胞篩選標(biāo)志加壓篩選基因 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn) 可以分泌表達(dá) 活性高 純化步驟可能比較復(fù)雜 糖基化比較正常 成本較高 表達(dá)量偏低 周期較長 可以建立無血清培養(yǎng)的方法 第三章抗體分子的結(jié)構(gòu)和分類 CDR區(qū) 互補(bǔ)決定區(qū)FR區(qū) 框架區(qū)重鏈分子量 450 550個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成 45 70kd輕鏈分子量 大約214個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成 22 24kd 抗體分子片段 抗體分子的分類 IgA和IgM的J鏈 IgA的分泌片IgG 1 2 3 4 bacteria Ab antigenaggregatesareingestedbyphagocyticcells Whatcanantibodiesdo Xenotransplantation Autoimmunodiseases 特殊的抗體分子 卵黃抗體IgY 由兩條重鏈 H 和輕鏈 L 組成 重鏈 由一個(gè)可變區(qū) V 和4個(gè)恒定區(qū) C 組成 沒有鉸鏈結(jié)構(gòu) 完整分子量為180KDa 7 8S 重鏈為67 70KDa 輕鏈為25KDa 但還存在一個(gè)小體積副本 120KDa 5 7S 發(fā)現(xiàn)于野鴨和某些龜類中 克隆IgYH鏈表明 較小的IgYH鏈缺乏C3 C4區(qū) 稱為IgY Fc 單域抗體 特點(diǎn) 1 見于駝?lì)悇?dòng)物 軟骨魚類2 沒有輕鏈多肽 3 CDR3區(qū)較長 4 駝?lì)悊斡蚩贵w沒有CH1 5 去除Fc片段后稱為納米抗體 抗體的生物學(xué)功能 特異性的結(jié)合抗原激活補(bǔ)體結(jié)合Fc受體1 調(diào)理吞噬作用 巨噬細(xì)胞 2 介導(dǎo)過敏反應(yīng) 肥大細(xì)胞 3 ADCC作用 NK細(xì)胞 單核細(xì)胞 4 穿過胎盤和粘膜5 免疫調(diào)節(jié) 抗體的來源 抗體的定義抗體的發(fā)現(xiàn) 1888年EmileRoux和AlexanderYersin發(fā)現(xiàn)了白喉毒素 1890年VonBehring發(fā)現(xiàn) 白喉毒素或者破傷風(fēng)毒素免疫動(dòng)物后 血液中可以產(chǎn)生阻止毒素誘發(fā)疾病的物質(zhì) 稱為抗毒素 antitoxin 電泳分析gamma球蛋白 并不全是抗體 1972年世界衛(wèi)生組織和國際免疫學(xué)聯(lián)合會(huì)把具有抗體活性及化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體類似的一類球蛋白 統(tǒng)一命名為免疫球蛋白 immunoglobulin 人血清球蛋白的電泳圖譜 白蛋白a1a2bg 白蛋白a1a2bg 抗體生成的理論 1897年 PaulEhrlich提出了側(cè)鏈學(xué)說 他認(rèn)為細(xì)胞表面有特異性受體分子 可以釋放的血液里面 就是抗毒素 抗體 1930年 Breinl和Haurowitz提出模板學(xué)說 認(rèn)為抗原是抗體合成的模板 1955年 Jerne提出天然抗體選擇學(xué)說 抗原抗體的復(fù)合物刺激細(xì)胞產(chǎn)生更多針對(duì)該抗原的抗體 1958年 Macfarlane Burnet DavidTalmadge和Joshua提出了克隆選擇學(xué)說 每一個(gè)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞克隆 B細(xì)胞 只能產(chǎn)生一種抗體 抗原與B細(xì)胞表面的膜型抗體分子結(jié)合 刺激B細(xì)胞的增殖分化 漿細(xì)胞 生產(chǎn)更多的抗體 Clonalselectiontheory 細(xì)胞凋亡 apoptosis Caspase 細(xì)胞自噬 autophagy 溶酶體 人體內(nèi)可以產(chǎn)生10E12以上不同的抗體分子 為什么 第四章抗體的基因及其表達(dá) 抗體重鏈基因簇 IgH 14號(hào)染色體 1 5Mb抗體輕鏈Kappa基因簇 IgK 2號(hào)染色體 800kb 抗體輕鏈Lamda基因簇 IgL 22號(hào)染色體 700kb 抗體重鏈的基因及其表達(dá) V基因 51個(gè)J基因 6個(gè)D基因 27個(gè)C基因 10個(gè) RNAalternativesplicing 輕鏈的基因與重排 V基因 30個(gè)J基因 4個(gè)C基因 4個(gè)V基因 40個(gè)J基因 5個(gè)C基因 1個(gè) 抗體基因重排的機(jī)制 RSS rearrangementsignalsequence重排信號(hào)序列12 23規(guī)則RAG recombinationactivatinggeneRAG1和RAG2異源二聚體TdT terminaldeoxynucleotidyltransferase末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 抗體類別的轉(zhuǎn)換 S區(qū)介導(dǎo)的二次重排 switchingregion 除了Cd外 其它C基因前都有S區(qū)序列 抗體多樣性的原因 多種不同的基因片段 不同重鏈和輕鏈的隨機(jī)取用和組合 VDJ基因片段重組時(shí)連接的多樣性 連接區(qū)的核苷酸插入 體細(xì)胞的高突變頻率 抗原與抗體的相互作用 6個(gè)CDR區(qū) 非共價(jià)結(jié)合抗原 空間可變結(jié)構(gòu)的結(jié)合 作用特點(diǎn) 特異性可逆性有量效關(guān)系 抗體的制備 多克隆抗體 抗血清血清與血漿抗體的滴度單克隆抗體 由單一細(xì)胞克隆分泌的 識(shí)別同一個(gè)抗原決定簇 結(jié)構(gòu)與功能都完全相同的抗體 基因工程抗體 通過基因工程方法生產(chǎn)或者改造過的抗體分子 一般采用工程細(xì)胞進(jìn)行表達(dá) 免疫血清的制備方法 免疫血清的要求 效價(jià)高 特異性強(qiáng) 抗原的純度免疫佐劑抗原的分類 顆粒型 可溶膠體 抗原和半抗原 40kd 半抗原6000以下 抗原的純化方法 層析 電泳 半抗原與載體蛋白的偶聯(lián) 常用的載體蛋白 BSA OVA KLH偶聯(lián)機(jī)制 1 形成酰胺鍵2 氨基間形成連接橋 NH R NH 3 形成偶氮鍵 N N 如酪氨酰 組氨酰 賴氨酰殘基間 4 對(duì)于沒有羰基和氨基的半抗原 引入連接基 spacer 再與蛋白偶聯(lián) 甲醛等 佐劑的使用 氫氧化鋁佐劑 適合人用疫苗 明礬佐劑石蠟油 羊毛脂等 抗原的乳化方法 1 研磨法2 注射器乳化法3 超聲乳化4 復(fù)合乳劑 增加2 的Tween 20生理鹽水 機(jī)械或者超聲乳化 動(dòng)物的免疫 需要考慮動(dòng)物種系 抗原劑量 免疫途徑 加強(qiáng)免疫的時(shí)間 免疫次數(shù)和佐劑的使用 用于免疫的動(dòng)物 兔 大鼠 小鼠 豚鼠 綿羊 山羊 雞 山羊 馬 驢 猴等 1 抗原與動(dòng)物種屬的關(guān)系2 動(dòng)物的生理狀態(tài)3 血清的用量抗原的用量 兔0 5 1mg kg體重 小鼠 10 100ug 免疫途徑 靜脈 脾臟 淋巴結(jié) 腹腔 肌肉 皮下 皮內(nèi) 加強(qiáng)免疫 boost 每隔2 3周免疫1次 2 3次后 1周后檢測(cè)血清中的抗體滴度 然后可以放血 制備抗體 免疫方案 皮下多點(diǎn)注射 第1次福氏完全佐劑 后面福氏不完全佐劑 福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑的成分 福氏完全佐劑的制備 使用前在福氏不完全佐劑中加入適量殺死的分枝桿菌 抗體在動(dòng)物血清中的表達(dá)水平 多克隆抗體的制備和保存 動(dòng)物的放血 心臟取血 耳緣靜脈采血 兔 尾尖取血 眼底取血 小鼠 大鼠 頸靜脈取血 大型動(dòng)物 羊 羊駝 處死動(dòng)物取血的方法 頸動(dòng)脈取血 摘眼球取血 血清的分離 冰箱放置過夜 3000rpm 30min 吸取血清 加入疊氮鈉或者硫柳汞防腐劑 20或者 80度長期保存 多克隆抗體的粗提 辛酸飽和硫酸銨沉淀法 將待提取樣品用60mmol L pH4 0醋酸緩沖液稀釋3 4倍 調(diào)pH至4 5 對(duì)含脂質(zhì)較高的標(biāo)本可采用二氧化硅粉或玻璃纖維吸附法除去脂質(zhì) 在室溫下邊攪拌邊緩慢加入正辛酸 按每ml樣品中加25 l 若樣品體積小于5ml 則每ml樣品內(nèi)加入30 l正辛酸 攪拌30min 10000 g離心30min 取上清液通過定性濾紙過濾 裝人透析袋 用20倍體積的PBS 4 透析過液 中間換液3 4次 然后每毫升混合液加0 27g硫酸銨 攪拌30min 以5000g離心15min 收集沉淀物 溶于少量PBS中 再以15000 g離心20min 上清液即為提取的Ig 其中大部分為IgG 約占90 少量為IgA及IgM 回收率 80 整個(gè)操作可在24h內(nèi)完成 DEAE纖維素精制多克隆抗體 蛋白標(biāo)本對(duì)0 005mol L pH8 6Tris PO4透析 DE52裝柱 并以0 005mol L pH8 6Tris PO4平衡 加樣 以0 005mol L pH8 6Tris PO4洗脫 紫外監(jiān)測(cè)直至洗脫液280nmOD回到基線 這一步驟可除去血清中其他蛋白 以350ml 0 055mol L pH6 0Tris PO4洗脫 這一步驟可用于純化血清IgG和IgM 以125ml 0 055mol L pH6 0Tris PO4和125ml0 5mol L pH5 1Tris PO4梯度洗脫 總量收集250ml 重復(fù)步驟 5 根據(jù)280nm峰值合并蛋白峰 對(duì)PBS透析 PEG濃縮 20度保存 蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) 單克隆抗體的制備 單克隆抗體的定義 序列 結(jié)構(gòu) 功能 抗原結(jié)合性質(zhì)都完全相同的抗體 來源 雜交瘤細(xì)胞表面展示抗體文庫單一B細(xì)胞 單克隆抗體來源的圖示 骨髓瘤細(xì)胞SP2 0 1 HGPRT基因缺陷2 TK基因缺陷3 不分泌抗體 細(xì)胞融合的方法 病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合PEG介導(dǎo)的細(xì)胞融合電融合 HAT培養(yǎng)基在雜交瘤細(xì)胞篩選中的作用 HAT選擇培養(yǎng)基的作用是篩選出 雜交瘤細(xì)胞 HAT選擇培養(yǎng)基含有次黃嘌呤 氨基喋呤和胸腺嘧啶 其中氨基喋呤可阻斷DNA合成的主要途徑 主要途徑阻斷后 依靠應(yīng)急途徑即在HGPRT 次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 和TK 胸苷激酶 作用下 利用胸腺嘧啶和次黃嘌呤合成DNA 缺少其中一種 DNA合成不能發(fā)生 用于雜交的骨髓瘤細(xì)胞系均由經(jīng)有毒藥物誘導(dǎo)而成選擇產(chǎn)生的代謝缺陷型細(xì)胞 細(xì)胞內(nèi)均無TK或HGPRT 所以單個(gè)或融合骨髓瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)液中將死亡 B細(xì)胞雖然有HGPRT和TK 但在體外通常培養(yǎng)條件下 尤其是在單個(gè)細(xì)胞環(huán)境下難于長期存活和增殖傳代 因此只有雜交瘤細(xì)胞才能在HAT培養(yǎng)液中生長繁殖 單克隆的篩選 液體有限稀釋法 細(xì)胞計(jì)數(shù) 半固體培養(yǎng)基法 單克隆抗體的鑒定 ELISA方法的原理 包被抗原加入培養(yǎng)基酶標(biāo)二抗 小鼠單克隆抗體的制備 雜交瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng) RPMI1640培養(yǎng)基產(chǎn)量較低 條件要求比較嚴(yán)格 可以放大 小鼠腹水的生產(chǎn)方法 1 腹腔接種降植烷或液體石蠟 每只小鼠0 3 0 5ml 2 7 10天后腹腔接種用PBS或無血清培養(yǎng)基稀釋的雜交瘤細(xì)胞 每只小鼠5 105 0 2ml 3 間隔5天后 每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況 如腹部明顯膨大 以手觸摸時(shí) 皮膚有緊張感 即可用16號(hào)針頭采集腹水 一般可連續(xù)采2 3次 通常每只小鼠可采5 10ml腹水 4 將腹水離心 2000r min5分鐘 除去細(xì)胞成分和其他的沉淀物 收集上清 測(cè)定抗體效價(jià) 分裝 70 凍存?zhèn)溆?或凍干保存 噬菌體抗體庫Surfacedisplayantibodylibrary 噬菌體展示庫Phagedisplaylibrary M13噬菌體的組裝 M13噬菌體抗體展示載體 重鏈和輕鏈在大腸桿菌膜周質(zhì)組裝成Fab 酵母展示技術(shù)Yeastdisplaylibrary 篩選方法 FACS 核糖體展示文庫Ribosomedisplaylibrary 抗體文庫篩選的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) 周期短 成本低缺點(diǎn) 抗體庫的容量有限 親和力低 需要體外突變以提高抗體的親和力 invitromaturation 可能引入新的免疫原性 單一B細(xì)胞篩選的方法 B細(xì)胞篩選的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) 來源于人體 免疫原性最低 缺點(diǎn) 來源有限 可能只適用于一些傳染性疾病抗體的篩選 對(duì)于自身免疫病和腫瘤相關(guān)的抗原篩選比較困難 轉(zhuǎn)基因小鼠篩選全人單克隆抗體 小鼠內(nèi)源基因的敲除 knockout EScell Chimericmouse EScellsinmedium Homologousrecombination Blastcystmicroinjection 抗體的標(biāo)記技術(shù) 同位素標(biāo)記酶標(biāo)記 堿性磷酸酶 AP 辣根過氧化物酶 HRP 熒光素標(biāo)記 FITC 羅丹明 quantumdot 量子點(diǎn) AlexaFlor488 650nm 生物素標(biāo)記 biotin avidin strepavidin 鏈親和素 膠體金標(biāo)記技術(shù) 氯金酸 檸檬酸還原 抗體的應(yīng)用 檢測(cè) RIAEIAELISA免疫熒光免疫組化 EIA和ELISA 抗原或抗體的檢測(cè) 競(jìng)爭性EIA 膠體金試紙條 定性檢測(cè) 電化學(xué)發(fā)光檢測(cè) ECILA 是利用電化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記的抗原或抗體與待測(cè)物經(jīng)過一系列的免疫反應(yīng)和洗滌等理化步驟 最后用光學(xué)儀器測(cè)量免疫反應(yīng)前后電化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度的改變 從而對(duì)抗原或抗體物質(zhì)進(jìn)行定量分析的一種方法 當(dāng)反應(yīng)體系中加入電子供體三丙胺后 在電場(chǎng)作用下 釕分子和三丙胺在電極表面分別被氧化成三價(jià)釕和帶陽離子的自由基三丙胺 后者很不穩(wěn)定 迅速失去一個(gè)質(zhì)子形成強(qiáng)還原劑自由基三丙胺 將三價(jià)釕分子還原成激發(fā)態(tài)的二價(jià)釕 其自身則被氧化成二丙胺和丙醛 接著激發(fā)態(tài)的釕分子衰減成基態(tài)釕分子 同時(shí)放出一個(gè)波長為 的光子 這一過程在電極表面以每毫秒幾十萬次的速度循環(huán)進(jìn)行 產(chǎn)生的光子經(jīng)光電倍增管檢測(cè)光強(qiáng)度 從而測(cè)出待檢抗體或抗原的含量 免疫 PCR PCR免疫檢測(cè)方法 噬菌體免疫PCR 組織切片與免疫組化 熒光 冷凍切片 石蠟切片1 取材2 固定3 水洗4 脫水包埋5 切片6 展片7 撈片8 鋪片9 染色10 封片11 觀察 FACS florescenceactivatedcellsorting MACS magneticactivatedcellsorting 蛋白質(zhì)芯片的原理與檢測(cè) 1 二抗檢測(cè) 顯色 熒光或發(fā)光 2 質(zhì)譜檢測(cè) 不同水平的基因表達(dá)調(diào)控 microRNA Alternativesplicing Histoneacetylationandmethylation DNAmethylation 1 Phosphorylation2 Glycolysation3 ubiquitination 免疫共沉淀 Co IP Ch IP 染色體免疫共沉淀 Westernblot 抗體藥物 治療領(lǐng)域 傳染性疾病 埃博拉病毒自身免疫性疾病 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎腫瘤 乳腺癌 胃癌 結(jié)腸癌作用機(jī)理 1 ADCC作用殺死腫瘤細(xì)胞2 CDC作用3 阻斷腫瘤細(xì)胞內(nèi)的血管新生4 阻斷腫瘤生長的信號(hào)通路5 解除腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制作用代謝性疾病 骨質(zhì)疏松 糖尿病 抗病毒作用 自身免疫性疾病 腫瘤的治療 ADCC作用 腫瘤治療 CDC效應(yīng) 腫瘤的血管新生 腫瘤自分泌生長因子 腫瘤的免疫檢查點(diǎn) 代謝性疾病的治療 抗體藥物的研發(fā) 選擇疾病類型選擇相關(guān)的抗原選擇研發(fā)的方向 仿制藥 創(chuàng)新藥 選擇抗體的來源 鼠源 人源 選擇抗體的表達(dá)方式 酵母 CHO 轉(zhuǎn)基因植物 藻類細(xì)胞 人源細(xì)胞 選擇生產(chǎn)的工藝 不銹鋼 一次性袋子 選擇細(xì)胞培養(yǎng)的工藝 灌流 流加 發(fā)酵罐 WAVE 細(xì)胞培養(yǎng)的方式 灌流 流加 抗體的純化 抗體仿制藥的研發(fā) 文獻(xiàn)的調(diào)研 化合物專利 純化專利 制劑專利 組合物專利等 原研藥的鑒定 氨基酸序列 原研藥的采購 蛋白質(zhì)的N 端測(cè)序 Edman化學(xué)降解 其基本原理是包括通過異硫氰酸苯脂與蛋白質(zhì)和多肽的N 端殘基的偶聯(lián) 苯氨基硫甲酰酞 PTC 肽 環(huán)化裂解 和噻唑呤酮苯氨 ATZ 轉(zhuǎn)化為苯異硫尿氨基酸 PTH 氨基酸 三個(gè)主要的化學(xué)步驟 每個(gè)循環(huán)從蛋白質(zhì)與多肽裂解一個(gè)氨基酸殘基 同時(shí)暴露出新的游離的氨基酸進(jìn)行下一個(gè)Edman降解 最后通過轉(zhuǎn)移的PTH 氨基酸鑒定實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)序列的測(cè)定 高表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建 cellpool 高表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建 單克隆的篩選 抗體編碼DNA序列的優(yōu)化原則 GC含量密碼子使用偏性隨機(jī)性RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)終止密碼子的選擇 雙終止密碼子 DNA的人工合成與序列分析 人基因組DNA的GC含量 40 抗體分子DNA序列的優(yōu)化 密碼子偏性 抗體DNA序列的優(yōu)化 RNA二級(jí)結(jié)構(gòu) 表達(dá)載體的構(gòu)建 GCCACCATGG Kozaktranslationinitiationsequence 信號(hào)肽的選擇 抗體的分泌步驟 CHO細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)染 1 陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法 2 電轉(zhuǎn)法 CHO細(xì)胞培養(yǎng) CD培養(yǎng)基的主要成分 Theconstituentsofachemicallydefinedmediainclude abasalmedia suchasDMEM F12 orRPMI1640 containingaminoacids vitamins inorganicsalts buffers antioxidantsandenergysources whichissupplementedwithrecombinantalbumin chemicallydefinedlipids recombinantinsulinand orzinc recombinanttransferrinoriron seleniumandanantioxidantthiolsuchas2 mercaptoethanolor1 thioglycerol 氨基酸 氨基酸氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位 不同種類的細(xì)胞對(duì)氨基酸的要求各異 但有幾種氨基酸細(xì)胞自身不能合成 必須依靠培養(yǎng)液提供 這幾種氨基酸稱為必需氨基酸 其中谷氨酰胺是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸 在缺少谷氨酰胺時(shí) 細(xì)胞生長不良而死亡 因此 各種培養(yǎng)液中都有較大量的谷氨酰胺 但是 由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定 應(yīng)置于 20 冰箱中保存 在使用前加入培養(yǎng)液內(nèi) 已含谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4 冰箱中儲(chǔ)存2周以上時(shí) 還應(yīng)重新加入原來量的谷氨酰胺 碳水化合物和無機(jī)鹽 碳水化合物碳水化合物是細(xì)胞生長主要能量來源 其中有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分 主要有葡萄糖 核糖 脫氧核糖 丙酮酸鈉和醋酸等 無機(jī)鹽培養(yǎng)液中無機(jī)鹽的主要功能是幫助細(xì)胞維持滲透壓平衡 此外 通過提供鈉 鉀和鈣離子 幫助細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞膜功能 培養(yǎng)液的滲透壓是一個(gè)非常重要的因素 細(xì)胞通?？赡褪?60mOsm kg 320mOsm kg 標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液的滲透壓在此范圍內(nèi)波動(dòng) 特別注意 向培養(yǎng)液中加入其它物質(zhì)有可能會(huì)明顯改變培養(yǎng)液的滲透壓 特別是溶于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿中的物質(zhì) 向培養(yǎng)液中添加HEPES時(shí)需調(diào)節(jié)鈉離子濃度 緩沖系統(tǒng)和維生素 緩沖系統(tǒng)大多數(shù)細(xì)胞所需pH在7 2 7 4 但是 細(xì)胞培養(yǎng)最適pH值隨培養(yǎng)的細(xì)胞種類不同而不同 成纖維細(xì)胞喜歡較高pH 7 4 7 7 而傳代轉(zhuǎn)化細(xì)胞系則需要偏酸pH 7 0 7 4 由于多數(shù)培養(yǎng)液靠碳酸氫鈉 NaHCO3 與CO2體系進(jìn)行緩沖 因此 氣相中的CO2濃度應(yīng)與培養(yǎng)液中碳酸氫鈉濃度相平衡 如果氣相或培養(yǎng)箱空氣中CO2濃度設(shè)定在5 培養(yǎng)液中NaHCO3的加入量為1 97g L 如果CO2濃度維持在10 培養(yǎng)液中NaHCO3的加入量為3 95g L 細(xì)胞培養(yǎng)瓶蓋不應(yīng)擰得太緊 以保證氣體交換 HEPES是一種非離子緩沖液 在pH7 2 7 4范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力 但是非常昂貴 在高濃度時(shí)對(duì)一些細(xì)胞可能有毒 HEPES緩沖液可與低水平的碳酸鈉 0 34g L 共用 以抵消因額外加入HEPES引起的滲透壓增加 在這種培養(yǎng)條件下 細(xì)胞培養(yǎng)瓶的蓋子應(yīng)擰緊 以防止培養(yǎng)液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中 大多數(shù)培養(yǎng)液中含有酚紅作為pH指示劑 酸性培養(yǎng)液呈橙黃色 堿性培養(yǎng)液呈深紅色 維生素在細(xì)胞培養(yǎng)中 盡管血清是維生素重要來源 但是許多培養(yǎng)基中添加了各種維生素以適合更多的細(xì)胞系生長 CHO細(xì)胞的培養(yǎng)工藝優(yōu)化 培養(yǎng)工藝的放大 溫度 攪拌轉(zhuǎn)速 PH 溶氧 泡沫和液面水平 培養(yǎng)工藝優(yōu)化和放大的DOE軟件 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化 氨基酸成分分析 全自動(dòng)生化分析儀 培養(yǎng)基的澄清過濾 碟片式離心機(jī) 1 進(jìn)料 2 排出口 輕相 3 向心泵 4 碟片 5 儲(chǔ)渣空間 6 排渣口 7 排渣活塞閥 8 離心捕集器 9 排出口 重相 10 噴嘴 11 計(jì)量注水 開啟水 12 定時(shí)器 在離心工藝開發(fā)過程中 有很多參數(shù)需要優(yōu)化 如補(bǔ)料的速度 離心機(jī)轉(zhuǎn)速 濾餅層的去除頻率等 這些參數(shù)會(huì)影響到細(xì)胞的穩(wěn)定性 處理的時(shí)間以及抗體收率等 可用通過優(yōu)化這些參數(shù)合理地使各種訴求達(dá)到平衡 切向流過濾 切向流過濾是指液體流動(dòng)方向與過濾方向呈垂直方向的過濾形式 傳統(tǒng)的液體死端過濾 deadend 是大部分微孔過濾 MF 微濾 包括除菌過濾所采用的過濾形式 其液體的流動(dòng)方向與過濾方向一致 隨著過濾的進(jìn)行 過濾膜表面形成的濾餅層或凝膠層厚度逐漸增大 流速逐漸降低 只能處理小體積的料液 對(duì)于較大規(guī)模的料液過濾時(shí) 就需要采用切向流過濾方式 液體流動(dòng)在過濾介質(zhì)表面產(chǎn)生剪切力 減小了濾餅層或凝膠層的堆積 保證了穩(wěn)定的過濾速度 切向流微濾系統(tǒng)主要應(yīng)用于生物工程領(lǐng)域下游處理 如取代離心機(jī)從發(fā)酵液中收集細(xì)胞及去除細(xì)胞碎片等 特別是賽多利斯的切向流MF系統(tǒng)因其能夠整體在位蒸汽滅菌 還可以應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)的無菌換液以及提高菌體分泌物表達(dá)收率 在培養(yǎng)過程中無菌條件下的連續(xù)換液 抗體的純化 蛋白A親和層析陰離子交換樹脂陽離子交換樹脂除菌過濾去病毒 低pH值 納濾 抗體原液 抗體的質(zhì)量分析 ProteinConcentration 70 9mg mL 63 0 77 0 Potency 100 80 125 ID immunoassay PassSE HLC MP 99 8 HMW 0 2 LMW 0 0 MP 99 CE SDS reduced HC LC 98 9 HC 66 8 LC 32 1 LC HC 98 CEX HPLC MP 89 6 Acidic 2 7 Basic 7 7 80 CEX HPLCID PassOsmolality 314mOsm kg 300 50 pH 5 2at24 6 C 5 0 5 4 Appearance ReportVolume 1 2mL average1 1525mL n 5 1mL Sub visibleParticulate 29particles container 10 m nomorethan6000 particles container 25 m nomorethan600 Sterility PassBacterialEndotoxin 0 2EU mL 5 0 CHOPELISA 4 4ppmProtein AELISA 0 5ppm 抗體的糖基化檢測(cè) 利用毛細(xì)管電泳和質(zhì)譜 CEMS 對(duì)重組單克隆抗體 mAb 糖基化進(jìn)行分析 此方法包括利用N 糖苷酶F PNGaseF 酶解mAb得到多糖 對(duì)多糖進(jìn)行熒光標(biāo)記 8 氨基吡 1 3 6 三磺酸三鈉鹽 ATPS 并利用CE串聯(lián)精確質(zhì)量Q TOFLC MS進(jìn)行分析 抗體糖基化的MS檢測(cè)結(jié)果 抗體質(zhì)量分析相關(guān)的指導(dǎo)原則 1 cde 人用單克隆抗體質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則2003 2 EP7 monoclonalantibodyforhumanuse 3 ICHQ6B 測(cè)試方法和接受標(biāo)準(zhǔn) 生物技術(shù)和生物藥品 4 FDA AssayDevelopmentforImmunogenicityTestingofTherapeuticProteins 5 FDA PointstoConsiderintheManufactureandTestingofMonoclonalAntibodyProductsforHumanUse 抗體的生物學(xué)活性檢測(cè) 分子水平的活性鑒定細(xì)胞水平的活性鑒定動(dòng)物水平的活性鑒定 誘導(dǎo) 移植 基因修飾 阻斷活性殺傷腫瘤細(xì)胞活性 自發(fā)瘤 腫瘤細(xì)胞株 移植瘤 激活免疫細(xì)胞活性 原代培養(yǎng)的免疫細(xì)胞 白血病細(xì)胞株 THP 1 Jurkat細(xì)胞等 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病模型 抗體的制劑研究 凍干制劑液體制劑高濃度液體制劑 抗體制劑的輔料 藥用輔料是指在制劑處方設(shè)計(jì)時(shí) 為解決制劑的成型性 有效性 穩(wěn)定性 安全性加入處方中除主藥以外的一切藥用物料的統(tǒng)稱 藥物制劑處方設(shè)計(jì)過程實(shí)質(zhì)是依據(jù)藥物特性與劑型要求 篩選與應(yīng)用藥用輔料的過程 藥用輔料是藥物制劑的基礎(chǔ)材料和重要組成部分 是保證藥物制劑生產(chǎn)和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ) 在制劑劑型和生產(chǎn)中起著關(guān)鍵的作用 它不僅賦予藥物一定劑型 而且與提高藥物的療效 降低不良反應(yīng)有很大的關(guān)系 其質(zhì)量可靠性和多樣性是保證劑型和制劑先進(jìn)性的基礎(chǔ) 輔料在制劑中作用分類有66種 抗體制劑的輔料 海藻糖或蔗糖 凍干保護(hù) 磷酸鹽或者檸檬酸鹽緩沖系統(tǒng)Tween 20 助溶 組氨酸 保護(hù)劑 冷鏈運(yùn)輸?shù)膯栴} 抗體制劑的穩(wěn)定性分析 ProteinConcentration 70 9mg mL 63 0 77 0 Potency 100 80 125 molecularandcelllevelsSE HLC MP 99 8 HMW 0 2 LMW 0 0 MP 99 CE SDS reduced HC LC 98 9 HC 66 8 LC 32 1 LC HC 98 CEX HPLC MP 89 6 Acidic 2 7 Basic 7 7 80 Osmolality 314mOsm kg 300 50 pH GlycolyzationAppearance ReportVolume 1 2mL average1 1525mL n 5 1mL Sub visibleParticulate 29particles container 10 m nomorethan6000 particles container 25 m nomorethan600 Sterility PassBacterialEndotoxin 0 2EU mL 5 0 aggregationContainerandstopperAccelerativestabilitytestLongtermstabilitytestImpuritytest 抗體的免疫治療方法概覽 免疫脂質(zhì)體 雙功能抗體和多功能抗體 Antibodydrugconjugation ADC 第一代ADC 隨機(jī)偶聯(lián)第二代ADC 定位整合Ambrx公司 稀有氨基酸摻入RedwoodBiosciences 延長多肽鏈 偶聯(lián)藥物半胱氨酸偶聯(lián) 腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤 Probody技術(shù) 抗EGFR抗體治療的副作用 CAR T治療急性淋巴細(xì)胞白血病 CAR T的定義 ArtificialTcellreceptors alsoknownaschimericTcellreceptors chimericimmunoreceptors chimericantigenreceptors CARs areengineeredreceptors whichgraftanarbitraryspecificityontoanimmuneeffectorcell Typically thesereceptorsareusedtograftthespecificityofamonoclonalantibodyontoaTcell withtransferoftheircodingsequencefacilitatedbyretroviralvectorsorlentivirusvectors Thereceptorsarecalledchimericbecausetheyarecomposedofpartsfromdifferentsources CAR T的技術(shù)原理 CAR T治療技術(shù)的發(fā)展 CAR T治療的臨床研究 ALL treatedwithalfaCD19 CD3zetaCARs modifiedTcells Bcelllymphoma treatedwithalfaCD20 CD3zetaCARs modifiedTcell neuroblastomapatients treatedwithScFv CD3zetaCARs modifiedTcell CAR T治療的優(yōu)缺點(diǎn) HLA independentrecognitionofantigen broadapplicabilityformanypatientsandtherapiddeliveryofCAR modifiedTcells SuccessfulapplicationofthesemodifiedTcellswillrequiretheidentificationofthetumor associatedantigen thatareexpressedonlyontumorcells therebyminimizingtheriskoftoxicity significantreleaseofpro inflammatorycytokines pulmonarytoxicity multi organfailureandeventualdeathofthepatient Socalled cytokinestorm unlikeantibodiesagainsttumor associatedantigens thesecellsarenotclearedfromthebodyquickly 抗體藥物的臨床申報(bào) 臨床前研究 i 臨床前研究 1 藥物靶點(diǎn)的確認(rèn) 這個(gè)是所有工作的開始 只有確定了靶點(diǎn) 后續(xù)所有的工作才有展開的依據(jù) 2 化合物的合成 這個(gè)階段的工作主要負(fù)責(zé)新化合物的合成 現(xiàn)有化合物的結(jié)構(gòu)改造和優(yōu)化 或者抗體的篩選 3 活性化合物的篩選不是所有合成出來的化合物或者抗體都能有理想的活性 在這個(gè)階段需要通過生物實(shí)驗(yàn)手段篩選出初步有活性的化合物用作備選 這些化合物叫先導(dǎo)化合物 lead 得到的活性數(shù)據(jù)可以結(jié)合化合物結(jié)構(gòu)得到初步的構(gòu)效關(guān)系分析 構(gòu)效關(guān)系可以有效的指導(dǎo)后續(xù)的化合物結(jié)構(gòu)優(yōu)化 這一步工作主要在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)層面展開 4 評(píng)估藥物的藥理作用 安全性與毒性 藥物的吸收 分布 代謝和排泄情況 ADME 這部分的實(shí)驗(yàn)需要在動(dòng)物層面展開 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有時(shí)候會(huì)有很大的差異 這一步的目的是確定藥物的有效性與安全性 GLP中心 5 制劑的開發(fā) 制劑后藥物的吸收 分布 代謝和排泄情況 制劑的穩(wěn)定性試驗(yàn) 分析數(shù)據(jù) 6 連續(xù)三批生產(chǎn)的藥品 申報(bào)文件的準(zhǔn)備 抗體藥物的申報(bào) I期臨床試驗(yàn) 在新藥開發(fā)過程中 將新藥第一次用于人體以研究新藥的性質(zhì)的試驗(yàn) 稱之為 期臨床試驗(yàn) 即在嚴(yán)格控制的條件下 給少量試驗(yàn)藥物于少數(shù)經(jīng)過謹(jǐn)慎選擇和篩選出的健康志愿者 對(duì)腫瘤藥物而言通常為腫瘤病人 然后仔細(xì)監(jiān)測(cè)藥物的血液濃度 排泄性質(zhì)和任何有益反應(yīng)或不良作用 以評(píng)價(jià)藥物在人體內(nèi)的性質(zhì) 期臨床試驗(yàn)通常要求健康志愿者住院以進(jìn)行24小時(shí)的密切監(jiān)護(hù) 隨著對(duì)新藥的安全性了解的增加 給藥的劑量可逐漸提高 并可以多劑量給藥 通過 期臨床試驗(yàn) 還可以得到一些藥物最高和最低劑量的信息 以便確定將來在病人身上使用的合適劑量 可見 期臨床試驗(yàn)是初步的臨床藥理學(xué)及人體安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn) 目的在于觀測(cè)人體對(duì)新藥的耐受程度和藥代動(dòng)力學(xué) 為制定給藥方案提供依據(jù) 抗體藥物的申報(bào) II期臨床試驗(yàn) 通過 期臨床研究 在健康人身上得到了為達(dá)到合理的血藥濃度所需要的藥品的劑理的信息 即藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù) 但是 通常在健康的人體上是不可能證實(shí)藥品的治療作用的 在臨床研究的第二階段即 期臨床試驗(yàn) 將給藥于少數(shù)病人志愿者 然后重新評(píng)價(jià)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和排泄情況 這是因?yàn)樗幬镌诨疾顟B(tài)的人體內(nèi)的作用方式常常是不同的 對(duì)那些影響腸 胃 肝