PCR的實(shí)驗(yàn)步驟

總RNA的抽提1. 勻漿 1份樣本+3份抽提劑，加樣槍吹打幾次，劇烈渦旋混勻至少1分鐘，在15-30條件下孵育5分鐘以使核蛋白體完全分解。2. 樣品可在-60-70保存至少1個(gè)月。3. 分離 15份抽提劑+4份氯仿，用力搖晃試管15秒，在30條件下孵育2-15分鐘，2-8下以不超過12000*g的離心力高速冷凍離心15分鐘。4. 沉淀 將水樣層轉(zhuǎn)移到一干凈的試管中，3份抽提劑+2份異丙醇，在15 -30C條件下孵育10分鐘并在28C下以不超過12,000g的離心力高速冷凍離心10分鐘。5. 漂洗 移去上層懸液。3份抽提劑+至少4份75%乙醇。溶于75%的乙醇在28C至少可以保存一周，在520C下至少可保存一年。旋渦振蕩混合樣品并在28C下以不超過7,500g的離心力高速冷凍離心5分鐘。6. 再溶解 空氣干燥或真空干燥510分鐘，分幾次移取無(wú)RNA酶的水來(lái)溶解RNA，并在5560C下孵育10分鐘。RNA完整性檢測(cè)1. 電泳緩沖液 Tris 242g+乙酸 57.1ml+0.5M EDTA200mldH2O 補(bǔ)足至1000ml （貯存液），使用時(shí)按1：49的比例稀釋成工作液。2. 制膠 (大膠用70ml,小膠用50ml):稱取0.7 g(0.5 g)瓊脂糖置于錐形瓶中,加入70 ml(50ml)1TAE,瓶口倒扣小燒杯.微波爐加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化,將冷卻至65左右的瓊脂糖凝膠液加入溴化乙錠，充分搖勻（即成1.0%瓊脂糖凝膠液）。3. 制板 取電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽(制膠槽)洗干凈,晾干；放入制膠玻璃板.取透明膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好,形成模子.將內(nèi)槽置于水平位置,并在距離底板0.51.0mm的位置上放置梳子；將冷卻到65左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上（凝膠的厚度在35mm之間）,使膠液緩慢展開,直到整個(gè)玻璃板表面形成均勻膠層；室溫下靜置（30min左右）直至凝膠完全凝固,當(dāng)膠正凝固時(shí)，準(zhǔn)備RNA樣品并取適量（如5l）加1l加樣緩沖液混合，加樣液中包含染料溴酚藍(lán)BPB；垂直輕拔梳子,取下膠帶,將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中，加樣孔一側(cè)靠近陰極（黑末端），注入適量的TAE緩沖液，通常緩沖液高于膠面1cm。4. 加樣 加RNA樣品及時(shí)進(jìn)行電泳使吸管與加樣孔垂直（使吸管尖端剛好在加樣孔開口之下）緩慢將RNA樣品加入加樣孔中。5. 電泳 加樣完畢后，正確連接電泳槽和電源（黑的連陰極、紅的連陽(yáng)極），在打開電源之前設(shè)定好電壓和時(shí)間，電壓100mV, 時(shí)間30min。負(fù)極附近的鉑絲會(huì)有氣泡產(chǎn)生。6. 凝膠攝影7. 測(cè)純度和濃度反轉(zhuǎn)錄1. 去除基因組DNA反應(yīng) 于冰上配制反應(yīng)混合液2(2ul）+1(1ul)+6(?ul)+RNA(不超過1ug)，應(yīng)先按反應(yīng)數(shù)+2的量配制Master Mix，然后再分裝到每個(gè)反應(yīng)管中，最后加入RNA樣品。42 2 min（或者室溫5 min*2），放于4。2. 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 在冰上進(jìn)行，先按反應(yīng)數(shù)+2的量配制Master Mix3（1ul）+5(1ul)+4(4ul)+6(4ul)，然后再分裝10 l 到每個(gè)反應(yīng)管中，輕柔混勻后立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。37 15 min, 85 5 sec,放于4。qRT-PCR1. 反應(yīng)液配制在冰上進(jìn)行，配置的預(yù)混液體積要至少多于所有反應(yīng)用總體積的10%。2. 按照不同儀器的操作進(jìn)行。瓊脂糖凝膠濃度線形DNA的最佳分辨范圍0.