DNA的測(cè)序方法、原理及其應(yīng)用ppt課件

DNA的測(cè)序方法、原理及其應(yīng)用,1,一、DNA序列測(cè)定概述及其發(fā)展,即核酸DNA分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定，是現(xiàn)代分子生物學(xué)一項(xiàng)重要的技術(shù)。其基本原理是DNA的復(fù)制反應(yīng)體系中需要存在DNA聚合酶、DNA模板、寡核苷酸引物和dNTP，引物和模板退火形成雙鏈后，DNA聚合酶在引物的引導(dǎo)下在模板鏈上沿35的方向移動(dòng)，dNTP按照堿基配對(duì)原則，逐個(gè)連接在引物的3-OH末端。,2,1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰島素51個(gè)氨基酸的序列測(cè)定，這在當(dāng)時(shí)來說是一件了不起的大事。70年代后期，Sanger和Maxam-Gilbert等人又建立了核酸序列測(cè)定的方法，Sanger雙脫氧末端終止法和Maxam-Gilbert化學(xué)裂解法將核酸序列測(cè)定技術(shù)推進(jìn)到“直讀”階段，使核酸序列測(cè)定變得遠(yuǎn)比蛋白質(zhì)氨基酸序列測(cè)定容易，這樣人們可以通過核酸序列和遺傳密碼推導(dǎo)出蛋白質(zhì)氨基酸的序列。,3,二、測(cè)序的常用方法,DNA序列測(cè)定常用方法有如下3種：,4,1）雙脫氧鏈終止法測(cè)序(thechainterminationmethod)基本原理：通過合成與單鏈DNA互補(bǔ)的多核苷酸鏈，由于合成的互補(bǔ)鏈可在不同位置隨機(jī)終止反應(yīng)，產(chǎn)生只差一個(gè)核苷酸的DNA分子，從而來讀取待測(cè)DNA分子的順序。,5,用于終止反應(yīng)的雙脫氧核苷酸：將2，3雙脫氧核苷酸（ddNTP）參入到新合成的DNA鏈中，由于參入的ddNTP缺乏3羥基，因此不能與下一位核苷酸反應(yīng)形成磷酸二酯鍵，DNA合成反應(yīng)將中止。,6,脫氧核苷酸的連接,7,X,8,9,2）Maxam-Gilbert化學(xué)降解法測(cè)序基本原理：用放射性核素標(biāo)記待測(cè)DNA一側(cè)末端將標(biāo)記DNA分為G、A+G、C+T、C4個(gè)反應(yīng)體系用不同的化學(xué)試劑處理不同反應(yīng)體系，隨機(jī)斷裂DNA片段某種堿基中的任何一個(gè)，產(chǎn)生一組一端為放射線標(biāo)記的末端，另一端為不同大小的DNA片段的混合物電泳分離，放射自顯影得到互相錯(cuò)落的梯形圖譜，即可讀出DNA序列,10,11,表-特異斷裂4種脫氧核苷酸的方法,12,在4種反應(yīng)體系中，化學(xué)試劑特異地?cái)嗔袲NA的機(jī)制是：G反應(yīng)-硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后斷開了C8-C9間的化學(xué)鍵，哌啶置換了被修飾鳥嘌呤與核糖的結(jié)合。G+A反應(yīng)-（哌啶）甲酸使嘌呤環(huán)上氮原子質(zhì)子化，削弱了嘌呤脫氧核糖核苷酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，然后哌啶置換了嘌呤。T+C反應(yīng)-肼斷開了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生堿基片段被哌啶置換。C反應(yīng)-在NaCl存在時(shí)，只有C才能與肼發(fā)生反應(yīng)，隨后，被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。,13,堿基特異性修飾及裂解,14,15,3）DNA自動(dòng)化測(cè)序,特點(diǎn)原理同末端終止法標(biāo)記物為熒光染料激光掃描自動(dòng)測(cè)序結(jié)果清晰、準(zhǔn)確、分辨率高測(cè)序速度快200bp/h,16,17,18,19,20,21,三、3種方法的比較,化學(xué)法沒有末端終止法應(yīng)用廣泛，但有一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)，即所測(cè)序列來自原DNA分子而不是酶促合成反應(yīng)所產(chǎn)生的拷貝，因此利用化學(xué)法可以對(duì)合成的寡核苷酸進(jìn)行測(cè)序，可以分析諸如甲基化等DNA修飾的情況，不能通過化學(xué)保護(hù)及修飾干擾實(shí)驗(yàn)來研究DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)與DNA的相互作用。,22,Maxam-Gilbert法只需簡(jiǎn)單化學(xué)試劑。所測(cè)序列來自原DNA分子而不是酶促合成反應(yīng)所產(chǎn)生的拷貝，因此利用化學(xué)法可以對(duì)合成的寡核苷酸進(jìn)行測(cè)序，可以分析諸如甲基化等DNA修飾的情況。但所能測(cè)定的長(zhǎng)度要比Sanger法短一些，它對(duì)放射性標(biāo)記末端250個(gè)核苷酸以內(nèi)的DNA序列效果最佳。Sanger法雖需要單鏈模板和特異寡核苷酸，并需獲得大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段的高質(zhì)量酶制劑，而隨著M13噬菌體和噬菌粒載體的發(fā)展，也由于現(xiàn)成的合成引物容易獲得及測(cè)序反應(yīng)日期完善，雙脫氧鏈終止法如今遠(yuǎn)比Maxam-Gilbert法應(yīng)用得廣泛。由于Sanger法既簡(jiǎn)便又快速，目前大多數(shù)測(cè)序策略都是為Sanger法而設(shè)計(jì)的。,23,DNA自動(dòng)測(cè)序與手工測(cè)序的不同點(diǎn),1）標(biāo)記物不同：手工測(cè)序采用放射性核素標(biāo)記，而自動(dòng)測(cè)序采用4種熒光染料分別標(biāo)記ddNTP或標(biāo)記引物2)加樣方式不同：手工測(cè)序，一個(gè)樣品的4個(gè)測(cè)序反應(yīng)物分別在不同泳道進(jìn)行，而自動(dòng)測(cè)序可在一個(gè)泳道內(nèi)電泳3)檢測(cè)手段不同：手工測(cè)序采用放射自顯影，從4種寡聚核苷酸的梯子形圖譜中讀出DNA序列，而自動(dòng)測(cè)序則采用激光掃描器同步掃描，計(jì)算機(jī)進(jìn)行閱讀和編輯,24,四、DNA序列測(cè)定的應(yīng)用,1)測(cè)序PCR克隆測(cè)序驗(yàn)證突變體檢測(cè)新基因測(cè)序全基因組測(cè)序系統(tǒng)發(fā)育及物種鑒定2)片段分離個(gè)體識(shí)別：親緣鑒定SNP關(guān)聯(lián)分析疾病診斷等,25,26,一、在線分析的核心網(wǎng)站http:/bip.weizmann.ac.il/tools/#primaryhttp:/www.ebi.ac.uk/embl/http:/www.ddbj.nig.ac.jp/二、本地分析的重要軟件VectorNTISuite6.0及以上的版本：綜合分析、載體分析。DNAStar：綜合分析PrimerPremier5.0：引物設(shè)計(jì)Oligo7：寡核苷酸分析，引物計(jì)算GCG：蛋白質(zhì)、核酸序列,2、核苷酸序列的生物信息分析,26,西南大學(xué)生