GSEA檢測(cè)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移負(fù)相關(guān)基因

.,CYTOBAND-BASEDGENESETENRICHMENTANALYSISDETECTEDSPARCL1ASAMOLECULARMARKEROFCOLORECTALCANCERLIVERMETASTASIS結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移負(fù)相關(guān)基因：SPARCL1的發(fā)現(xiàn)與功能研究,葛維挺，虞舒靜，胡涵光，張航，陳華溶，鄭樹(shù)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)部附屬第二醫(yī)院腫瘤研究所，教育部惡性腫瘤預(yù)警與干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,.,研究背景,大腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一發(fā)病率35位死亡率45位大腸癌肝轉(zhuǎn)移治療失敗的主要原因之一肝臟遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的最主要轉(zhuǎn)移部位預(yù)后較差，中位生存期為510個(gè)月大腸癌死亡病人（尸檢）可發(fā)現(xiàn)3681的肝轉(zhuǎn)移,.,研究目的,尋找腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶特性相似轉(zhuǎn)移決定于原發(fā)灶通過(guò)比較伴肝轉(zhuǎn)移和無(wú)轉(zhuǎn)移的腸癌原發(fā)灶來(lái)尋找轉(zhuǎn)移相關(guān)基因,BrabletzT,NatureRevCancer2005,.,材料與方法,基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，芯片類型：Affymetrix伴肝轉(zhuǎn)移腸癌原發(fā)灶組織：經(jīng)病理證實(shí)有肝轉(zhuǎn)移灶無(wú)轉(zhuǎn)移腸癌組織：手術(shù)后經(jīng)隨訪三年以上無(wú)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,.,GSEA：GeneSetEnrichmentAnalysis，基因富集分析方法一種生物信息學(xué)方法，用來(lái)確定一組預(yù)先定義的基因在兩組表型不同的樣本間是否有表達(dá)差異。預(yù)定義的基因：如屬于同一Pathway的基因,定位于同一Cytoband的基因本研究中用來(lái)發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)存在差異表達(dá)的染色體區(qū)帶,Subramanianet.al,PNAS,2005,.,基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的GSEA分析表明：4q22為腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)染色體顯帶，所包含的基因在無(wú)轉(zhuǎn)移和伴肝轉(zhuǎn)移腸癌間表達(dá)差異顯著SPARCL1基因?yàn)?q22中最重要的基因（權(quán)重最高）,無(wú)轉(zhuǎn)移腸癌伴肝轉(zhuǎn)移腸癌,.,SPARCL1基本情況,定位于人類染色體4q22，基因大小為35kb，由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成mRNA長(zhǎng)度是3kb，編碼664個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量約為71kDa，存在多個(gè)糖基化位點(diǎn)分泌型的基質(zhì)細(xì)胞糖蛋白，參與多項(xiàng)機(jī)體生理過(guò)程，如細(xì)胞黏附，細(xì)胞增殖，肌肉分化以及B淋巴細(xì)胞成熟等在非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、慢性粒細(xì)胞白血病中表達(dá)下調(diào)，在肝癌中表達(dá)上調(diào)SPARCL1mRNA的定量，SPARCL1蛋白的免疫組化無(wú)轉(zhuǎn)移腸癌,伴肝轉(zhuǎn)移腸癌,肝轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)情況,.,SPARCL1基因低表達(dá)與腸癌肝轉(zhuǎn)移有關(guān),表達(dá)低：伴肝轉(zhuǎn)移腸癌肝轉(zhuǎn)移灶表達(dá)高：無(wú)轉(zhuǎn)移腸癌差異顯著，P=0.007,組織中SPARCL1mRNA定量分析,.,SPARCL1蛋白低表達(dá)與腸癌肝轉(zhuǎn)移有關(guān),表達(dá)低：伴肝轉(zhuǎn)移腸癌肝轉(zhuǎn)移灶表達(dá)高：無(wú)轉(zhuǎn)移腸癌差異顯著，P=0.004SPARCL1蛋白表達(dá)差異與mRNA一致,SPARCL1蛋白的免疫組化分析,.,SPARCL1表達(dá)載體構(gòu)建及抗體制備構(gòu)建帶有His標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pET-22b-SPARCL1構(gòu)建用于真核表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN-SPARCL1合成多肽作為抗原，制備兔多克隆抗體及鼠單克隆抗體SPARCL1蛋白重組表達(dá)和純化pET-22b-SPARCL1轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌E.coli(BL21(DE3)/Polys)擴(kuò)大培養(yǎng)并以IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)Ni2+金屬螯合層析柱純化,.,SPARCL1功能研究,腸癌細(xì)胞系中高表達(dá)SPARCL1不影響：細(xì)胞周期和增殖能力影響：遷移和侵襲能力,.,SPARCL1蛋白表達(dá)與預(yù)后,生存分析175例結(jié)直腸癌病人P=0.025SPARCL1表達(dá)高者預(yù)后好,SPARCL1表達(dá)與生存時(shí)間,.,結(jié)合其他標(biāo)志物判斷預(yù)后,多標(biāo)志物生存分析P53、MAPK、E-cadherin、MSH2、ADCY-2、Shp2、SPARCL1遺傳算法支持向量機(jī)P53+SPARCL1的模型可更好判斷預(yù)后,.,SPARCL1基因的低表達(dá)與腸癌肝轉(zhuǎn)移有關(guān)SPARCL1基因可能通過(guò)抑制細(xì)胞的遷移能力影響腫瘤轉(zhuǎn)移SPARCL1表達(dá)高低可幫助判斷腸癌病人的預(yù)后，結(jié)合經(jīng)典腫瘤標(biāo)志物如P53構(gòu)建的多標(biāo)志物模型可更好判斷預(yù)后SPARCL1為分泌型蛋白，是潛在血清標(biāo)志物腫瘤原發(fā)灶的分子事件是導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的主要因素