【畢業(yè)學位論文】枯草芽孢桿菌 B-332 菌株發(fā)酵條件及其抗菌物質分離純化的研究碩士論文

密級： 論文編號： 中國農業(yè)科學院 學位論文 枯草芽孢桿菌 株發(fā)酵條件 及其抗菌物質分離純化的研究 on 士研究生：劉 雪 指 導 教 師：朱昌雄 研究員 申請學位類別：理學碩士 專 業(yè)：微生物學 研 究 方 向：生物工程 培 養(yǎng) 單 位：農業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所 研究生院 提交日期 2007 年6 月 on s. 2007 要 稻瘟病是全世界稻區(qū)危害最嚴重的水稻病害之一，每年對世界水稻產(chǎn)量的影響高達 30%，現(xiàn)有防治稻瘟病的手段多以抗性植株和化學農藥為主，化學農藥會造成環(huán)境的污染及生態(tài)平衡的破壞，生物農藥具有安全、無毒副作用、不污染環(huán)境等優(yōu)點，大力發(fā)展生物農藥已成為必然的趨勢。因此，對水稻稻瘟病的植病生防領域研究具有重要的現(xiàn)實意義。本研究以枯草芽孢桿菌 株為實驗材料，通過摸索該菌株搖瓶發(fā)酵工藝的技術和數(shù)據(jù)，確定該菌株發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，為該菌株的發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎；此外，分離純化和獲得各分離的組分，測定它們質譜圖及抗菌活性，對解析分離各組分對稻瘟病菌抑制的作用機理，揭示該菌株該菌株對稻瘟病菌防治的深層原因具有十分重要的意義。 菌粗提物含量作為輔助標準。采用結晶紫染色法和平板傾注法相結合的方法測量發(fā)酵液中的芽孢數(shù)量，用紫外分光光度計法測量發(fā)酵液中抗菌粗提物的含量。明確了發(fā)酵液中抗菌粗提物的濃度與其在 長下的吸收值之間的線性關系，標準方程為 y=和效果較好。 2對枯草芽孢桿菌 株搖瓶發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化，確定正交優(yōu)化后的培養(yǎng)基主要成分為：豆餅粉 蔗糖 硫酸銨 檸檬酸三鈉 ；培養(yǎng)條件方面，確定種齡為18h、接種量為 10%，對裝量、溫度和轉速等條件優(yōu)化后確定裝量 8000度 30、轉速 180r/本明確了該綜合條件下發(fā)酵過程的參數(shù)變化規(guī)律，發(fā)酵周期終點為 72h，此時芽孢數(shù)為 011出始條件的 09高了 ， 3等電點法提取該抗菌粗提物，即對該菌株發(fā)酵液離心后，將其 調至 菌粗提物可以完全沉淀出來，抗菌粗提物經(jīng)過高效液相色譜到 5 個組分，按照出峰時間順序，它們的荷質比（ m/z）分別為 測4 個組分的結構（荷質比（ m/z）為 除外） ， 依次為 ( (50% (50% ( (它們結構間的區(qū)別在于相差 1 個或幾個 組分均對稻瘟病菌有抑制作用，荷質比（ m/z）為 分的抑制效果最強，并且這 3 種組分對稻瘟病菌成熟菌絲體的致畸作用與 株的致畸作用相同，都是使稻瘟病菌菌絲體膨大、溶漲、破裂，這個結果更加證實了該菌株荷質比（ m/z）為 分是 株產(chǎn)生對稻瘟病菌有抑制作用的主要原因。 關鍵詞； 枯草芽孢桿菌，分離純化，芽孢，發(fā)酵，稻瘟病菌 is of on It 0% of to To of of to a is In by of as of of by of by a V of it a on of C . to of is of of a In of at ( In of of of of of 2h, 011/mL,of 13mg/錄 第一章 緒論 . 1 稻瘟病菌的研究進展 . 1 稻瘟病菌生理小種的特點 . 1 稻瘟病菌侵染途徑的研究進展 . 2 枯草芽孢桿菌產(chǎn)生抗菌物質 . 3 核糖體合成途徑產(chǎn)生的抗菌物質 . 3 非核糖體合成途徑產(chǎn)生的抗菌物質 . 4 枯草芽孢桿菌產(chǎn)品的應用情況 . 6 國外生防產(chǎn)品應用情況 . 6 國內生防產(chǎn)品應用情況 . 7 其他方面的應用情況 . 7 研究目的和意義 . 9 第二章 枯草芽孢桿菌 株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的研究 10 材料和方法 . 10 試驗材料 . 10 研究方法 . 12 果與分析 . 17 芽孢率統(tǒng)計方法的比較 . 17 活菌計數(shù)法的比較 . 18 搖瓶種子菌體生長曲線測定結果 . 19 基本發(fā)酵培養(yǎng)基成分的篩選 . 20 種齡對芽孢數(shù)量的影響 . 20 接種量對芽孢數(shù)量的影響 . 21 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的正交優(yōu)化 . 21 搖瓶發(fā)酵條件的正交優(yōu)化 . 23 搖瓶發(fā)酵代謝曲線 . 24 小結 . 26 第三章 枯草芽孢桿菌 株有效抗菌物質的分離純化 . 27 材料和方法 . 27 試驗材料 . 27 研究方法 . 27 果與分析 . 29 有效抗菌物質的生物測定方法 . 29 有效抗菌物質的紫外分光光計測定法 . 31 生物法與紫外分光光度計法測定結果的相關性對比 . 32 有效抗菌物質的分離結果及分子量測定 . 33 分離的各組分對稻瘟病菌的拮抗效果 . 34 離的組分對菌絲體的致畸作用 . 35 小結 . 36 第四章 全文結論 . 38 結論 . 38 討論 . 39 參考文獻 . 40 附錄 . 45 致謝 . 49 作者簡歷 . 50 中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 1第一章 緒論 稻瘟病菌的研究進展 水稻是中國的主要糧食作物之一，農業(yè)部 2005 年的統(tǒng)計顯示，全國水稻播種面積為 28,847千公頃（農業(yè)部， 2006） ，占糧食播種總面積的 稻谷產(chǎn)量為 18,059 萬噸，占糧食總產(chǎn)量的 稻瘟病是水稻最主要的病害之一，廣泛分布在世界各水稻產(chǎn)區(qū)。據(jù)英聯(lián)邦真菌研究所 (記載， 85 個國家和地區(qū)曾發(fā)生過此病害，且危害以非洲、亞洲和拉丁美洲最重，稻瘟病對水稻產(chǎn)量造成的損失可高達 11%至 30% (1997)，部分田塊甚至顆粒無收 ( 1985)；在1975的 16 年間，由稻瘟病菌引起的全球糧食損失高達 噸 (et 1997) ，全球范圍內，每年由稻瘟病造成的水稻減產(chǎn)足以養(yǎng)活 6000 萬以上的人口。 水稻稻瘟病（ 又名稻熱病，俗稱火燒瘟、吊頭瘟、掐頸瘟等，主要危害寄主植物的地上部分。該病害的病原是稻瘟病菌，稻瘟病菌的有性態(tài)為 囊菌亞門 ；無性態(tài)為灰梨孢 半知菌亞門梨孢屬（朱獻豐， 2002） 。在 85 個國家都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)稻瘟病的發(fā)生，稻瘟病菌具有較廣的寄主范圍，除水稻外，它還可使 50 多種栽培作物和園林植物致病，例如大麥、小麥、穆子、草坪草等 (et 2003;0u 1985)。一年四季，稻瘟病菌的孢子在世界水稻種植地區(qū)的高濕度環(huán)境中都能存活，這造成了稻瘟病菌的廣泛傳播。而且，在生長的任何階段，這種真菌都能夠侵襲水稻，真菌孢子還易于在作物間傳播、在土地中潛伏，都能夠導致水稻的減產(chǎn)或倒伏。 稻瘟病菌生理小種的特點 生理小種具有多樣性的特點?？汕秩?40 多種禾本科植物以及其他寄主，涉及到 15 個科、 66個屬、 118 個種、 3 個亞種，并且存在致病分化的變異性（李成云， 1995；何玉仙， 1995） 。稻瘟病有很多種生理小種， 1955 年，日本首先建立起了一個 “稻瘟病菌小種協(xié)作研究項目 ”，到 70 年代，日本選出了 12 個鑒別品種（中國 4 個、熱帶 2 個、日本 6 個） ，鑒定出 13 個小種并分為 F，C，和 N 群（何月秋， 2001） 。自 60 年代起，印度、菲律賓、韓國、哥倫比亞等國家都積極開展了生理小種方面的研究（ H. 1985） 。日本又根據(jù) 基因對基因學說，對品種進行了抗病性分析，于 1976 年建立了一套具有已知抗病基因的 9 個（米 +梗）型品種組成的鑒別品系。我國稻瘟病菌遺傳多樣性的研究始于 1976 年，并于 1980 年篩選出特特普（ 、珍龍 13、四豐13、東農 363、關東 51、合江 18 和麗江新團黑谷等 7 個生理小種的鑒別品種，將中國稻瘟病菌劃分為 43 個生理小種。用 7 個中國統(tǒng)一的鑒別品種，對 1997采集自江蘇省吳江、高郵等5 個代表地區(qū)的 325 個稻瘟病菌株進行小種鑒別， 3 年共檢測到 21 個生理小種，其中， 種出現(xiàn)的頻率最高，達 (陸凡， 2002） ，并比較一致認為各地區(qū)生理小種的組成相對穩(wěn)定。隨著參試菌株的增多，各國發(fā)現(xiàn)的生理小種數(shù)也在增加（ ， 1991） 。 2005 年，韓國首爾大學對稻瘟病菌的基因研究取得突破進展，使建立一套適合于世界各稻區(qū)共同使用的鑒別品種（系）成為可能，科學家們在對萬多種稻瘟病病原菌變體生物學試驗后，確定了水稻稻瘟病中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 2病原菌的 741 種遺傳基因，其中 202 種是病原性遺傳基因。今后，科學家們將聯(lián)合生物學、遺傳學和電腦方面的專家，建立生物信息學研究體系，進一步分析稻瘟病病原菌遺傳基因之間的相互關系（ A， 2005） 。 生理小種具有易變性的特點。關于稻瘟病菌的變異能力，有人認為，菌株的生理小種是非常不穩(wěn)定的（ H.， 1985） ，單個病斑上分離的單孢菌株的致病性也不相同，田間稻瘟病菌株的組成也隨年度、季節(jié)而有所變異，繼代培養(yǎng)過程也可改變致病力（ 1990） 。有文獻報道，保存 10 年的稻瘟病菌小種的單孢菌株，每個小種保存菌分化形成數(shù)個小種，致病力也發(fā)生了變異，并且，從不同保存菌上重新分離出保持原小種致病力菌株的幾率也存在很大差異，利用重新分離單孢菌的方法可以獲得保持原小種致病力的穩(wěn)定菌株（周維佳， 1990） 。 對研究過的菌株再鑒定，結果與原來的結論不一致，并推斷，可能是他們接種時的條件差別導致他們的 論，也可能是植株生長狀況不一致或人為地判斷差別所致（ 1987） 。何月秋通過試驗也證實了 的觀點，即接種時的環(huán)境條件不穩(wěn)定是得出菌株高度變異的主要原因（何月秋， 2001） 。在眾多菌株中存在少數(shù)穩(wěn)定菌株，穩(wěn)定菌株的致病性在 2內不會明顯變異，但隨著保存時間的延長，菌株的生活力和致病性均有下降和減弱趨勢，轉管繼代是變異的促使因素，但大多數(shù)鑒別品種的致病性是比較穩(wěn)定的（王久林， 1993） 。 稻瘟病菌侵染途徑的研究進展 稻瘟病因危害時期、部位不同可分為苗瘟、葉瘟、葉枕瘟、節(jié)瘟、穗頸瘟、枝梗瘟和谷粒瘟等。其中以穗頸瘟對水稻的產(chǎn)量影響最大，以水稻葉片上的病害癥狀最為典型，即病斑呈梭形，中部壞死呈灰白色，病斑邊緣紅褐色 ( 1985) 。稻瘟病菌在病斑上產(chǎn)生分生孢子，借助風雨傳播進行再侵染，它侵染水稻的病害周期可以分為以下幾個時期： 尖端釋放出粘液 (稱 及發(fā)芽，使孢子附著于水稻葉片的表面； 管頂端膨大分化成特別的侵染結構即附著胞 ( C. 附著胞壁上沉積黑色素，胞內膨壓積累，這個細胞狀的微小氣泡的內壓是汽車輪胎內壓的 40 倍左右，可以炸開稻葉堅韌光滑的表面； D. 附著胞產(chǎn)生侵染栓直接穿透角質層和表皮細胞壁； 后，真菌釋放出含有一種酶的小囊，這種酶會破壞植物細胞壁，真菌就可以侵入細胞了； 后出現(xiàn)癥狀，新的分生孢子從水稻葉片的病斑處產(chǎn)生并釋放出來， G. 這些新形成的分生孢子重新侵染寄主，進入下一輪病害周期（周建明， 1999；林福呈， 2001； J,1994） 。病菌的菌絲體和分生孢子在病稻草、病谷上越冬，完成其侵染循環(huán)。病稻草上的病菌在干燥的環(huán)境下可以存活 7月，在北方可存活 I 年。而埋入地下或浸入水中 1 個月就全部死亡。散落田間的草上的病菌 4 個月死亡。病菌傳播主要靠風傳播，雨、水流、昆蟲也可傳播。天氣轉暖，又有雨的情況下，越冬病菌會大量復蘇，增殖，從堆在田邊的病稻草上轉移到水稻上。稻瘟病菌的侵染循環(huán)被認為植物病原真菌典型的植物一病原物互作模式而被廣泛研究。 稻瘟病病菌的基因組序列已于 2005 年 4 月完成（ 2005） 。最近， . 明了稻瘟病菌致病的一個關鍵基因 該基因負責產(chǎn)生一種在小囊形成過程中發(fā)揮重要作用的蛋白質，并查明了一個傳送引起稻瘟病的真菌的分泌系統(tǒng)。這一發(fā)現(xiàn)有助于更好地選擇育種，中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 3甚至通過基因工程手段培育抗稻瘟病菌的水稻新品種。這個突破使人們首次對這種疾病發(fā)生的過程有所了解，并使人們看到了開發(fā)一種環(huán)保殺真菌劑的希望，這種殺真菌劑針對的恰恰是這種病菌侵襲水稻的機理（ . 2006） 。 枯草芽孢桿菌產(chǎn)生抗菌物質 枯草芽孢桿菌 (一種嗜熱、好氧并產(chǎn)芽孢的 G+桿狀細菌，其生理特征豐富多樣，極易分離培養(yǎng)，能產(chǎn)生多種抗菌素和酶。枯草芽孢桿菌應用于植物病害生物防治的研究已經(jīng)有很多年的歷史，目前在黃瓜、辣椒、水稻、小麥、玉米等農作物病害上顯出較好的防治效果。近年來，科學家們從枯草芽孢桿菌產(chǎn)生拮抗物質的類型、分子作用機理及田間應用等方面開展了廣泛而深入的研究，為進一步明確枯草芽孢桿菌的作用機制和作用效果提供了科學依據(jù)。 早在 1921年，就有利用有益微生物應用于植物病害的防治的報道， 在 1924年就有文獻報道過枯草芽孢桿菌有降解作用， 現(xiàn)該菌株的次生代謝產(chǎn)物是分解作用的主要原因，而該菌株沒有直接起作用（ 1924）。早在 1945年， H， 1945），近一個世紀來，從枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物中分離純化出多種抗菌物質，并明確了一部分抗菌物質的組成、結構和生防作用，為枯草芽孢桿菌的植病生防領域的應用奠定了基礎，提供了可行性依據(jù)。 一般將枯草芽孢桿菌產(chǎn)生抗菌物質的途徑分為核糖體合成和非核糖體合成兩種。 核糖體合成途徑產(chǎn)生的抗菌物質 （ 1）細菌素 一般認為，細菌素是一種小分子量蛋白類抗菌物質，它由細菌產(chǎn)生，通常只對產(chǎn)生菌同種的其它菌株或親緣關系很近的種有作用，他們大多含有一些稀有的氨基酸結構，且一般是環(huán)肽。枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生 今為止， 研究較深的細菌素之一，它的前體是 56 個 肽，其中 24 個 信號肽，經(jīng)信號肽酶的切除和一系列修飾，如 水和 酯化都可以形成 32 個 活性小肽，它們具有抗酸和抗熱的特性。有不少關于枯草芽孢桿菌細菌素抑制結晶紫陽性細菌和真菌的報道。 從枯草芽孢桿菌中分離出一種分子量為 細菌素，它對對食品病原細菌 B. 抑制作用（ ， 1999） ，它可作為食品保鮮的抗菌物質。 谷類根際分離得到一株枯草芽孢桿菌 對食品腐敗病原菌中的霉菌、酵母、細菌都有一定的抑制作用（ ， 2000） 。 （ 2）酶類 真菌細胞壁的主要組分為幾丁質和 菌分泌幾丁質酶主要用于真菌細胞壁的降解和重組， (1 3)糖苷鍵。幾丁質酶與 丁質酶與 林珂， 2006； Y， 2000） ，還可以完全消解病原菌細胞壁，抑制病原菌生長，達到抗菌防病的目的。 林福呈等將分離的 株與立枯絲核菌 ( 終極腐霉 (西中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 4瓜枯萎病菌 (f. 峙培養(yǎng)， 4d 后，可使上述植物病原真菌的菌絲溶解，而其對植物病原真菌的拮抗真菌綠色木霉（ 的生長沒有影響（林福呈，2003） 。 顧真榮等從土壤中分離產(chǎn)幾丁質酶的 核的形成產(chǎn)生抑制作用（顧真榮， 2001），對油菜菌核病菌和水稻紋枯病菌顯出強烈的抑菌活性（顧真榮， 2005），并可用于防治番茄葉霉?。櫿鏄s， 2003）。 （ 3）活性蛋白質類 許多枯草芽孢桿菌生長代謝過程中會分泌一些抑制植物病害的活性蛋白，生防作用顯著。株能強烈抑制蘋果輪紋病菌（ 植物病原真菌。氨基酸組分分析表明，該蛋白含 11 種不同的氨基酸，尤其富含谷氨酸和半胱氨酸等。純化后的蛋白組分對蘋果輪紋病菌、蘆筍莖枯病菌等有很強的抑制作用，其抑菌機理主要是溶解細胞壁，造成菌絲畸形、孢子不發(fā)芽或發(fā)芽異常（胡劍， 1996） 。 還有一些未知蛋白在抑制植物病原菌方面也表現(xiàn)出強烈的作用。 株對水稻白葉枯病菌（ 強烈的抑菌作用，對中國各稻區(qū)的白葉枯病菌的 7 種致病型都有強烈的抑殺作用，它分泌的蛋白對水稻白葉枯病菌表現(xiàn)出良好的廣譜抗性以及豐富的抗菌活性峰（林東， 2001） ； 株能分泌多種抑菌蛋白，對水稻紋枯病菌和水稻惡苗病菌有較強的抑制作用（劉永峰， 2005） ； 株對桑炭疽病病原菌的菌絲生長和分生孢子的萌發(fā)具有較強的拮抗作用，其產(chǎn)生的蛋白能使菌絲生長受阻并產(chǎn)生畸形（劉振宇， 2005）。對 株產(chǎn)生的拮抗物質進行分離純化得到了抗菌蛋白，該抗菌蛋白在電泳中顯現(xiàn)出三條帶，熱穩(wěn)定性好，對部分蛋白酶敏感，對 產(chǎn)生的拮抗物質進行分離純化，得到一種抗菌蛋白 蛋白分子量為 59000，等電點為 白中含有糖及脂，含糖量為 6%，熱穩(wěn)定性好，對蛋白酶部分敏感。該蛋白含有 11 種不同的氨基酸，富含谷氨酸和半朧氨酸，缺少天冬氨酸。其抑菌機理主要是溶解細胞壁，造成菌絲畸形，孢子不發(fā)芽或發(fā)芽異常（胡劍， 1996） 。 1999 年，童有仁、馬志超等報道，從水稻葉面分離到一株抗水稻白葉枯病的枯草芽抱桿菌 株中提取的拮抗物質研究發(fā)現(xiàn)：該拮抗物質對熱穩(wěn)定，對胰蛋白酶不敏感，對蛋白酶 K、鏈霉蛋白酶 E 部分敏感，對氯仿部分敏感。該拮抗物質由兩組分組成： 示為單一蛋白帶，分子量5013 N 端測出殘基序列為 有仁， 1999） 。對 得到三種抗菌蛋白： 抗真菌蛋白 抗真菌環(huán)肽 行分析，該環(huán)肽分子量為 105713穩(wěn)定性較好，由 9 個氨基酸殘基組成，并通過比較，確認 一種新的環(huán)肽（劉伊強， 1994） 。 對 株產(chǎn)生的拮抗物質進行分離純化，得到一種抗菌蛋白 步判斷 子量為 1476蛋白質熱穩(wěn)定性好，對蛋白酶不敏感，對有機溶劑也不敏感，可能是一種環(huán)肽，也可能是含有非氨基酸組分的肽類化合物（何青芳，2002） 。 株抑菌機理主要是通過產(chǎn)生抗生代謝產(chǎn)物抑制病菌的抱子萌發(fā)和菌絲生長。抗菌物質無揮發(fā)性，為脂溶性和水溶性物質，主要為蛋白質類，分子量在 20間，在酸性條件和中性條件下熱穩(wěn)定性好，堿性條件下沒有熱穩(wěn)定性（葉華智， 2003） 。 非核糖體合成途徑產(chǎn)生的抗菌物質 脂肽類 ( 中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 5它們是一類小分子環(huán)脂肽類物質，由 7 個氨基酸和 1 個 成，其中包括伊枯草菌素 A、 B、 C、 D、 E 和芽孢菌素 (、 F、 L 等（ ， 1987），其中以 抗真菌的活性最強。表面活性素 (初由 （ ，1968）鑒定和命名，它的化學結構為一個 5脂肪酸通過 肽（ le 末端基團形成內脂（ ， 1969），被稱為標準表面活性素，它是已發(fā)現(xiàn)的最強的一類生物表面活性劑。 另一種研究得比較深入的脂肽類抗真菌素，包括 B。 株產(chǎn)生的 環(huán)狀脂肽，氨基酸結構為 中， 成內脂環(huán)狀結構（ ， 1986） 。 從 種對水稻紋枯和小麥赤霉病菌均有抑菌作用的抗菌肽 子量分別為 個 1個 1個 1個 3個 2個 個可能存在的 斷它們很可能是低分子量的環(huán)狀脂肽， 3個抗菌肽與 與 在分子量和氨基酸組成上十分相似，水溶性都非常好，但是理化性質不盡相同（劉靜， 2004）。枯草芽孢桿菌 3、 14和 15個碳原子的脂肪酸鏈以及 學文，2003） 。 多肽類物質 枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌多肽，包括環(huán)狀、線狀和分支環(huán)狀三種，分子量多在 1右。一些枯草芽孢桿菌菌株還能夠產(chǎn)生一種環(huán)狀 13 肽 B， 1963），結構為 株中分離出環(huán)狀多肽 子量為 14,497D， N 末端部分序列為 伊強， 1994）。多種植物病原真菌，例如水稻紋枯病菌 (稻瘟病菌 (有強烈抑制作用，純化該菌株抗菌活性物質得到拮抗環(huán)狀多肽 子量為 青芳，2002） 。 株能夠產(chǎn)生 種新型抗菌肽， 分子量分別為 了 3 個未知序列外，它們的 7 個氨基酸序