【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）嗜線蟲致病桿菌北京變種CB6菌株殺蟲蛋白的分離和純化農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治碩士論文

密級 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 嗜線蟲致病桿菌北京變種 株 殺蟲蛋白的分離和純化 o. y of I 摘 要 嗜線蟲致病桿菌北京變種 (株是從北京郊區(qū)土壤中分離的小卷蛾斯氏線蟲 (腸道內(nèi)所分離到的共生細(xì)菌，已經(jīng)鑒定并定名。研究表明該菌株具有良好的殺蟲活性。為挖掘這一本土細(xì)菌資源，本研究將其與另9 個昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌菌株進(jìn)行了殺蟲活性比較，對 10 個不同來源的昆蟲病原線蟲共生菌菌株胞內(nèi)和胞外產(chǎn)物進(jìn)行分離，將各產(chǎn)物的可溶性蛋白提取，并分別進(jìn)行生物測定，結(jié)果表明 此基礎(chǔ)上以 株作 為研究材料，分離純化其胞內(nèi)和胞外的殺蟲活性蛋白，建立一套純化該活性蛋白的技術(shù)參數(shù)，并對殺蟲蛋白的特性進(jìn)行了初步鑒定。 現(xiàn)將主要研究結(jié)果總結(jié)如下： 1 測定的 10 個菌株發(fā)酵液均對棉鈴蟲和甜菜夜蛾幼蟲有口服毒性，活性物質(zhì)的產(chǎn)生部位在菌體胞內(nèi)和胞外均有。不同菌種或同一菌種的發(fā)酵液、胞內(nèi)或胞外產(chǎn)物和菌體碎片的殺蟲活性不盡相同，一般胞內(nèi)產(chǎn)物的活性要高于胞外。胞內(nèi)胞外總蛋白的生測結(jié)果初步斷定 10 個供試菌株所表現(xiàn)出的殺蟲活性物質(zhì)主要是蛋白類。 2 建立了一條有效純化 株殺蟲蛋白的技術(shù)路線，通過該純化層析方案能獲得純化倍數(shù)較高 的目標(biāo)蛋白。其基本參數(shù)包括： 硫酸銨鹽析：最佳硫酸銨飽和度為 20 50；離子交換層析：使用 F 層析柱，洗脫低鹽為 25高鹽為 1 脫高鹽體積范圍 1530%；疏水層析：使用 脫高鹽為 3 25低鹽為 25凝膠層析：使用 6/10 層析柱，洗脫 5 通過該純化技術(shù)路線所獲得的目標(biāo)蛋白濃度為 現(xiàn)出對棉鈴蟲初孵幼蟲 生長抑制率。 3 從 株胞內(nèi)和胞外所獲得的目標(biāo)蛋白 明分子量都大于 669泳帶位置相同。該目標(biāo)蛋白 明， 2 個目標(biāo)蛋白都只出現(xiàn)一條分子量約為 220帶。純化該目標(biāo)蛋白的層析技術(shù)完全相同。這說明 株胞內(nèi)和胞外所產(chǎn)的目標(biāo)蛋白可能是同一種蛋白。 4 目標(biāo)蛋白的紫外吸收光譜在 250 290有吸收值。蛋白染色試驗(yàn)結(jié)果表明，目標(biāo)蛋白 不是脂蛋白，也不是糖蛋白。 株發(fā)酵液中具有殺蟲活性的物質(zhì)為蛋白質(zhì)，該種蛋白質(zhì)具有較高的生物活性，嚴(yán)重抑制棉鈴蟲幼蟲的取食和生長發(fā)育。本研究首次報道了 株胞內(nèi)和胞外所產(chǎn)殺蟲蛋白具有相似性，為開展胞內(nèi)胞外殺蟲蛋白的來源關(guān)系的研究奠定基礎(chǔ)。本研究所建立的純化該類殺蟲蛋白的技術(shù)路線，為研究該菌株殺蟲蛋白的作用機(jī)理以及為該殺蟲蛋白基因的克隆提供了依據(jù)和基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞 ：嗜線蟲致病桿菌；殺蟲蛋白；生物活性；分離純化 B6 is a of of It a To in . of 0 of It . a of of of of as 1. 0 of of a in of of of 0 2. A to of . of 0 F 5 is at 5 F 25 5 6/10 5 of . 3. of of . 69a 220kD of as 4. on 50of In it of of . a to It of In a to of . on of of 錄 摘 要 . I . 錄 . 一章 引 言 . 1 蟲病原線蟲共生菌 致病桿菌研究現(xiàn)狀 . 1 病桿菌生物學(xué)特征 . 1 病桿菌分類 . 2 病桿菌所產(chǎn)生的活性物質(zhì) . 2 病桿菌安全性 . 3 病桿菌產(chǎn)生的殺蟲物質(zhì)研究進(jìn)展 . 4 蟲活性物質(zhì)發(fā)現(xiàn) . 4 蟲活性物質(zhì)產(chǎn)生 . 5 蟲活性物質(zhì)作用機(jī)理 . 5 蟲蛋白的基因克隆 . 7 望 . 8 究目的和意義 . 9 究內(nèi)容、方法和技術(shù)路線 . 9 究內(nèi)容 . 9 究方法和技術(shù)路線 . 10 第二章 昆蟲病原線蟲共生菌 殺蟲物質(zhì)的分離 . 11 驗(yàn)材料 . 11 試菌株 . 11 試?yán)ハx . 12 養(yǎng)基和試蟲飼料 . 12 要化學(xué)試劑 . 12 白質(zhì)電泳試劑 . 12 驗(yàn)儀器 . 14 驗(yàn)方法 . 14 生菌的培養(yǎng) . 14 酵液處理 . 14 菌株胞內(nèi)和胞外產(chǎn)物的提取 . 15 V 同菌株胞內(nèi)和胞外物質(zhì)殺蟲活性生物測定 . 15 內(nèi)胞外粗蛋白的提取 . 16 內(nèi)胞外粗蛋白濃度測定 . 16 內(nèi)胞外粗蛋白電泳 . 17 內(nèi)胞外粗蛋白殺蟲活性生物測定 . 19 2. 3 結(jié)果與分析 . 19 同菌株胞內(nèi)和胞外物質(zhì)對甜菜夜蛾初孵幼蟲的活性 . 19 同菌株胞內(nèi)和胞外產(chǎn)物對棉鈴蟲初孵幼蟲的活性 . 20 白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線 . 20 同菌株胞內(nèi)和胞外粗蛋白濃度的比較 . 21 同菌株蛋白的 果 . 22 同菌株蛋白的 果 . 23 同菌株胞內(nèi)和胞外粗蛋白對棉鈴蟲初孵幼蟲的活性 . 24 結(jié) . 25 第三章 嗜線蟲致病桿菌北京變種 株殺蟲蛋白的分離和純化 . 26 驗(yàn)材料 . 26 試菌株 . 26 試?yán)ハx . 26 養(yǎng)基 . 26 驗(yàn)主要試劑 . 26 驗(yàn)儀器 . 27 驗(yàn)方法 . 28 株產(chǎn)活性物質(zhì)最佳培養(yǎng)時間確定 . 28 酵液預(yù)處理和胞內(nèi)胞外蛋白粗提液制備 . 28 淀目標(biāo)蛋白最適硫酸銨飽和度范圍確定 . 28 子交換層析純化目標(biāo)蛋白 . 30 水層析純化目標(biāo)蛋白 . 31 膠層析純化目標(biāo)蛋白 . 31 白樣品濃縮 . 31 標(biāo)蛋白純度檢測和純化方案評價 . 31 果與分析 . 32 株產(chǎn)活性物質(zhì)的最佳培養(yǎng)時間 . 32 淀活性蛋白的最佳硫酸銨飽和度 . 32 子交換法分離目標(biāo)蛋白 . 34 水層析的結(jié)果 . 37 膠層析的結(jié)果 . 38 蛋白的純度和純化方案的評價 . 38 結(jié) . 40 第四章 嗜線蟲致病桿菌北京變種 株殺蟲蛋白的鑒定和活性 . 41 驗(yàn)材料 . 41 試菌株 . 41 試?yán)ハx . 41 養(yǎng)基 . 41 驗(yàn)主要試劑 . 41 白質(zhì)電泳試劑 . 42 驗(yàn)儀器 . 42 驗(yàn)方法 . 43 白質(zhì)樣品制備 . 43 內(nèi)和胞外活性蛋白比較和活性帶確定 . 43 蟲蛋白的紫外吸收光譜 . 44 蟲蛋白的鑒定 . 44 蟲蛋白殺蟲活性 . 45 果與分析 . 45 內(nèi)和胞外活性蛋白比較和活性帶確定 . 45 蟲蛋白的紫外吸收光譜 . 46 蟲蛋白鑒定結(jié)果 . 47 蟲蛋白殺蟲活性 . 48 結(jié) . 49 第五章 結(jié)論與討論 . 50 論 . 50 新點(diǎn) . 51 論 . 51 參考文獻(xiàn) . 53 致 謝 . 59 作者簡歷 . 60 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院碩士學(xué)位論文 第一章 引 言 1 第一章 引 言 昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌是寄生于昆蟲病原線蟲腸道內(nèi)的一類細(xì)菌（ 1937）。該菌屬腸桿菌科 ( 1979 )，革蘭氏染色呈陰性。包括致病桿菌屬（ 光桿狀菌屬（ et 它們分別與斯氏線蟲屬（ 異小桿線蟲屬（ 的線蟲共生。共生菌與線蟲互惠共生，線蟲為細(xì)菌提供腸道內(nèi)適生環(huán)境，將其 攜帶進(jìn)入寄主昆蟲血腔，并釋放到血腔中，使共生菌獲得充分營養(yǎng)迅速生長繁殖，產(chǎn)生毒素和抑菌物質(zhì)， 48h 殺死寄主昆蟲 ( 1993)；同時，共生菌能夠?yàn)榫€蟲分解昆蟲體內(nèi)物質(zhì)，將其分解為線蟲可以吸收的小分子物質(zhì)，供線蟲發(fā)育生長，并產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)抑制其它雜菌生長，保證線蟲生長繁殖的條件。線蟲離體培養(yǎng)的 研究表明，共生菌的質(zhì)量、數(shù)量、種群動態(tài)直接或間接地影響著線蟲 本身 的質(zhì)量和產(chǎn)量 （ 966； 994； 993； 995） 。 昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌能產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，為寄主線蟲提供一個適合生長的小環(huán)境，這一生物學(xué)特性，引起了有關(guān)學(xué)者的興趣。 人們在此領(lǐng)域經(jīng)長 期的研究中發(fā)現(xiàn)，該類細(xì)菌產(chǎn)生的多種代謝產(chǎn)物不僅能抑制多種細(xì)菌和真菌的生長（ 1980；楊秀芬等， 1998； 2001；楊懷文等，2000； ），還具有殺蟲活性（ et 1995；王立霞等， 2000；劉崢等， 2002；李明華等， 2003；潘映紅， 2004）和抑制腫瘤細(xì)胞生長的活性（ 1998； et 2001； 劉衛(wèi)京等， 2002）。因此從該類特異生境細(xì)菌中尋找具有新活性、新功能的研究已成為國內(nèi)外科學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)。 蟲病原線蟲共生菌 致病桿菌研究 現(xiàn)狀 病桿菌生物學(xué)特征 致病桿菌 (一類兼性厭氧、化能異養(yǎng)的革蘭氏陰性細(xì)菌，該菌寄生于斯氏線蟲(道內(nèi)，與線蟲互惠共生，屬腸桿菌科 (共生菌與線蟲存在著高度的共生專一性。在自然條件下，一種線蟲只能與一種共生菌共生（ 1990），而一種共生菌可與幾種線蟲共生，如共生菌 與 S. S. S. 線蟲共生。 型態(tài)變異是致病桿菌的一個重要特征。根據(jù)其在瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生菌落的形態(tài)以及它們在鑒別培養(yǎng)基 吸收染料的能力不同，可分為型和型（ 980）。 （ 1993）通過對 譜分析證明， 兩個菌型同源性差異不顯著。 劉崢（ 2003）通過對嗜線蟲致病桿菌北京變種 株的 I、 菌 16列分析后發(fā)現(xiàn)，通過對 紋圖譜分析，得到相似系數(shù) 說明二型的 在微小差異。大量研究已證明，線蟲和 I 型菌一起培養(yǎng)時，其產(chǎn)量明顯高于與 菌 起培養(yǎng)時的中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院碩士學(xué)位論文 第一章 引 言 2 產(chǎn)量（ 1990）。這是由于型菌較型菌更易利用外界營養(yǎng)物質(zhì)為線蟲提供更好的生存環(huán)境。在離體培養(yǎng)條件下，共生菌易發(fā)生型態(tài)變異。型菌和 菌所產(chǎn)代謝物及其生物活性也存在明顯差異，型菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)高， 菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)低甚至沒有，因此，要想獲得穩(wěn)定的、高活性物質(zhì)，必須控制共生菌的型態(tài)變異。致病桿菌發(fā)生型態(tài)變異的機(jī)制目前尚不完全清楚，但其型態(tài)變異引起產(chǎn) 生一系列活性物質(zhì)的不同，使得致病桿菌型態(tài)變異的機(jī)制研究越來越受到重視。 病桿菌分類 1959）最早報道從昆蟲病原線蟲 內(nèi)分離到 具有抑菌活性的共生菌菌株 來才定名）。早期的共生菌分類主要依據(jù)寄主線蟲的種類。隨著昆蟲病原線蟲分類地位的不斷改變，共生菌的分類地位也產(chǎn)生一系列的變動。 1979）根據(jù)形態(tài)和生理生化特征，將共生菌歸在腸桿菌科下，并將其命名為 一個新屬 致病桿菌屬（ 當(dāng)時僅包含兩個種 X. X. 且只能分別從兩個線蟲屬 分離獲得。 1988）測定了 21 個菌株（包括、型）的 240 項(xiàng)表型及生理生化指標(biāo)，采用數(shù)值分類的方法將 X. 亞種上升為種的水平，形成 5 個種： X. X. X. X. 1990）利用寡核苷酸探針與 16S 列可變區(qū)的互補(bǔ)性，證明了 致病桿菌 區(qū)分為 5 個種的可行性。 1993）通過 交實(shí)驗(yàn)及生物學(xué)特性的不同，正式將共生菌分為兩個屬：和斯氏線蟲共生的定為 異小桿線蟲共生的定為 確定了致病桿菌中已定名的有 5 個種。后來隨著共生菌資源的逐漸豐富以及分類技術(shù)的不斷改進(jìn)，目前 定名了 9 個種。 病桿菌所產(chǎn)生的活性物質(zhì) （ 1）抑菌物 質(zhì) 上世紀(jì) 90 年代研究證明，昆蟲病原線蟲共生菌所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)可以抑制多種病原細(xì)菌、酵母菌和真菌的生長。主要包括 藤黃微球菌 黃色葡萄球菌 狀芽孢桿菌 粘芽孢桿菌 B. 草芽孢桿菌 B. 云金桿菌 B. 腸桿菌 雷氏菌 普通變形桿菌 光假單孢菌 腐歐文氏菌 索氏志賀氏菌 ，此外對多種植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑制活性，加拿大科學(xué)家 (1994)研究發(fā)現(xiàn)致病桿菌屬中的 2 種共生菌發(fā)酵液對 7 種植物病原真菌具有良好的抑菌效果，其中波氏致病桿菌（ 謝物對 P. 楊秀芬 等報道 （ 1998） 致病桿菌的 5 個供試 菌株 代謝產(chǎn)物 對 9 種 植物病原菌有較強(qiáng)的抑制 作用， 對