細(xì)胞凋亡檢測試驗(yàn)方法VIP

細(xì)胞凋亡與免疫 1 引言 細(xì)胞凋亡是一種普遍存在的生物學(xué)過程 它與細(xì)胞增殖 細(xì)胞分化都是最重要的生命現(xiàn)象 正是由于細(xì)胞增殖 細(xì)胞分化 細(xì)胞調(diào)亡的相互聯(lián)系 相互制約的關(guān)系 才保證了生物體的正常發(fā)育 正常凋亡過程受阻或某種原因所致不正常的細(xì)胞凋亡 都會使機(jī)體出現(xiàn)病癥 因此對細(xì)胞凋亡的研究有助于某些疾病的闡明與治療 細(xì)胞凋亡的研究是近年來生命科學(xué)中發(fā)展起來的熱點(diǎn)課題 早期基于形態(tài)學(xué)和生物化學(xué) 近期則是基于分子生物學(xué)技術(shù)從基因調(diào)控 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面研究 2 主要內(nèi)容 細(xì)胞凋亡概述 基本概念 意義 生物學(xué)特征 調(diào)節(jié) 信號傳遞等 細(xì)胞凋亡與免疫生理細(xì)胞凋亡與免疫病理細(xì)胞凋亡的檢測方法細(xì)胞凋亡研究相關(guān)展望 3 一細(xì)胞凋亡概述 1 基本概念及生物學(xué)意義 凋亡 apoptosis 一詞于1972年Kerr 英國阿伯丁大學(xué)病理學(xué)教授 引入 是一個(gè)希臘語合成詞 原意指花瓣或樹葉的自然脫落 Apo脫落 ptosis飄零 Apoptosis 基本概念 細(xì)胞凋亡是一個(gè) 形態(tài)學(xué) 概念 是對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察的基礎(chǔ)上得出的特指一種由基因控制 形態(tài)學(xué)特征與壞死截然不同的自主性細(xì)胞死亡方式 1972年 Kerr Wylle和Curry在許多正常組織中觀察到一種與經(jīng)典的細(xì)胞壞死形態(tài)特征不同的現(xiàn)象 細(xì)胞收縮 細(xì)胞碎片 散在不完整細(xì)胞等 據(jù)此 他們首次提出apoptosis一詞 國內(nèi)常譯為細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋落 細(xì)胞凋謝 細(xì)胞衰亡等 多數(shù)學(xué)者傾向于 細(xì)胞凋亡 強(qiáng)調(diào)這一過程是一種自然的生理學(xué)過程 細(xì)胞凋亡與細(xì)胞程序性死亡 細(xì)胞程序性死亡 programmedcelldeath PCD PCD最初是1956年發(fā)育生物學(xué)中提出的概念 是個(gè)功能性概念 一般指生理性細(xì)胞死亡 描述在一個(gè)多細(xì)胞生物體中某些細(xì)胞死亡是個(gè)體發(fā)育中的一個(gè)預(yù)定的 并受到嚴(yán)格程序控制的正常組成部分 細(xì)胞凋亡和程序性死亡具有非常密切地關(guān)系 大多數(shù)情況下程序性細(xì)胞死亡是以凋亡的方式進(jìn)行 但并不是所有的程序性死亡都采取凋亡的方式 6 如煙草蛾節(jié)間肌肉細(xì)胞 哺乳動物某些神經(jīng)元和紅細(xì)胞 它們的程序性死亡是以非凋亡的方式進(jìn)行 有時(shí)由外源性理化因子刺激誘發(fā)的細(xì)胞死亡 形態(tài)上似凋亡 但并不是由細(xì)胞內(nèi)原裝程序所引發(fā) 也不能稱為程序性細(xì)胞死亡 如放療后腫瘤組織壞死等 因此細(xì)胞凋亡只是程序性死亡的特殊方式 細(xì)胞凋亡與細(xì)胞程序性死亡 細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義 近年來對細(xì)胞凋亡的研究日漸重視 現(xiàn)代研究結(jié)果表明 細(xì)胞凋亡不僅是認(rèn)識細(xì)胞死亡過程的基礎(chǔ) 而且在胚胎發(fā)育 造血 免疫 乃至腫瘤形成中都有極為重要的作用 8 1 確保正常的生長發(fā)育 development 清除無用 多余的細(xì)胞 2 維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定 maintenanceofhomeostasis 清除受損 突變或衰老的細(xì)胞 3 發(fā)揮積極的防御功能 defensereaction 清除病毒感染細(xì)胞等對機(jī)體有害的細(xì)胞 Sculptingthedigitsinthedevelopingmousepawbyapoptosis Tissueremodeling Theresorptionofthetadpoletailatthetimeofitsmetamorphosisintoafrogoccursbyapoptosis Eliminationoftransitoryorgansandtissues 細(xì)胞凋亡參與皮膚更新 2 細(xì)胞凋亡的生物學(xué)特征 形態(tài)學(xué)變化生物化學(xué)變化胞內(nèi)Ca 濃度增高DNA片段化大分子的合成 凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)及RNA合成 tTG 組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 的積累并達(dá)到較高的水平 一種依賴鈣離子的酶 當(dāng)?shù)蛲銎鹗紩r(shí) Ca 濃度上升 從而使tTG活化 其作用是保持凋亡小體的完整性 防止有害物質(zhì)的逸出 14 MorphologicalChanges 細(xì)胞生物學(xué)詳講 第一階段 胞體縮小與周圍細(xì)胞失去聯(lián)系 細(xì)胞器變致密 核體積縮小 核仁消失 染色質(zhì)濃集于核膜內(nèi)表面下 形成新月形致密小塊 第二階段 染色體斷裂 核膜與細(xì)胞膜均內(nèi)陷 包裹胞內(nèi)成分 胞漿 細(xì)胞器 碎裂的染色質(zhì)及核膜 形成 泡 樣結(jié)構(gòu) 此為 凋亡小體 最后 整個(gè)細(xì)胞均裂解成這種 小體 第三階段 凋亡小體被鄰近的巨噬 上皮細(xì)胞等識別 吞噬 消化 上述三個(gè)階段維持時(shí)間很短 通常在幾分鐘 十幾分鐘內(nèi)即可完成 15 細(xì)胞凋亡時(shí)的形態(tài)學(xué)變化 16 細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死特征細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死誘導(dǎo)因素生理及弱刺激強(qiáng)烈刺激受累范圍單個(gè)細(xì)胞丟失成群細(xì)胞死亡膜完整性保持到晚期早期即喪失細(xì)胞體積減少 固縮增大腫脹染色質(zhì)凝聚成半月形稀疏成網(wǎng)狀細(xì)胞器無明顯變化腫漲破壞溶酶體保持完整破壞外溢細(xì)胞形狀形成凋亡小體破裂成碎片基因組DNA有控降解隨機(jī)降解大分子合成一般需要不需要基因調(diào)控有無后果不引起炎癥反應(yīng)引起炎癥反應(yīng)意義生理死亡方式病理死亡方式 17 18 19 DNA ladder DNAfragmentation chromatin DNA corehistone nucleosome 180bp endonucleolytic 20 3 細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)和抑制因素物理性因子 包括射線 紫外線 射線等 較溫和的溫度刺激 如熱激 冷激 等 化學(xué)及生物因子 包括活性氧基團(tuán)和分子 激素 細(xì)胞生長因子 腫瘤壞死因子 TNF 等 DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑等 21 4 免疫相關(guān)的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 接受凋亡信號凋亡調(diào)控分子間的相互作用蛋白水解酶 caspases 的活化凋亡的級聯(lián)反應(yīng) 22 免疫相關(guān)的凋亡信號途徑 死亡受體介導(dǎo)的信號途徑線粒體途徑顆粒酶B途徑 CTL特有 23 死亡受體通路 線粒體通路 24 其中膜受體和線粒體途徑均通過激活含半胱氨酸的天冬氨酸酶 Caspase 剪切胞內(nèi)底物 Caspase不可逆有限水解底物的級聯(lián)放大反應(yīng)過程 導(dǎo)致凋亡特有的生化和形態(tài)學(xué)改變 細(xì)胞凋亡涉及的共同通路 25 Caspase 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶 水解底物天冬氨酸C端肽鍵 因此又稱之為Caspases 取英文CysteineC asparticacid Asp proteases的詞頭 細(xì)胞凋亡涉及的共同通路 26 27 Caspase家族的結(jié)構(gòu)與分類 ICE亞類Caspase蛋白酶 ICE是單核細(xì)胞來源的參與成熟的一種蛋白酶 參與凋亡但不起主要作用 Caspase1 Caspase4 Caspase5 Caspase11Caspase12 Caspase13 Caspase14 凋亡啟動亞類Caspase蛋白酶 上游Caspase Caspase8 Caspase2 Caspase9 Caspase10 凋亡效應(yīng)亞類Caspase蛋白酶 下游Caspase Caspase3 Caspase6 Caspase7 28 Caspase家族的特點(diǎn) 以酶原的形式存在 需要活化 同源活化和異源活化 活化后形成四聚體的蛋白水解酶 發(fā)揮生物學(xué)作用C端同源區(qū)存在半胱氨酸激活位點(diǎn) 29 Caspase活化機(jī)制 Caspase的活化是有順序的多步水解的過程 雖然分子各異 但是它們活化的過程相似 首先在caspase前體的N 端前肽和大亞基之間的特定位點(diǎn)被水解去除N 端前肽 然后再在大小亞基之間切割釋放大小亞基 并進(jìn)而形成兩兩組成的有活性的四聚體 30 31 凋亡細(xì)胞的特征性表現(xiàn) 包括DNA裂解為200bp左右的片段 染色質(zhì)濃縮 細(xì)胞膜活化 細(xì)胞皺縮 最后形成由細(xì)胞膜包裹的凋亡小體 然后 這些凋亡小體被其他細(xì)胞所吞噬 破壞細(xì)胞抗凋亡因素破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)影響核酸的結(jié)構(gòu)與功能 Caspase的效應(yīng)機(jī)制 32 破壞細(xì)胞抗凋亡因素 正常活細(xì)胞內(nèi)核酸酶處于無活性狀態(tài) 這是由于核酸酶和抑制物結(jié)合在一起 如抑制物被破壞 核酸酶即可激活 引起DNA片段化 現(xiàn)知caspase可以剪切裂解這種抑制物而激活核酸酶 因而把這種酶稱為Caspase激活的脫氧核糖核酸酶 caspase activateddeoxyribonuleaseCAD 而把它的抑制物稱為ICAD 有意義的是CAD只在ICAD存在時(shí)才能合成并顯示活性 因而ICAD對CAD的活化與抑制是必需的 33 破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu) Caspase可直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu) 如裂解核纖層核纖層 Lamin 是由核纖層蛋白通過聚合作用而連成頭尾相接的多聚體 由此形成核膜的骨架結(jié)構(gòu) 使染色質(zhì) chromatin 得以形成并進(jìn)行正常的排列 在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí) 核纖層蛋白作為底物被Caspase裂解 從而使核纖層蛋白崩解 導(dǎo)致細(xì)胞染色質(zhì)的固縮 34 影響核酸的結(jié)構(gòu)與功能 Caspase可作用于多種與DNA RNA功能有關(guān)的蛋白 如滅活或下調(diào)與DNA修復(fù)有關(guān)的酶 mRNA剪切蛋白和DNA交聯(lián)蛋白 由于DNA的作用 這些蛋白功能被抑制 使細(xì)胞的增殖與復(fù)制受阻并發(fā)生凋亡 35 4 1死亡受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 1 參與死亡受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的接頭蛋白 死亡結(jié)構(gòu)域蛋白deathdomainprotein TRADD TNF受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白TNF TNFRI 死亡結(jié)構(gòu)域 TRADD細(xì)胞凋亡FADD Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白FasL Fas 死亡結(jié)構(gòu)域 FADD細(xì)胞凋亡RIP 受體相互作用蛋白CRADD 含有死亡結(jié)構(gòu)域的caspase和RIP接頭蛋白MADD 活化MAP激酶的死亡結(jié)構(gòu)域蛋白 36 2 死亡受體通路 受體多聚化和構(gòu)像改變 死亡受體 配體 FADD Caspase8或10 FADD FASL FAS 凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物 DISC 胞質(zhì)中游離的caspase8聚集到這個(gè)復(fù)合物上 細(xì)胞有足夠caspase8細(xì)胞caspase8濃度不夠 死亡受體活化 細(xì)胞凋亡 切割BidtBid從胞質(zhì)到線粒體 CtyC釋放 線粒體途徑 37 FasL Fas 38 3 死亡受體途徑的調(diào)控機(jī)制 FLIP FADD like IL 1 converting enzyme FLICE inhibitoryprotein 近年發(fā)現(xiàn)的含DED的凋亡抑制蛋白廣泛存在于真核生物 哺乳動物細(xì)胞和病毒中包括 病毒基因編碼的FLIP v FLIP 細(xì)胞FLIP c FLIP c FLIPS或c FLIPL功能 抑制Caspase8結(jié)合到DISC上 從而抑制起始Caspase激活 39 4 2線粒體途徑 1 基本環(huán)節(jié) 釋放caspase活化因子細(xì)胞色素C 細(xì)胞色素C Apaf 1 caspase9凋亡體AIF 凋亡誘導(dǎo)因子 Caspase3Apaf 1 凋亡蛋白酶活化因子 40 2 線粒體通路 41 3 線粒體通路的調(diào)控機(jī)制 Bcl 2家族 Bcelllymphoma leukemia 2 因該家族成員可通過改變外膜通透性而調(diào)控線粒體活化 故該途徑也稱為Bcl 2介導(dǎo)的線粒體途徑 Bcl 2家族已發(fā)現(xiàn)15個(gè)成員 所有Bcl 2家族成員均含有1個(gè)或多個(gè)BH結(jié)構(gòu)域 42 根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能分為兩類 抗凋亡 促增殖成員 包括Bcl 2 Bcl xl等 機(jī)制 可阻止線粒體外膜通透化 從而阻止細(xì)胞色素C的釋放 抑制細(xì)胞凋亡 促凋亡成員 包括Bid Bim Bad等 BH3only 蛋白質(zhì)和Bax Bak Bok等 多BH 蛋白質(zhì)機(jī)制 影響APAF1的功能影響線粒體的結(jié)構(gòu)與功能 43 44 45 IAP inhibitorofapoptosis 細(xì)胞凋亡抑制因子 IAP超家族的成員較多 共同的特征是含有一個(gè)或多個(gè) 個(gè)氨基酸的重復(fù)序列 BIR 類似于zinc指狀的結(jié)構(gòu) BIR功能域和之間的連接區(qū)域介導(dǎo)對caspase的抑制作用 而環(huán)指狀結(jié)構(gòu)則具有泛素化蛋白連接酶的作用 介導(dǎo)caspase 和 的泛素化降解作用 46 47 3 Smac Dablo在細(xì)胞凋亡過程中它可以從線粒體釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì) 成熟的Smac蛋白產(chǎn)生一個(gè)新的N基端 這個(gè)N基端的前面4個(gè)氨基酸可以與lAP的BIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合 Smac的功能就是拮抗活化胱解酶9與lAP的結(jié)合 Smac與BIR2的結(jié)合可以中和XlAP對胱解酶9的抑制 促進(jìn)凋亡 48 4 AIF apoptosis inducingfactor EndoG兩者均由線粒體釋放 可以非Caspase依賴方式介導(dǎo)染色質(zhì)的濃集和DNA片段化 促進(jìn)凋亡 49 顆粒酶B途徑凋亡 顆粒酶B屬絲氨酸蛋白酶可作用于底物的天冬氨酸殘基位點(diǎn)是CTL殺傷靶細(xì)胞的主要效應(yīng)分子 機(jī)制 1 顆粒酶B直接剪切并激活Caspase 3 后者作用于胞內(nèi)底物介導(dǎo)凋亡 2 顆粒酶B剪切Bid而產(chǎn)生tBid 后者與Bax轉(zhuǎn)位于線粒體 介導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放 激活Caspase級聯(lián)反應(yīng) 50 細(xì)胞凋亡發(fā)生于在淋巴細(xì)胞分化 發(fā)育成熟及增殖和行使免疫學(xué)效應(yīng)的全過程中 細(xì)胞凋亡在免疫系統(tǒng)成熟 受體多樣性選擇以及免疫自穩(wěn)等方面均有重要作用 研究免疫系統(tǒng)凋亡機(jī)制將為探討包括腫瘤 自身免疫病 艾滋病等免疫相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)理進(jìn)而發(fā)展有效的防治方案提供依據(jù) 51 二細(xì)胞凋亡與免疫生理 二細(xì)胞凋亡與免疫生理 1 細(xì)胞凋亡與T細(xì)胞 1 凋亡與T細(xì)胞在胸腺的分化發(fā)育 52 2 凋亡與成熟T細(xì)胞 活化T細(xì)胞表面高表達(dá)fas及fasL AICD 1 細(xì)胞凋亡與T細(xì)胞 53 2 細(xì)胞凋亡與B細(xì)胞 1 凋亡與骨髓中B細(xì)胞發(fā)育 2 凋亡與成熟B細(xì)胞 54 3 細(xì)胞凋亡與淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用 有胞毒作用的淋巴細(xì)胞主要有CTL NK LAK細(xì)胞等 它們產(chǎn)生效應(yīng)的機(jī)制相似 Ca 內(nèi)流 釋放穿孔素 6 16nm孔 靶細(xì)胞死亡靶細(xì)胞凋亡 顆粒酶 絲氨酸酶 激活caspase TNF相關(guān)蛋白 Tc高表達(dá)FasL 55 三細(xì)胞凋亡與免疫病理 細(xì)胞凋亡不足及細(xì)胞凋亡過度都會造成疾病 20040481 proliferation apoptosis homeostasis time 57 與凋亡不足有關(guān)的疾病與凋亡過度有關(guān)的疾病 1腫瘤1AIDS 濾泡型淋巴瘤2神經(jīng)變性疾病 激素依賴性腫瘤 乳瘤 巴金森氏病 2自身免疫病色素性視網(wǎng)膜炎 系統(tǒng)性紅斑狼瘡3再生障礙性貧血 免疫介導(dǎo)的腎小球腎炎4缺血性損傷 3病毒感染心肌梗死 中風(fēng) 皰疹病毒 腺病毒5酒精中毒性肝病 57 凋亡不足與過度并存 動脈粥樣硬化 內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過度 血管平滑肌細(xì)胞凋亡不足 針對疾病種類的不同 可以通過抑制或者增強(qiáng)細(xì)胞凋亡的措施治療有關(guān)的疾病 1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡治療因凋亡受抑而致的疾病放療和化療能激活腫瘤自殺程序 導(dǎo)致瘤細(xì)胞凋亡 改變細(xì)胞凋亡狀態(tài)用于疾病治療的許多措施尚屬試用階段 一個(gè)十分誘人的設(shè)想是基因治療 通過載體導(dǎo)入凋亡相關(guān)基因干預(yù)細(xì)胞的凋亡調(diào)控來實(shí)現(xiàn) 2抑制細(xì)胞凋亡治療因凋亡過量而致的疾病神經(jīng)生長因子治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變 可以延緩神經(jīng)元凋亡 58 四細(xì)胞凋亡研究方法 形態(tài)學(xué)方法生物化學(xué)方法免疫學(xué)方法組織化學(xué)方法分子生物學(xué)方法 59 60 1 形態(tài)學(xué)方法1 光學(xué)顯微鏡觀察樣品涂片或組織切片經(jīng)常規(guī)處理 HE染色后 即可放在油鏡下觀察 該方法簡便 缺點(diǎn)是只有在發(fā)現(xiàn)了具有特征性的凋亡小體時(shí)才能確定為熒光結(jié)果陽性 因而不易檢出早期的凋亡細(xì)胞 而且某些類型的細(xì)胞壞死 如凝固性壞死 與細(xì)胞凋亡形態(tài)相似 兩者不易區(qū)分 因此 該方法只能作為細(xì)胞凋亡初步推測的手段 61 62 1 形態(tài)學(xué)方法2 熒光顯微鏡觀察 熒光染料吖啶橙 AO 碘化丙啶 PI 溴化乙錠 EB 等染色 在熒光顯微鏡下可觀察到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核改變和凋亡小體的形成 這種方法適用于對體外培養(yǎng)細(xì)胞懸液的檢測 組織脫蠟切片經(jīng)RNA酶作用后也可用此法染色觀察 熒光顯微鏡檢查法方便易行 現(xiàn)已成為細(xì)胞凋亡檢查的常用手段 63 Onthisslidetheeasiestandhistoricallyfirstwayofidentifyingapoptoticcellsisshown InthisassaythebluefluorescentdyeDAPI 4 6 Diamidine 2 phenylindoledihydrochloride hasbeenused whichspecificallystainsDNA 64 1 形態(tài)學(xué)方法3 透射電子顯微鏡觀察 凋亡細(xì)胞在電子顯微鏡下可見細(xì)胞體積變小 細(xì)胞質(zhì)濃縮 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 線粒體增多 細(xì)胞膜微絨毛消失 起泡 出芽 形成凋亡小體 超微結(jié)構(gòu)觀察是診斷細(xì)胞凋亡最可靠的方法 但該法只能定性 不能定量 而且觀察到凋亡小體的幾率也不高 在體內(nèi)試驗(yàn)時(shí) 凋亡小體可能很快被巨噬細(xì)胞吞噬清除 而不易觀察到 此外 用電子顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡 樣品制備步驟繁瑣 耗時(shí) 昂貴 65 66 1 形態(tài)學(xué)方法4 共聚焦激光掃描顯微鏡檢測 共聚焦激光掃描顯微鏡是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種新型儀器 是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置 利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理 使紫外光和可見光激發(fā)熒光探針 從而得到清晰的細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu) 該方法能用于細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析 而且還能對凋亡細(xì)胞內(nèi)的大分子進(jìn)行定位 67 2 生物化學(xué)方法 1 典型的細(xì)胞凋亡顯示出DNA梯形電泳圖譜 細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂 形成180 200bp長的DNA片段或整數(shù)倍的寡核苷酸片段 凋亡細(xì)胞經(jīng)處理后 采用常規(guī)方法分離提純DNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色 在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的梯形電泳圖譜 而壞死細(xì)胞電泳后呈模糊的涂片狀 68 細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖1 細(xì)胞色素c誘導(dǎo)0h2 細(xì)胞色素c誘導(dǎo)1h3 細(xì)胞色素c誘導(dǎo)2h4 細(xì)胞色素c誘導(dǎo)3h5 細(xì)胞色素c誘導(dǎo)4h6 陰性對照7 Marker 自趙允 翟中和 69 70 2 生物化學(xué)方法 2 原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù) 凋亡細(xì)胞由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活 核DNA被切割成許多雙鏈DNA片段以及高分子量DNA單鏈斷裂點(diǎn) 缺口 暴露出大量3 末端 如用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 TdT 將標(biāo)記的 dUTP進(jìn)行缺口末端標(biāo)記 則可原位特異地顯示出凋亡細(xì)胞 71 2 生物化學(xué)方法 由DNA片段末端標(biāo)記技術(shù)發(fā)展而成的TUNEL法 terminadeoxynucleotibyltransferase TdT mediateddUTP biotinnickendlabelling TUNEL 及試劑盒化 使細(xì)胞凋亡的原位檢測在諸多領(lǐng)域的研究中得到廣泛應(yīng)用 72 TUNEL法原理1 細(xì)胞凋亡其斷裂DNA斷端3 OH暴露 壞死細(xì)胞DNA斷裂是無規(guī)則的 其中也有少數(shù)可出現(xiàn)3 OH的暴露 但數(shù)量極微弱 不易檢測出來 2 在末端DNA轉(zhuǎn)移酶 TdT 的作用下 在無需模板的情況下 可進(jìn)行3 端的DNA合成 3 如果在反應(yīng)體系中加入標(biāo)記的DNA 則在3 端出現(xiàn)一段帶有標(biāo)記物的寡核苷酸 通過熒光顯示或其他顯色反應(yīng) 可以原位地較特異地顯示發(fā)生凋亡的細(xì)胞 73 TUNEL法優(yōu)點(diǎn) 特異性 該法用生化方法特異地標(biāo)記凋亡細(xì)胞 可以將凋亡細(xì)胞 壞死細(xì)胞和活細(xì)胞區(qū)分開來 凋亡細(xì)胞顯示增強(qiáng)的熒光 而壞死細(xì)胞和活細(xì)胞均不著染熒光 敏感性 TUNEL法可用于只有極少細(xì)胞發(fā)生凋亡的情況 可定量檢測細(xì)胞凋亡 74 TUNEL法優(yōu)點(diǎn) 適用于形態(tài)研究 用TUNEL法標(biāo)記細(xì)胞可動態(tài)觀察凋亡細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化 適用性較廣 可用于石蠟包埋的組織切片 冰凍組織切片 培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離細(xì)胞的凋亡情況檢測 TUNEL法檢測快速 其反應(yīng)過程僅需3h 75 76 77 缺點(diǎn) 只能標(biāo)記中期及晚期的凋亡細(xì)胞 不能檢測只發(fā)生DNA大片段 300000bp 斷裂的凋亡細(xì)胞 不能檢測DNA斷裂末端的準(zhǔn)確數(shù)量 因?yàn)槊總€(gè)末端結(jié)合的標(biāo)記分子的數(shù)量可因反應(yīng)動力學(xué)而不同 若樣品處理不當(dāng) 易形成假陽性 影響結(jié)果判斷 78 3 免疫學(xué)方法 ELISA法 利用 夾心酶標(biāo)免疫測定法 的原理 核小體DNA由于與組蛋白H2A H2B H3和H4形成緊密復(fù)合物而不被核酸內(nèi)切酶裂解 用抗組蛋白 或抗DNA 過氧化物酶 或生物素化的抗體 結(jié)合到核小體 通過酶標(biāo)儀分析 可定量反映細(xì)胞凋亡水平 79 80 ELISA方法的優(yōu)點(diǎn)是 靈敏度高 操作快捷 無放射性同位素污染 可定量測定細(xì)胞凋亡 無需預(yù)先標(biāo)記細(xì)胞 所用抗體不具有種屬特異性 酶標(biāo)記的抗DNA抗體可與單鏈和雙鏈的DNA起反應(yīng) 夾心法可以測定核小體單體和寡聚核小體 因而可以用于許多不同的培養(yǎng)細(xì)胞株或動物組織細(xì)胞的凋亡檢測 81 4 組織化學(xué)方法 細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白分析 如p53蛋白 c myc Fas Bcl 2家族蛋白等 測定方法主要有流式細(xì)胞儀檢測法 蛋白印跡法及免疫組織化學(xué)染色法等 82 5 分子生物學(xué)方法 PCR是檢測凋亡特異性基因的常用方法 PCR被用來擴(kuò)增凋亡細(xì)胞產(chǎn)生的DNA片段 當(dāng)瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)的DNA梯形條帶不明顯時(shí) 用PCR擴(kuò)增后再電泳可見明顯的梯形圖譜 RT PCR被用來檢測Bcl 2和caspase表達(dá) 熒光定量PCR檢測基因表達(dá)水平更快更準(zhǔn)確 此外 將PCR技術(shù)和核酸分子雜交技術(shù)相結(jié)合 能顯著提高檢測的特異性和靈敏度 83 6 流式細(xì)胞分析術(shù) flowcytometry FCM 84 亞 G1 峰檢測法 處于增殖周期中的細(xì)胞 根據(jù)其所處不同周期時(shí)相 G0 Gl S G2 M 其DNA含量分布在2n 4n之間 發(fā)生凋亡的細(xì)胞由于核內(nèi)DNA裂解成許多小片段 在酒精固定后用細(xì)胞膜通透劑使小分子量的DNA片段穿過胞膜而丟失 僅剩下大片段DNA 這些失去部分DNA含量的細(xì)胞 在DNA染色后 形成一個(gè)DNA含量 2n 即 G1期細(xì)胞 的分布區(qū) 稱為 亞G1峰 6 流式細(xì)胞分析術(shù) flowcytometry FCM 85 86 7 細(xì)胞凋亡的其它檢測 PS 磷脂酰絲氨酸 在細(xì)胞外膜上的檢測 磷脂酰絲氨酸 Phosphatidylserine PS 正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè) 在凋亡早期 PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面 暴露在細(xì)胞外環(huán)境中 Annexin V Ca2 依賴性磷脂結(jié)合蛋白 能與PS高親和力特異性結(jié)合 將Annexin V進(jìn)行熒光素 FITC R PE 或biotin標(biāo)記 以標(biāo)記了的Annexin V作為熒光探針 利用流式細(xì)胞儀 熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生 細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測 CLONTECH公司的ApoAlertTMGlutathioneDetectionKit通過熒光染料monochlorobimane MCB 體外檢測凋亡細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中谷光苷肽的減少來檢測凋亡早期細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的變化 87 細(xì)胞色素C的定位檢測 通過Western雜交用細(xì)胞色素C抗體和COX4抗體標(biāo)示細(xì)胞色素C和COX4的存在位置 從而判斷凋亡的發(fā)生 線粒體膜電位變化的檢測 端粒酶檢測 mRNA水平的檢測 蛋白印跡法 檢測細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白分析 如caspase Fas家族蛋白等 7 細(xì)胞凋亡的其它檢測 88 細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)存在的問題 1 細(xì)胞凋亡的判斷標(biāo)準(zhǔn) 目前 檢測細(xì)胞凋亡的許多方法的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)不一 形態(tài)學(xué)檢查是其他各種檢測方法的基礎(chǔ) 任何方法的檢查結(jié)果必須結(jié)合形態(tài)學(xué)檢查來判斷 梯帶狀圖像并不必然與細(xì)胞凋亡相關(guān) TUNEL法在壞死細(xì)胞群中也可出現(xiàn)陽性細(xì)胞 89 2 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果分析 在一個(gè)檢測體系中檢出了發(fā)生凋亡的細(xì)胞 生理性還是病理性 需進(jìn)行致病因素的相關(guān)性分析 細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)存在的問題 90 細(xì)胞凋亡檢測技術(shù)存在的問題 3 細(xì)胞凋亡的定量分析 定量分析包括2個(gè)方面 一是群體細(xì)胞凋亡的定量 二是細(xì)胞凋亡程度的定量 目前 流式細(xì)胞儀常用作群體細(xì)胞凋亡的定量分析 但在檢測中的漏檢率和錯(cuò)檢率都很高 TUNEL法雖可進(jìn)行群體定量 但工作量大 同時(shí)易出現(xiàn)壞死細(xì)胞的假陽性 91 展望 92 現(xiàn)代生命科學(xué)的發(fā)展動態(tài) 細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué) 包括分子遺傳學(xué)與生物化學(xué) 相互滲透與交融是總的發(fā)展趨勢 細(xì)胞凋亡研究所處的地位 93 生命科學(xué)的研究從宏觀上可以分為三個(gè)層次 核心層次 包括分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)學(xué)科 個(gè)體生物學(xué)層次 對多個(gè)物種及種群的結(jié)構(gòu)及功能研究 生物圈層次 無論是對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的深入研究 還是對細(xì)胞重大生命活動規(guī)律的探索 都需要用分子生物學(xué)的新概念與新方法 在分子水平上進(jìn)行研究 換句話說 細(xì)胞分子生物學(xué)或分子細(xì)胞生物學(xué)將是今后相當(dāng)一段時(shí)間的主流 94 2007年 美國科學(xué)院院報(bào) PNAS 的一篇文章中 通過數(shù)學(xué)方法 對科學(xué)雜志的引用關(guān)系進(jìn)行了分析 對當(dāng)前的88個(gè)研究領(lǐng)域進(jìn)行了排序 分子與細(xì)胞生物學(xué)當(dāng)之無愧成為最大熱門 95 96 對細(xì)胞生命活動的研究成為當(dāng)今生命科學(xué)發(fā)展的瓶頸 細(xì)胞生命活動 突變體分析 突變體分析 蛋白修飾分析 基因表達(dá) 多肽定性分析 生物信息學(xué) 序列測定 雙向電泳分析