生物芯片技術(shù)及其進(jìn)展

生物芯片技術(shù)及其進(jìn)展 侯治富吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部中日聯(lián)誼醫(yī)院 houzf 生物芯片技術(shù)的主要內(nèi)容 生物芯片的概念生物芯片的基本原理生物芯片的分類生物芯片的發(fā)展歷程生物芯片的技術(shù)方法生物芯片的應(yīng)用 生物芯片的定義 生物芯片 Biochip或Bioarray 是指包被在固相載體上的高密度DNA 抗原 抗體 細(xì)胞或組織的微點(diǎn)陣 microarray 生物芯片的種類 包括DNA芯片 抗原芯片 抗體芯片 細(xì)胞芯片 組織芯片等 1998年世界十大科技突破之一 未來十年最具發(fā)展?jié)摿Φ募夹g(shù) 生物芯片的定義 Bio 詞素 生 生物 Chip 屑晶片 薄片 電子 集成電路片 英漢計(jì)算機(jī)名詞 芯片Array 陣 列 排列 配置 系 組 級(jí)數(shù) 芯片 生物芯片的概念 集成 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y OncogeneTargetsOntheAmpliOnc IBiochip PDGFB EGFR1 PDGFRA MET FGFR2 WNT1 MYB HER2 YES1 HRAS1 CND1 RAF1 GLI MYC MDM2 20q13 REL MYCL1 FGR FES ABL INT2 PIK3CA NMYC AKT2 FGFR1 JUNB AKT1 KRAS2 CDK4 AR 生物芯片基本原理 生物芯片的特點(diǎn) 高度并行性 提高實(shí)驗(yàn)進(jìn)程 利于顯示圖譜的快速對(duì)照和閱讀 多樣性 可進(jìn)行樣品的多方面分析 提高精確性 減少誤差 微型化 減少試劑用量和反應(yīng)液體積 提高樣品濃度和反應(yīng)速率 自動(dòng)化 降低成本 保證質(zhì)量 高通量 生物芯片的分類 尚未統(tǒng)一 廣義上 矩陣型芯片 處理型芯片固化材料 基因芯片 蛋白質(zhì)芯片 細(xì)胞芯片 組織芯片用途分類 生物芯片研究的歷史 1991Affymatrix公司StephenFodor 光刻與光化學(xué)技術(shù) 多肽和寡聚核苷酸微陣列 DNAChip概念Stanford大學(xué)Brown實(shí)驗(yàn)室 預(yù)先合成 機(jī)械手陣列1995Schena等 基因表達(dá)譜1996Cheeetal DNA測(cè)序1996Croninetal 突變檢測(cè)1996Sapolsley Lipshutz 基因圖克隆1996Shalonetal 復(fù)雜DNA樣本分析1996Shoemakeretal 缺省突變定量表型分析 分類 根據(jù)應(yīng)用 基因變異檢測(cè)芯片疾病檢測(cè) 如HIV P53基因 結(jié)核桿菌 法醫(yī)鑒定 如DNA指紋圖譜 表達(dá)譜芯片腫瘤相關(guān)基因 正常與腫瘤組織表達(dá)差異 藥物篩選 培養(yǎng)細(xì)胞藥物刺激前后表達(dá)差異 發(fā)育 同一組織不同發(fā)育時(shí)期基因表達(dá)差異 組織發(fā)生 不同組織或器官的基因表達(dá)差異 分類 根據(jù)工藝和載體 原位合成法 密集程度高 可合成任意序列的寡聚核苷酸 但特異性較差 寡聚核苷酸合成長(zhǎng)度有限 且隨長(zhǎng)度增加 合成錯(cuò)誤率增高 成本較高 設(shè)計(jì)和制造較煩瑣費(fèi)時(shí) DNA微矩陣法 成本低 易操作 點(diǎn)樣密度通常能滿足需要 芯片的載體需表面緊質(zhì) 光滑的固體 如硅 陶 玻璃等 DNA微矩陣芯片常用玻片為載體 分類 根據(jù)DNA成分 寡聚核苷酸或DNA片段 約20 25個(gè)核苷酸堿基 常用于基因類型的分析 如突變 正常變異 多態(tài)性 全部或部分cDNA 約500 5000個(gè)核苷酸堿基 通常用于兩種或以上樣本的相關(guān)基因表達(dá)分析 ComparisonofDNAChipTechnologies SensitivityofDNAchipbasedassaysisafunctionof ProbeandtargetDNA RNA Complexity Chipsurface autofluorescence non spec bkg Attachmentchemistry methodology hyb efficiency crosshyb Hybridizationefficiency lotsoffactors Detectiontechnology signaltype efficiency noise Oligo ChipcDNA ChipGenomicChip8nor20n50 000n sequencing expression expression genomicanalysis 基因芯片的種類 ScienceChip 生物分析和診斷 NutriChip 食物分析 轉(zhuǎn)基因 污染檢測(cè) LeukoChip 血液分析 病毒分析 HLA分析 AquaChip 水質(zhì)分析 SecureChip 含DNA的物質(zhì)鑒定 ChromoChip 基因分析和染色體序列 ProkaryoChip 原核生物 獸醫(yī) 環(huán)保等 生物芯片技術(shù)主要環(huán)節(jié) 芯片制備 微點(diǎn)陣樣本制備 DNA提純 擴(kuò)增 標(biāo)記雜交 樣本與互補(bǔ)模板形成雙鏈檢測(cè) 共聚焦掃描 雙色激光數(shù)據(jù)處理 定量軟件 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索 RNA印跡等 結(jié)果分析 細(xì)胞 對(duì)mRNA進(jìn)行標(biāo)記 雜交 基因表達(dá)資料 生物芯片的制作步驟 生物芯片分析 1 測(cè)定過程應(yīng)包括五個(gè)基本步驟 需解決的生物學(xué)問題樣本制備生物化學(xué)反應(yīng)檢測(cè)數(shù)據(jù)分析 NormalSample 2 生物學(xué)系統(tǒng)控制必須精確地與檢測(cè)目的相匹配 3 生物學(xué)樣本必須精確地與生物學(xué)種類相匹配 4 所有基因分析必須平行處理 5 基因分析技術(shù)必須適合微型化和自動(dòng)化 6 平行格式必須精確的依據(jù)生物學(xué)樣本的次序 7 檢測(cè)系統(tǒng)必須能精確地獲得數(shù)據(jù) 8 檢測(cè)系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)必須能被精確地控制和重復(fù) 9 兩種或以上平行數(shù)據(jù)組比較應(yīng)受到單個(gè)實(shí)驗(yàn)所固有特性的限制 10 絕對(duì)比例關(guān)系只存在于組合實(shí)驗(yàn)的平行數(shù)據(jù)組內(nèi) 11 平行格式包括內(nèi)在和外部的整個(gè)系統(tǒng)誤差的分析因素 12 在每個(gè)系統(tǒng)模塊中采集到該系統(tǒng)所有變量的四維數(shù)據(jù)時(shí) 才能稱為完成生物系統(tǒng)平行基因分析 生物芯片技術(shù)的12條原則只是一個(gè)基本框架 其術(shù)語(yǔ)的詳細(xì)定義和有關(guān)理論可參見http cmgm stanford edu schena 芯片制備 原位合成法 insitusynthesis 又可分為原位光控合成法和原位標(biāo)準(zhǔn)試劑合成法 適用于寡核苷酸 使用光引導(dǎo)化學(xué)原位合成技術(shù) 是目前制造高密度寡核苷酸最為成功的方法 合成后交聯(lián) post syntheticattachment 利用手工或自動(dòng)點(diǎn)樣裝置將預(yù)先制備好的寡核苷酸或cDNA樣品點(diǎn)在經(jīng)特殊處理過的玻片或其他材料上 主要用于診斷 檢測(cè)病原體及其他特殊要求的中 低密度芯片的制備 兩種制備方法比較 原位合成 測(cè)序 查明點(diǎn)突變高密度 根據(jù)已知的DNA編制程序制作復(fù)雜 價(jià)格昂貴 不能測(cè)定未知DNA序列合成后交聯(lián) 比較分析制備方式直接和簡(jiǎn)單 點(diǎn)樣的樣品可事先純化 交聯(lián)方式多樣 可設(shè)計(jì)和制備符合自己需要的芯片 中 低密度 樣品浪費(fèi)較多且制備前需儲(chǔ)存大量樣品 雜交 是芯片技術(shù)中除方陣構(gòu)建外最重要的一步液相中探針與DNA片段按堿基配對(duì)規(guī)則形成雙鏈反應(yīng) 選擇雜交條件時(shí) 必須滿足檢測(cè)時(shí)的靈敏度和特異性 使能檢測(cè)到低豐度基因 且能保證每條探針都能與互補(bǔ)模板雜交 合適長(zhǎng)度的DNA有利于與探針雜交 溫度 非特異性本底等均會(huì)影響雜交結(jié)果 最好在封閉循環(huán)條件下雜交 雜交爐 樣本制備 制備高質(zhì)量樣本是困難的但又是極其重要的 制備細(xì)胞 組織或整個(gè)器官樣本應(yīng)特別小心 溫度 激素和營(yíng)養(yǎng)環(huán)境 遺傳背景 組織成分等輕微改變都會(huì)使基因表達(dá)的結(jié)果發(fā)生明顯變化 用于基因類型分析的樣本是DNA 用于表達(dá)研究的樣本是cDNA 樣本制備后應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記 通常為酶標(biāo)記 熒光標(biāo)記和核素標(biāo)記 結(jié)果分析 芯片與標(biāo)記的靶DNA或RNA雜交后 或與標(biāo)記的靶抗原或抗體結(jié)合后 可采用下列方法分析處理數(shù)據(jù) 共聚焦掃描儀 應(yīng)用最廣 重復(fù)性好但靈敏度較低 質(zhì)譜法 快速 精確 可準(zhǔn)確判斷是否存在基因突變和精確判斷突變基因的序列位置 探針合成較復(fù)雜 化學(xué)發(fā)光 光導(dǎo)纖維 二極管方陣檢測(cè) 直接電荷變化檢測(cè)等 芯片掃讀裝置 根據(jù)采用的光電偶合器件 分為光電倍增管型和CCD型 根據(jù)激光光源 可分為激光型和非激光型 應(yīng)用最為廣泛的是激光光源的共聚焦掃描裝置 分辨率 靈敏度極高 有良好的定位功能 可定量 應(yīng)用廣泛 圖象分析 復(fù)雜的雜交圖譜一般需由圖象分析軟件來完成 分析軟件的功能 鑒定每個(gè)點(diǎn)陣 最大限度消除本底熒光的干擾 解析多種顏色圖象 可標(biāo)記或排除假陽(yáng)性 識(shí)別和分析對(duì)照實(shí)驗(yàn)是否成功 可將信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化等 圖象處理軟件必須具備提取基因庫(kù)和數(shù)據(jù)庫(kù)的能力 質(zhì)量控制 實(shí)驗(yàn)對(duì)照 體外轉(zhuǎn)錄從cDNA合成mRNA 參入標(biāo)本中作為對(duì)照 此mRNA不與點(diǎn)陣的核酸雜交 將不同濃度的不同基因參入標(biāo)本中 可作為標(biāo)本間標(biāo)準(zhǔn)化的參照 用兩種不同吸收光譜的熒光素同時(shí)分析兩個(gè)標(biāo)本 如果兩種熒光強(qiáng)度一致 可排除標(biāo)本間變異因素 用單一堿基錯(cuò)配的寡核苷酸做對(duì)照可排除交叉雜交 結(jié)果有效性的證實(shí) 在表達(dá)矩陣上 有時(shí)難于區(qū)分極其相似的序列 如基因族成員 亞類或異類的存在 比較兩種不同DNA序列表達(dá)水平時(shí) 有些參數(shù)如核苷酸的成分 二級(jí)結(jié)構(gòu)的存在和矩陣上DNA的長(zhǎng)度都會(huì)影響雜交 證實(shí)矩陣分析的結(jié)果可用RT PCR 區(qū)別基因族成員 比較不同DNA種系表達(dá) 證實(shí)基因變異或突變和精確測(cè)定DNA表達(dá)水平 NorthernBlot 證實(shí)某一基因的相對(duì)表達(dá)水平 WesternBlot RNA表達(dá)是否達(dá)到細(xì)胞中的蛋白水平 質(zhì)譜儀 證實(shí)矩陣結(jié)果是否在蛋白水平 等 生物芯片技術(shù)的應(yīng)用 基因表達(dá)分析 腫瘤基因突變檢測(cè) 遺傳性疾病測(cè)序 基因圖繪制和多態(tài)性分析 測(cè)序微生物菌種鑒定 毒力基因 抗藥基因藥物研究 新藥篩選 指導(dǎo)合理用藥克隆選擇及文庫(kù)篩選 生物芯片技術(shù)的發(fā)展 發(fā)展趨勢(shì)微型化 DNA矩陣越來越小 集成化 矩陣上的基因組越來越大 多樣化 測(cè)定范圍越來越廣 微量化 測(cè)定所需樣本越來越少 全自動(dòng)化 樣品制備到結(jié)果顯示全部分析過程 定量化 如激光捕獲技術(shù) 顯微解剖技術(shù)等可精確測(cè)定一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)基因的表達(dá) DNA矩陣數(shù)據(jù)信息庫(kù)的完善 生物芯片技術(shù)的發(fā)展 技術(shù)毛細(xì)管電泳芯片技術(shù)PCR芯片技術(shù) PCR Chip 縮微芯片實(shí)驗(yàn)室 lab on a chip 微珠芯片技術(shù) beadArray 抗體和蛋白質(zhì)陣列技術(shù) Antibodyandprotein arraytechnology 自我定制芯片技術(shù) makeyourownchip 血?dú)夥治鲂酒?毛細(xì)管電泳芯片技術(shù) Mathies最早報(bào)道毛細(xì)管電泳芯片測(cè)序結(jié)果 在10分鐘內(nèi)完成了對(duì)433個(gè)堿基序列的測(cè)定 賓夕法尼亞大學(xué)Wilding等成功地利用毛細(xì)管電泳芯片分離了用于診斷杜鑫 貝克肌萎縮的多條DNA片段 瑞士Ciba Geigy公司和加拿大Alberta大學(xué)合作利用玻璃毛細(xì)管電泳芯片完成了對(duì)寡核苷酸的分離 縮微芯片實(shí)驗(yàn)室 在一張芯片上完成樣品 如血液 組織等 制備 化學(xué)反應(yīng) 檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析 1998年程京博士首次應(yīng)用LOC實(shí)現(xiàn)了從樣品制備到反應(yīng)結(jié)果顯示的全部過程 成果地從混有大腸桿菌的血清中分離出了細(xì)菌 含有加熱器 微泵微閥 微流量控制器 電子化學(xué)和電子發(fā)光探測(cè)器的芯片已經(jīng)問世 也已出現(xiàn)樣品制備 化學(xué)反應(yīng)和分析檢測(cè)部分結(jié)合的芯片 LOC與衛(wèi)星傳輸和網(wǎng)絡(luò)生物信息學(xué)結(jié)合 將實(shí)現(xiàn)高通量 一體化和移動(dòng)性的 未來型掌上實(shí)驗(yàn)室 的構(gòu)想 抗體和蛋白質(zhì)陣列技術(shù) 蛋白質(zhì)組學(xué) protiomics 的興起 促進(jìn)了抗體和蛋白質(zhì)陣列技術(shù)的發(fā)展 PareickBrown使用特異性抗體微矩陣 測(cè)定了細(xì)胞和體液樣本中數(shù)千種不同的蛋白質(zhì) Leuking等采用蛋白質(zhì)微陣列技術(shù) 測(cè)定了10pg的微量蛋白質(zhì) 并證實(shí)假陽(yáng)性極低 乳腺癌基因芯片 Stanford乳腺癌微矩陣 Perouetal 1999 每種基因的數(shù)據(jù)以行表示 每個(gè)實(shí)驗(yàn)用列表示 顏色強(qiáng)度表示對(duì)照和實(shí)驗(yàn)cDNA的比率 比率相同時(shí)為1 結(jié)果為紅色表示mRNA增加 綠色表示減少 灰白色表示缺乏 兩種基因的相似性用Pearson相關(guān)公式或Euclidian測(cè)距公式計(jì)算 DNA微矩陣分析軟組織肉瘤表達(dá)KavineMaillardetal 1999 cDNAs進(jìn)行DNA表達(dá)矩陣 PCR產(chǎn)物包被在經(jīng)賴氨酸處理的玻片上 用Cys3 和Cys5 標(biāo)記的cDNA進(jìn)行雜交 洗滌后用Scanarray3000掃描儀測(cè)定矩陣 表達(dá)數(shù)據(jù)儲(chǔ)存在ACeDB數(shù)據(jù)庫(kù)中 根據(jù)數(shù)據(jù)表達(dá)類型區(qū)分不同的基因 微矩陣分析DNA和蛋白表達(dá)HolgerEickhoffetal 1999 根據(jù)已有的序列數(shù)據(jù) 組合800000人類EST序列 已重矩陣了38000克隆用于RNA表達(dá)分析 克隆經(jīng)PCR擴(kuò)增后共價(jià)結(jié)合于玻片上 每張玻片固定19200個(gè)基因片段 標(biāo)記人組織RNAs與被選的38000人基因片段的矩陣進(jìn)行雜交 比較健康與疾病組織的圖象 用軟件分析點(diǎn)識(shí)別和點(diǎn)定量 使用寡聚核苷酸鑒定新的cDNA克隆 和進(jìn)入表達(dá)載體 使相應(yīng)蛋白能直接表達(dá) 矩陣后可分析蛋白 蛋白和蛋白 DNA的關(guān)系 生物芯片相關(guān)儀器 點(diǎn)陣儀 制備芯片 點(diǎn)樣針分為實(shí)心和空心兩種 點(diǎn)樣方式有非接觸噴點(diǎn)和接觸點(diǎn)樣兩種 雜交儀 全自動(dòng)完成調(diào)節(jié) 加探針 漂洗和熱循環(huán)的雜交過程 掃描儀 激光共聚焦或CCD直接成像分析結(jié)果 QBot 超高解析基因篩選暨排列分析儀 基因菌落篩選 ColonyPicking 3500 h基因排列打點(diǎn) Gridding 100000 h基因復(fù)制 Replication 96 96 96 384基因重新排列 Re Arraying 正確的基因置復(fù)制盤基因微矩陣排列 Micro Arraying 20000 片全自動(dòng)液體分注系統(tǒng)