【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）設(shè)施辣椒根腐病病原鑒定及檢測(cè)技術(shù)研究植物病理學(xué)碩士論文

密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 設(shè)施 辣椒根腐病病原鑒定及檢測(cè)技術(shù)研究 I 摘 要 近年來(lái)，由于設(shè)施 辣椒 栽培面積的連年擴(kuò)大，輪作倒茬越來(lái)越困難，辣椒根 腐病 已經(jīng)成為我國(guó)北方設(shè)施辣椒 可持續(xù)發(fā)展的限制性因子之一。本論文針對(duì)辣椒根腐病病原不清，防治藥劑不得當(dāng)引起防效差的問(wèn)題，開(kāi)展了設(shè)施辣椒根腐病病原鑒定及檢測(cè)技術(shù)研究。 1 對(duì)來(lái)自 北京 陽(yáng)坊 、山東壽 光、遼寧瓦房店等地 不同辣椒產(chǎn)區(qū)的根腐病病原進(jìn)行了分離培養(yǎng)和鑒定，根據(jù)其 形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀、生化特性以及致病性測(cè)定 結(jié)果 ， 將該病原菌鑒定為辣椒疫霉 病原菌具孢子囊，形態(tài)變化大， 橢圓形、近球形、卵形或不規(guī)則形 ，孢子囊平均大小為 （ （ m，長(zhǎng)寬比為 突明顯，呈半球形，一般單乳突，偶見(jiàn)雙乳突，乳突長(zhǎng)為 原菌不產(chǎn)生 厚 垣孢子；除辣椒外，人工接種還可侵染黃瓜、番茄、茄子，不侵染油菜和白菜；對(duì)孔 雀石綠不敏感，能夠利用淀粉。 2 運(yùn)用免疫學(xué)技術(shù)，建立了檢測(cè)辣椒疫霉的間接 斑點(diǎn) 法。本研究 首先以辣椒疫霉菌體可溶性蛋白作為免疫原，通過(guò)免疫家兔制備了高效價(jià)的抗血清，并進(jìn)一步提取和純化了抗體 實(shí)驗(yàn)室條件下從樣品稀釋度、抗體孵育時(shí)間、抗體工作濃度、酶標(biāo)二抗孵育時(shí)間、酶標(biāo)二抗工作濃度等幾個(gè)方面對(duì) 測(cè)方法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化。結(jié)果顯示，在間接 中， 最佳封閉液及封閉時(shí)間分別為 372h； 抗體最佳工作濃度及孵育時(shí)間分別為 37 標(biāo)二抗的最佳工作濃度及孵育時(shí)間分別為 800和 37 2h；底物顯色的最佳作用時(shí)間為 37 15 中， 抗體最佳工作濃度為 原抗體間的最佳作用時(shí)間為 37 標(biāo)二抗的最佳工作濃度和孵育時(shí)間分別為 600 倍和 37 以上兩種檢測(cè)方法 的穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)，檢測(cè)的靈敏度高 ， 可用于田間實(shí)際檢測(cè)。 本研究 首次鑒定了 引起 我國(guó)北方 地區(qū)辣椒根腐病的病原為辣椒疫霉 ， 為正確用藥、合理防治上述地 區(qū)辣椒根腐病提供了理論依據(jù) ；同時(shí) 本研究 建立的辣椒疫霉檢測(cè)方法 ， 為 該 地區(qū) 設(shè)施 辣椒根腐病 的早期診斷與防治、病害的監(jiān)測(cè)和預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)提供了一條行之有效的技術(shù)手段。 關(guān)鍵詞： 辣椒根腐病 ， 辣椒疫霉 ， 病原鑒定 ， 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 ， 斑點(diǎn)免疫吸附測(cè)定 of in is of to in to in of is to to 1. to it to of (m, of to of of t it t It is to 2. to . of to as gG by RP gG so h 7 . of RP gG mL 7 00 h 7 , of 57 . in of RP gG mL 7 00 7 , be to in In we to of We of 錄 第一章 緒論 . 1 國(guó)設(shè)施辣椒根腐病發(fā)生狀況 . 1 椒根腐病的調(diào)查采樣 . 1 施辣椒根腐病發(fā)病癥狀 . 1 物病原真菌檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展 . 2 統(tǒng)植物病原真菌檢測(cè)技術(shù) . 2 疫學(xué)檢測(cè)技術(shù) . 3 子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù) . 5 研究的目的和意義 . 7 研究的試驗(yàn)設(shè)計(jì)路線 . 8 第二章 辣椒根腐病病原的鑒定 . 9 驗(yàn)材料 . 9 驗(yàn)所用材料及設(shè)備 . 9 驗(yàn)所用培養(yǎng)基 . 9 驗(yàn)所用植物材料 . 10 驗(yàn)方法 . 10 原菌的分離和純化 . 10 原菌的致病性測(cè)定 . 10 原菌 的培養(yǎng)特征 . 10 原菌的形態(tài)特征 . 11 原菌對(duì)孔雀石綠的敏感性 . 11 原菌對(duì)淀粉的利用 能力 . 11 果與分析 . 11 原菌分離情況 . 11 原菌的致病性測(cè)定結(jié)果 . 11 原菌的培養(yǎng)特征結(jié)果 . 12 原菌的形態(tài)特征觀測(cè)結(jié)果 . 12 孔雀石綠的敏感性測(cè)定結(jié)果 . 13 淀粉的利用能力測(cè)定結(jié)果 . 14 原菌的鑒定 . 14 章小結(jié) . 14 第三章 辣椒根腐病病原多克隆抗體的制備 .驗(yàn)材料 . 17 驗(yàn)所用材料和儀器 . 17 試驗(yàn)主要試劑的配制 . 17 驗(yàn)方法 . 18 株培養(yǎng)及菌體可溶性蛋白提取 . 18 驗(yàn)動(dòng)物的選擇及抗血清制備 . 19 血清的效價(jià)測(cè)定 . 19 析袋的處理及使用 . 20 體的粗提 . 20 提抗體 純化與濃度測(cè)定 . 20 泳法檢測(cè)抗體的純度 . 21 果與分析 . 21 體可溶性蛋白的濃度測(cè)定結(jié)果 . 21 血清的效價(jià)測(cè)定結(jié)果 . 21 化后抗體的濃度測(cè)定結(jié)果 . 23 體純度的檢測(cè)結(jié)果 . 23 章小結(jié) . 24 第四章 辣椒根腐病病原間接 測(cè)方法的建立 .驗(yàn)材料 . 25 驗(yàn)所用試劑及溶液 . 25 驗(yàn)所用菌株 . 25 驗(yàn)方法 . 26 接 本操作程序 . 26 接 佳工作條件的確定 . 26 接 的穩(wěn)定性檢測(cè) . 28 接 的特異性檢測(cè) . 28 接 對(duì)純培養(yǎng)菌體蛋白靈敏度的檢測(cè) . 28 接 田間檢測(cè)效果的評(píng)價(jià) . 28 果與分析 . 28 接 最佳工作條件的確 定結(jié)果 . 28 接 的穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果 . 32 接 的特異性檢測(cè)結(jié)果 . 33 接 對(duì)純培養(yǎng)菌體蛋白的靈敏度檢測(cè)結(jié)果 . 34 接 田間檢測(cè)效果的評(píng)價(jià)結(jié)果 . 34 章小結(jié) . 35 第五章 辣椒根腐病病原 測(cè)方法的建立 .驗(yàn)材料 . 36 驗(yàn)所用材料 . 36 驗(yàn)所用溶液及其 配制 . 36 驗(yàn)方法 . 36 V 接 本操作程序 . 36 接 最佳工作條件的確定 . 37 接 的特異性檢測(cè) . 38 接 對(duì)純培養(yǎng)菌體蛋白的靈敏度檢測(cè) . 38 接 田間檢測(cè)效果的評(píng)價(jià) . 38 果與分析 . 38 接 佳工作條件的確定結(jié)果 . 38 接 的特異 性檢測(cè)結(jié)果 . 41 接 對(duì)純培養(yǎng)菌體蛋白的靈敏度檢測(cè)結(jié)果 . 41 接 的田間檢測(cè)效果評(píng)價(jià)結(jié)果 . 42 章小結(jié) . 42 第六章 結(jié)論與討論 .論 . 44 論 . 44 于辣椒根腐病的病原 . 44 于免疫原 . 45 于抗體的特異性 . 45 于 顯色系統(tǒng) . 45 于兩種檢測(cè)方法的比較 . 46 后記 .考文獻(xiàn) .謝 .者簡(jiǎn)歷 .文縮略表 英文縮寫(xiě) 英文全稱 中文名稱 聯(lián)免疫吸附測(cè)定 制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 增片段長(zhǎng)度多態(tài)性 血清白蛋白 氨基聯(lián)苯 胺 h 時(shí) 根過(guò)氧化物酶 免疫球蛋白 G kg 克 mg 克 mL 升 甲基聯(lián)苯胺 密度 丙烯酰胺凝膠電泳 酸鹽緩沖液 分鐘轉(zhuǎn)數(shù) 準(zhǔn)差 g 克 酸鹽緩沖液 s 氏完全佐劑 s 氏不完全佐劑 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒論 甜椒 (.)系茄科辣椒屬，一 年或多年生草本植物。其營(yíng)養(yǎng)豐富，含有人體所需的多種維生素、糖類、類胡蘿卜素、有機(jī)酸，是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值、深受我國(guó)各地人民喜愛(ài)的調(diào)味品和蔬菜（孫曉勇， 1999），目前辣椒已經(jīng)成為我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)重要產(chǎn)業(yè)，具有重要的意義。 近年來(lái)，我國(guó) 設(shè)施辣椒、甜椒種植面積 逐年擴(kuò)大， 因棚室辣椒栽培在人工設(shè)施條件下進(jìn)行，具有高溫、高濕、弱光、小氣候比較穩(wěn)定的特點(diǎn)，有利于病原微生物的滋生、傳播和 蔓 延，棚室辣椒病害種類、數(shù)量也隨生 產(chǎn) 的發(fā)展而增多，危害逐年加重，尤其辣椒根部病害發(fā)病部位隱蔽、病 程長(zhǎng)、癥狀不明顯，不易及時(shí)發(fā) 現(xiàn)，病害容易大面積發(fā)生，迫使菜農(nóng)用藥次數(shù)增加，藥量加大，造成蔬菜的農(nóng)藥污染加重，給 環(huán)境和 人民健康帶來(lái)威脅。 國(guó)設(shè)施辣椒根腐病發(fā)生狀況 椒根腐病的調(diào)查采樣 目前，辣椒根腐病已在我國(guó)北京、天津、山東、 河北、遼寧、 山西、河南、福建、青海、江西、浙江等省市爆發(fā)流行，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，危害程度有逐年加重的趨勢(shì)。 2004 2006 年期間，對(duì)北京 陽(yáng)坊 、山東壽光、遼寧瓦房店等蔬菜生產(chǎn)基地辣椒生產(chǎn)情況進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)辣椒根腐病發(fā)生嚴(yán)重，很多保護(hù)地辣椒發(fā)病率高達(dá) 50%，甚至全棚絕收。山東省壽光市是我國(guó)重 要的蔬菜產(chǎn)區(qū)，辣椒是主要種植作物之一，而且辣椒品種多為國(guó)外特色品種。 2004年 10 月調(diào)查發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)剞r(nóng)民仍使用傳統(tǒng)的防治 鐮刀菌引起的根腐病 藥劑進(jìn)行防治，而且多為發(fā)病后才進(jìn)行防治，效果不佳；山東省 壽光 市是 我國(guó) 蔬菜的 重要 產(chǎn)區(qū)，由于管理比較粗放，造成辣椒根腐病發(fā)生嚴(yán)重。北京市南口通訊部隊(duì)蔬菜生產(chǎn)基地管理正規(guī)，但連年種植，土壤中病原菌積累，辣椒根腐病發(fā)生嚴(yán)重。 作者調(diào)查了上述蔬菜生產(chǎn)基地辣椒根腐病的 發(fā) 生 情況及癥狀， 選取具有代表性的田塊進(jìn)行調(diào)查 ，共 采集 辣椒根腐病樣 145 株 。 施辣椒根腐病 發(fā)病 癥狀 設(shè)施 辣椒根 腐病在辣椒幼苗至成株期均可發(fā) 生 。初期癥狀一般表現(xiàn)為地上部一株幾個(gè)枝發(fā)生萎蔫，早晚可恢復(fù)，嚴(yán)重時(shí)早晚不能恢復(fù)（圖 1發(fā)病早的植株有矮化現(xiàn)象；根部腐爛，須根少且易斷，主根、側(cè)根及須根的表皮易剝離 （圖 1，木質(zhì)部變?yōu)榈稚▓D 1嚴(yán)重時(shí)會(huì)在莖基部造成腐爛，形成水漬狀或環(huán)繞莖基部的病斑，表皮組織疏松易剝離，木質(zhì)部變色。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 圖 1椒根腐病田間危害癥狀 of in 1椒根部危害癥狀 of 1椒根部危害癥狀 of 物病原真菌檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展 統(tǒng)植物病原真菌檢測(cè)技術(shù) 傳統(tǒng)的植物病原真菌的診斷方法往往根據(jù)病組織的癥狀、病原菌的特征以及研究人員的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行。但某些病原引起的癥狀相似，例如胡蘿卜的細(xì)菌性枯萎病與交鏈孢黑斑病、不同病原物復(fù)合侵染造成的癥狀等等難以從 癥狀 上加以區(qū)別；有些病原菌 不能進(jìn)行純培養(yǎng)。因此傳統(tǒng)檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)人員有較高的要求，而且檢測(cè)的準(zhǔn)確性較差，不能適應(yīng)現(xiàn)代植物病害快速、準(zhǔn)確診斷的要中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 3 求。 疫學(xué)檢測(cè)技術(shù) 植物免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)是伴隨著醫(yī)學(xué)免疫學(xué)及動(dòng)物醫(yī)學(xué)免疫學(xué)的不斷發(fā)展而發(fā)展起來(lái)的，它是以抗原與抗體的特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)而發(fā)展起來(lái)的一種技術(shù)。應(yīng)用血清學(xué)技術(shù)檢測(cè)植物病原菌的歷史可以追溯到 1918 年，發(fā)展至今，已經(jīng)發(fā)展成為一門(mén)成熟的技術(shù)。目前免疫學(xué)技術(shù)己廣泛應(yīng)用到植物病毒的檢測(cè)中，在植物病原真菌的檢測(cè)中還不普遍，但最近十幾年來(lái)免疫學(xué)技術(shù)在病原真菌的檢測(cè)方面發(fā)展較快，顯示 了常規(guī)方法所不具有的優(yōu)點(diǎn)： (1)簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈敏； (2)可檢測(cè)未顯示癥狀時(shí)的病原； (3)可檢測(cè)癥狀不典型或與其它病原物復(fù)合侵染時(shí)的情況； (4)可定量檢測(cè)病原物； (5)可同時(shí)檢測(cè)大量樣品； (6)可制成試劑盒。因此，在田間進(jìn)行檢測(cè)診斷時(shí)，勿需對(duì)病原真菌進(jìn)行分離即可進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)。 于抗原 植物病原菌中用作抗原的物質(zhì)包括完全細(xì)胞、菌絲體或孢子、破碎的細(xì)胞、細(xì)胞的液體培養(yǎng)過(guò)濾液或固體培養(yǎng)物浸提液、以及純化的蛋白質(zhì)與酶 （ 1996） 、毒素 （ 1989； 999； 2001） 與多糖等 （李亞寧， 2003） 。真菌抗原存在特異性，但特異性是相對(duì)的，特異性是相對(duì)于分類單位而言的。比如某一抗原成份對(duì)屬來(lái)說(shuō)是特異的，但它對(duì)這個(gè)屬中的各個(gè)種而言則可能是公共抗原，它不能將這個(gè)屬中的各個(gè)種有效地區(qū)別開(kāi)來(lái)；同樣，一抗原成份對(duì)某一個(gè)種的真菌而言是特異的，但對(duì)這個(gè)種中不同型生理小種或菌株來(lái)說(shuō)則又可能是公共抗原成份。同時(shí)特異性抗原成份和共性抗原成份總是同時(shí)存在的，如某種微生物它具有種特異性抗原成份，同時(shí)也可能還具有這種微生物所在屬的屬特異性抗原成份，因而要獲得特異性抗 原成份，必須根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求采用適當(dāng)?shù)姆蛛x手段將它分離提取出來(lái)。影響真菌抗原特異性的因素很多，包括真菌的種類、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基組成、菌齡、抗原提取所采用的方法以及免疫動(dòng)物的選擇、抗體的分離方法和所采用的抗原抗體的分析方法等等。 于抗體 植物病原真菌抗體的產(chǎn)生同其 它 抗體產(chǎn)生一樣，常以家兔、小白鼠作為免疫動(dòng)物，也可以用蛋雞等作為免疫物，從而獲得多克隆或單克隆抗體。到目前為止已有密環(huán)菌屬 （ 、刺盤(pán) 孢 屬 （ 、鐮刀菌 （ 、腐霉屬 （ 、核盤(pán)菌屬 （ 等屬的植物病原真菌的抗原被制備為單克隆抗體。然而由于生產(chǎn)單克隆抗體的技術(shù)要求較高，生產(chǎn)成本也比多克隆抗體高出許多，因而日前大多數(shù)研究者仍用多克隆抗體進(jìn)行研究。 對(duì)抗體的分離、提純是必要的，特別是對(duì)于多克隆抗體，因?yàn)榻^對(duì)專一的抗體是不存在的。任何抗體都或多或少會(huì)和異質(zhì)的同種抗原發(fā)生交叉反應(yīng)。為了盡可能地減少交叉反應(yīng)，可以采取交叉吸附與免疫親和層析或印漬等方式進(jìn)行分離純化、濃縮特異性抗體。通過(guò)這些方法提純濃縮后的抗體，其特異性大 大加強(qiáng)，但由于除去了抗共性抗原的抗體而使靈敏度有所下降，因此只有通過(guò)提高抗體的使用濃度來(lái)彌補(bǔ)靈敏度的損失。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 4 聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)中最常見(jiàn)的是 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ 1971 年 表了酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ 于 量測(cè)定的文章 （ 徐宜為 ， 1991） ，使得 1966 年開(kāi)始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測(cè)定方法 （ 1987） 。 先是用于病毒的檢測(cè)，由于其具有快速、靈敏、特異、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)而受到世界各國(guó)科學(xué)家的重視。從 80年代開(kāi)始， 術(shù)開(kāi)始用于植物病原細(xì)菌及真菌的檢測(cè)。 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法的基本原理是：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí) ，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其它物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來(lái)定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故極大地放大了反應(yīng)效果，從而使