ITS菌種鑒定方-法

利 用 ITS 進(jìn) 行 菌 種 鑒 定 是 目 前 較 多 采 用 的 方 法 。 ITS 是 內(nèi) 源 轉(zhuǎn) 錄 間 隔 區(qū) ( Internally Transcribed Spacer)的英文縮寫(xiě), 位于rRNA 編碼基因18S,5. 8S和28S之間的小基因片段。其優(yōu) 點(diǎn)有: 具有高拷貝數(shù),整個(gè)序列的長(zhǎng)度在600800 bp，利用rDNA通用引物能夠很容易被擴(kuò)增出來(lái)； 同時(shí)包含保守與變異序列, 能根據(jù)保守序列中的變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)特殊引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增比較， rRNA基因(rDNA)在微生物的鑒定應(yīng)用中，具有檢測(cè)微生物種水平的多態(tài)性特征。這些rDNA高度保守地分布在染色體的不同位置，在每個(gè)單倍染色體基因組中的拷貝數(shù)超過(guò)200個(gè),這使得保守區(qū)域 能夠很容易被擴(kuò)增出來(lái)。每個(gè)重復(fù)的rDNA 序列的存在方式為由一前一后的18S rDNA 小亞基單元 (SSU) , 5.8S rDNA, 28S rDNA大亞基單元(LSU)組成,已設(shè)計(jì)出通用引物來(lái)擴(kuò)增ITS序列分析相關(guān) 真菌種水平之間的差異。 本研究通過(guò)絲狀真菌ITS保守序列的擴(kuò)增, 同源序列的對(duì)比分析 ,結(jié)合傳統(tǒng)鑒定方法,對(duì)從土壤中分離篩選的一株絲狀真菌進(jìn)行了分析鑒定,并對(duì)鑒定結(jié)果和方法進(jìn)行了比 較分析。 種內(nèi)變異還顯示在rDNA基因間內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)和（分別為ITS和ITS）的片段大小上。 ITS區(qū)在核糖DNA中進(jìn)化較快，可在同一屬間甚至群體間發(fā)生變化。其中ITS區(qū)在種間變異性較高（22），種內(nèi)變異性較低（3） 。選擇的兩對(duì)引物均以ITS區(qū)的序列為靶目標(biāo)，其中引物（ITS1和ITS4）擴(kuò)增的是ITS區(qū)、5.8SrDNA和ITS區(qū)的基因序列，可以鑒別出念珠菌屬的3個(gè)菌種； 引物（ITS4和ITS86）擴(kuò)增的是5.8S rDNA和28S rDNA之間的ITS區(qū)的保守順序，可以鑒別出念珠菌屬的7個(gè)菌種。因而筆者更推薦采用引物，它不僅有很強(qiáng)的通用性，能識(shí)別更多菌種，而且具有更高的屬種特異性。1、通用引物： ITS1 5-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG一3ITS4 5-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC一3通用引物 ITS4 5-TCCT CCGC TTAT