天然藥物化學成分提取分離方法PPT課件

-,1,天然藥物化學成分提取分離方法,-,2,化學成分提取分離方法,天然藥物化學研究常從有效成分或生理活性成分的提取、分離工作開始。在進行提取之前，應了解所用材料的基源（如動、植物的學名）、產(chǎn)地、藥用部位、采集時間與方法等。目的物為已知成分或已知化學結構類型，如從甘草中提取甘草酸、麻黃中提取麻黃堿，或從植物中提取某類成分如總生物堿或總酸性成分時，工作比較簡單。一般宜先查閱有關資料，搜集比較該種或該類成分的各種提取方案，尤其是工業(yè)生產(chǎn)方法，在根據(jù)具體條件加以選用。從中草藥或天然藥物中尋找未知有效成分或有效部位時，情況就比較復雜。只能根據(jù)預先確定的目標，在適當?shù)幕钚詼y試體系指導下，進行提取、分離并以相應的動物模型篩選、臨床驗證、反復實踐，才能達到目的。,-,3,一、有效成分的提取,溶劑提取法水蒸氣蒸餾法升華法,-,4,溶劑提取法,溶劑提取法系選擇適當溶劑將中草藥中的化學成分從藥材中提取出來。天然藥物中的化學成分在溶劑中的溶解度直接與溶劑性質(zhì)有關。溶劑可分為水、親水性有機溶劑和親脂性有機溶劑。一些常見溶劑的脂性的強弱順序如下：石油醚苯氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇水天然藥物化學成分可通過結構估計它們的極性。,-,5,溶劑提取法,甙類的分子中結合有糖分子，羥基數(shù)目多，能表現(xiàn)強親水性，而甙元則屬于親脂性化合物，而生物堿鹽，能夠離子化，加大了極性，就變成了親水性化合物。鞣質(zhì)是多羥基衍生物，列為親水性化合物。油脂、揮發(fā)油、蠟、脂溶性色素都是強親脂性成分。萜類、甾體等脂環(huán)類及芳香類化合物因為極性較小，易溶于氯仿、乙醚等親脂性溶劑中；糖苷、氨基酸等成分極性較大，易溶于水及含水醇中；酸性、堿性及兩性化合物，因為存在狀態(tài)（分子或離子形式）隨溶液而異，故溶解度將隨pH而改變。,-,6,溶劑提取法,只要中草藥成分的親水性和親脂性與溶劑的此項性質(zhì)相當，就會在其中有較大的溶解度，即所謂“相似相溶”的規(guī)律。這是選擇適當溶劑自中草藥中提取所需要成分的依據(jù)之一。,-,7,水蒸氣蒸餾法,水蒸氣蒸餾法只適用于具有揮發(fā)性、能隨水蒸氣蒸餾而不被破壞，與水不發(fā)生反應，且難溶或不溶于水的成分的提取。天然藥物中的揮發(fā)油、某些小分子生物堿如麻黃堿、煙堿、檳榔堿以及某些小分子的酚性物質(zhì)如牡丹酚等的提取可采用水蒸氣蒸餾法。,-,8,升華法,某些固體物質(zhì)如水楊酸、苯甲酸、樟腦等受熱在低于其熔點的溫度下，不經(jīng)過熔化就可直接轉化為蒸氣，蒸氣遇冷后又凝結成固體稱為升華。天然藥物中有一些成分具有升華性質(zhì)，能利用升華法直接中藥材中提取出來。但天然藥物成分一般可升華的很少。,-,9,二、有效成分的分離與精制,-,10,化學成分分離精制常用方法原理,根據(jù)物質(zhì)溶解度差別進行分離根據(jù)物質(zhì)在兩相溶劑中的分配比不同進行分離根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進行分離根據(jù)物質(zhì)分子大小差異進行分離,-,11,根據(jù)物質(zhì)溶解度差別進行分離,1、利用溫度不同引起溶解度的改變2、改變混合溶劑的極性3、調(diào)節(jié)溶液的pH值，改變分子的存在狀態(tài)4、沉淀法5、鹽析法,-,12,1、利用溫度不同引起溶解度的改變,鑒定中草藥化學成分，研究其化學結構，必須首先將中草藥成分制備成單體純品。中草藥化學成分在常溫下多半是固體的物質(zhì)，常具有結晶性的通性，可以根據(jù)溶解度的不同用結晶法來達到分離精制的目的。中草藥化學成分，一旦獲得結晶，就能有效地進一步精制成為單體純品。純化合物的結晶有一定的熔點和結晶學的特征，有利于鑒定。因此，求得結晶并制備成單體純品，就成為鑒定中草藥成分、研究其分子結構重要的一步。,-,13,1、利用溫度不同引起溶解度的改變,結晶法是選用合適的溶劑，將混合物加熱溶解，形成有效成分的飽和溶液，趁熱過濾除去不溶的雜質(zhì)，濾液低溫放置或蒸去部分溶劑后再低溫放置，使有效成分大部分析出結晶，由于初析出的結晶總會帶一些雜質(zhì)，因此需要通過反復結晶即所謂重結晶的方法，才能得到高純度的晶體。,-,14,雜質(zhì)的除去,結晶法所用的樣品必須是已經(jīng)用其它方法提得比較純的時候才能采用此法精制。結晶乃同類分子自相排列，如果雜質(zhì)過多，則阻礙分子的排列。如果粗提取部分的純度很差則很難得到結晶。,-,15,雜質(zhì)的除去,用溶劑溶出雜質(zhì)，或只溶出所需要的成分。用少量活性炭等進行脫色處理，以除去有色雜質(zhì)。通過氧化鋁、硅膠柱色譜處理（注意所需要的成分也可能被吸附而損失）。制備其晶態(tài)的衍生物（如游離生物堿可制備各種生物堿鹽類，羥基化合物可轉變成乙酰化物，碳基化合物可制備成苯腙衍生物結晶）。,-,16,溶劑的選擇,適宜的溶劑是在冷時對所需要的成分溶解度較小，而熱時溶解度較大。溶劑的沸點亦不宜太高。一般常用甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙酯等。有些化合物在一般溶劑中不易形成結晶，而在某些溶劑中則易于形成結晶。例如葛根素、逆沒食子酸（ellagicacid）在冰醋酸中易形成結晶，大黃素）在吡啶中易于結晶，萱草毒素在DMF中易得到結晶，而穿心蓮亞硫酸氫鈉加成物在丙酮一水中較易得到結晶。又如蝙蝠葛堿通常為無定形粉未，但能和氯仿或乙醚形成為加成物結晶。,-,17,結晶溶液的制備,制備結晶的溶液為過飽和的溶液。一般是應用適量的溶劑在加溫的情況下，將化合物溶解再放置冷處。如果在室溫中可以析出結晶，就不一定放置于冰箱中，以免伴隨結晶析出更多的雜質(zhì)。無定形的粉未狀物質(zhì)，遠較晶體物質(zhì)的溶解度大，易于形成過飽和溶液。一般經(jīng)過精制的化合物，在蒸去溶劑抽松為無定形粉未，加入少量溶劑，往往立即可以溶解，稍稍放置即能析出結晶。例如長春花總弱堿部分抽松后加入1.5倍量的甲醇溶解，放置后很快析出長春堿結晶。又如蝙蝠葛堿在乙醚中很難溶解，但當其鹽的水溶液用氨液堿化，并立即用乙醚萃取，所得的乙醚溶液，放置后即可析出蝙蝠葛堿的乙醚加成物結晶。,-,18,結晶溶液的制備,制備結晶溶液，除用單一溶劑外，也常采用混合溶劑。一般是先將化合物溶于易溶的溶劑中，再在室溫下滴加適量的難溶的溶劑，直至溶液微呈渾濁，并將此溶液微微加溫，使溶液完全澄清后放置。一細辛醚重結晶時，可先溶于乙醇，再滴加適量水，即可析出很好的結晶。虎杖中提取水溶性的虎杖甙時，在已精制飽和的水溶液上添加一層乙醚放置，既有利于溶出其共存的脂溶性雜質(zhì)，又可降低水的極性，促使虎杖甙的結晶化。,-,19,(4)結晶純度的判定,結晶的純度可由化合物的晶形、色澤、熔點和熔距、薄層色譜或紙色譜等作初步鑒定。一個單體純化合物一般都有一定的熔點和較小的熔距，同時在薄層色譜或紙色譜中經(jīng)數(shù)種不同展開劑系統(tǒng)檢定，也為一個斑點者，一般可以認為是一個單體化合物。,-,20,結晶純度的判定,注意，有的化合物在一般層析條件下，雖然只呈現(xiàn)一個斑點，但并不一定是單體成分。例如鹿含草中主成分為高熊果甙、異高熊果甙極難用一般方法分離，經(jīng)反復結晶后，在紙層及聚酞胺薄層上都只有一個斑點，易誤認為單一成分，但測其熔點在115125，熔距很長。經(jīng)制備其甲醚后，再經(jīng)紙層層析檢定，可以出現(xiàn)兩個斑點，異高熊果甙的比移值大于高熊果甙。HPLC是近年來可以用作判斷有效成分純度的一種重要手段。此外，GC、UV光譜等，均有助于檢識結晶樣品的純度。,-,21,單晶的結構測定,單晶X射線衍射單晶X射線分析是提供晶態(tài)下分子三維結構，確定分子的立體結構（構型、構象等）的最有效方法。,-,22,2、改變混合溶劑的極性,在溶液中加入另一種溶劑以改變混合溶劑的極性，使一部分物質(zhì)沉淀析出，從而實現(xiàn)分離。在藥材濃縮水提取液中加入數(shù)倍量高濃度乙醇，以沉淀除去多糖、蛋白質(zhì)等水溶性雜質(zhì)（水/醇法）；在濃縮乙醇提取液中加入數(shù)倍兩量水稀釋，放置以沉淀除去樹脂、葉綠素等水不溶性雜質(zhì)（醇/水法）；在乙醇濃縮液中加數(shù)倍兩乙醚（醇/醚法）或丙酮（醇/丙酮法），可使皂苷沉淀析出，而脂溶性的樹脂等類雜質(zhì)則留在母液中。,-,23,3、加酸堿調(diào)節(jié)溶液的pH值,對酸性、堿性或兩性有機化合物來說，常可通過加入酸、堿以調(diào)節(jié)溶液的pH值，改變分子的存在狀態(tài)（游離型或解離型），從而改變?nèi)芙舛榷鴮崿F(xiàn)分離。內(nèi)酯類化合物不溶于水，但遇堿開環(huán)生成羧酸鹽溶于水，再加酸酸化，又重新形成內(nèi)酯環(huán)從溶液中析出，從而與其它雜質(zhì)分離（堿/酸法）；生物堿一般不溶于水，遇酸生成生物堿鹽而溶于水，再加堿堿化，又重新生成游離生物堿（酸/堿法）。這些化合物可以利用與水不相混溶的有機溶劑進行萃取分離?？梢苑譃閺娝嵝?、弱酸性和酚性三種，它們分別溶于碳酸氫鈉、碳酸鈉和氫氧化鈉，借此可進行分離。,-,24,4、沉淀法,在中草藥提取液中加入某些試劑使產(chǎn)生沉淀，以獲得有效成分或除去雜質(zhì)的方法。鉛鹽沉淀法試劑沉淀法,-,25,鉛鹽沉淀法,鉛鹽沉淀法為分離某些中草藥成分的經(jīng)典方法之一。醋酸鉛及堿式醋酸鉛，能與多種化學成分生成難溶的鉛鹽或絡鹽沉淀，故可利用這種性質(zhì)使有效成分與雜質(zhì)分離。中性醋酸鉛可與酸性物質(zhì)或某些酚性物質(zhì)結合成不溶性鉛鹽。因此，常用以沉淀有機酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)、鞣質(zhì)、樹脂、酸性皂甙、部分黃酮等。與堿式醋酸鉛產(chǎn)生不溶性鉛鹽或絡合物的范圍更廣。,-,26,試劑沉淀法,在生物堿鹽的溶液中，加入某些生物堿沉淀試劑（見生物堿性質(zhì)下），則生物堿生成不溶性復鹽而析出。水溶性生物堿難以用萃取法提取分出，常加入雷氏銨鹽使生成生物堿雷氏鹽沉淀析出用明膠、蛋白溶液沉淀鞣質(zhì)；膽甾醇也常用以沉淀洋地黃皂甙等。,-,27,5、鹽析法,鹽析法是在中草藥的水提液中、加入無機鹽至一定濃度，或達到飽和狀態(tài)，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出，而與水溶性大的雜質(zhì)分離。鹽析用的無機鹽有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。三七的水提取液中加硫酸鎂至飽和狀態(tài)，三七皂甙乙即可沉淀析出，自黃藤中提取掌葉防己堿，自三顆針中提取小檗堿在生產(chǎn)上都是用氯化鈉或硫酸銨鹽析制備。有些成分如原白頭翁素、麻黃堿、苦參堿等水溶性較大，在提取時，亦往往先在水提取液中加入一定量的食鹽，再用有機溶劑萃取。,-,28,根據(jù)物質(zhì)在兩相溶劑中的分配比不同進行分離,分配系數(shù)（K）兩種相互不能任意混溶的溶劑（如氯仿與水）如置分液漏斗中充分振搖，放置后即可分成兩相。此時如果其中含有溶質(zhì)，則溶質(zhì)在兩相溶劑中的分配比（K）在一定溫度及壓力下為一常數(shù)，可以下式表示：K=CU/CLK：分配系數(shù)；CU：溶質(zhì)在上相溶劑中的濃度；CL：溶質(zhì)在下相溶劑中的濃度。,-,29,根據(jù)物質(zhì)在兩相溶劑中的分配比不同進行分離,1、液-液萃取法2、逆流連續(xù)萃取法3、逆流分配法（CounterCurrentDistribution，CCD）4、液滴逆流色譜法（DCCC）5、高速逆流色譜法（HSCCC）6、氣液分配色譜（GC或GLC）7、液-液分配色譜（LC或LLC）,-,30,1、液-液萃取法,利用混合物中各成分在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而達到分離的方法。萃取時如果各成分的分配系數(shù)相差越大，分離效率越高。水提取液中的有效成分是親脂性的物質(zhì)，一般多用親脂性有機溶劑，如苯、氯仿或乙醚進行兩相萃?。挥行С煞质瞧谟H水性的物質(zhì)，需用弱親脂性的溶劑，例如乙酸乙酯、丁醇等。提取黃酮類成分多用乙酸乙脂和水的兩相萃取。提取親水性強的皂甙則多選用正丁醇、異戊醇和水作兩相萃取。,-,31,液-液萃取法操作注意事項,先用小試管猛烈振搖約1分鐘，觀察萃取后二液層分層現(xiàn)象。如果容易產(chǎn)生乳化，大量提取時要避免猛烈振搖，可延長萃取時間。如碰到乳化現(xiàn)象，可將乳化層分出，再用新溶劑萃??；或將乳化層抽濾，或將乳化層稍稍加熱；或較長時間放置并不時旋轉，令其自然分層。乳化現(xiàn)象較嚴重時，可以采用二相溶劑逆流連續(xù)萃取裝置。水提取液的濃度最好在比重1.11.2之間，過稀則溶劑用量太大，影響操作。,-,32,2、高速逆流色譜(High-speedCountercurrentChromatography，HSCCC),大多數(shù)色譜法都需要有固相載體某種形式的選擇性吸附作用。在應用固相載體色譜分離中，往往會存在不同程度的不可逆吸附，造成被分離樣品的損失，尤其在分離微量樣品時受到限制。高速逆流色譜，是近十年迅速發(fā)展起來的新型液液分配色譜技術。與其它液相色譜分離方法相比它不使用固相載體作固定相，被分離物質(zhì)在互不相溶兩相分配分離，克服了固相載體帶來的樣品吸附、損失、污染、峰形拖尾等缺點。且花費溶劑少，分辨率高，可進行純品制備。利用HSCCC，中草藥粗提物的分離純化制備可同步完成，被分離物可定量回收。,-,33,HSCCC的工作原理,兩種互不相溶的溶劑在聚四氟乙烯管內(nèi)作高速行星運轉，其中一相溶劑作固定相，用恒流泵輸送載有樣品的另一相溶劑穿過固定相，兩相溶劑在螺旋管中實現(xiàn)高效的接觸、混合、分配和傳遞。由于樣品中各組分在兩相中的分配能力不同，導致在聚四氟乙烯管中移動的速度也不同，從而使樣品中各組分得到分離。,-,34,HSCCC的特點,1、應用范圍廣，適應性好由于溶劑系統(tǒng)的組成與配比可以是無限多，因而HSCCC適用于任何極性范圍的品的分離，特別適用于分離極性大的組分以及一些生物大分子。2、操作簡便，容易掌握對樣品的預處理要求低，一般的粗提物即可進行HSCCC的制備分離或分析。,-,35,HSCCC的特點,3、回收率高固定相為液體，無需固體作載體，克服氣、液相色譜使用固相載體帶來的樣品吸附、損失、污染、峰形拖尾等缺點。4、重現(xiàn)性好分離過程穩(wěn)定、峰的保留相對標準偏差小于2，,-,36,HSCCC的特點,5、分離效率高，分離量較大與一般色譜的分離方式不同，能實現(xiàn)梯度操作和反相操作、亦能進行重復進樣，特別適用于制備性分離，產(chǎn)品純度高，制備量大，溶劑消耗少。較大的制備型HSCCC，柱容積可達530ml，一次最多進樣可達20g粗品；較小的分析型的HSCCC柱容積為8mL，進樣量為幾十微克，最大轉速可達4000rmin.因此，被廣泛地應用于植物化學成分的分離制備研究。,-,37,HSCCC的特點,根據(jù)以上特點，HSCCC適合于中藥成分的分離和分析。目前高速逆流色譜儀已成功地開發(fā)出分析型和制備型兩大系列。制備或半制備HSCCC的特點是高流速、高濃度，不但適用于非極性化合物的分離，也適用于極性化合物的分離。在制備分離方面，可用于中藥粗提物中各組分的分離，也可進一步精制，甚至直接從從粗提物步純化到純品，來制備中藥化學成分標準品。,-,38,HSCCC的應用,HSCCC的分離效率與氣相色譜和高效液相色譜等技術相比較，前者不適宜用它完成組成復雜的混合物的全譜分離分析。而其對于樣品的預處理條件較放松及回收率高，制備量大，特別適用于特定部位和特定組分的分離純化與制備。,-,39,HSCCC的應用,制備中藥化學對照品中草藥化學對照品應具有高度均勻性，量值準確性和良好穩(wěn)定性，其純度要求很高。制備型HPLC曾是國外常用的主要手段。但是其設備和載體填料價格很高對樣品前期處理要求嚴格，存在不可逆吸附，溶劑用量大的缺點。因此致力于HSCCC分離、統(tǒng)化、制備中草藥有效成分對照品的研究和產(chǎn)業(yè)化，具有現(xiàn)實意義。從銀杏葉中制備異鼠李素、山奈酚、槲皮索、白果內(nèi)酯和橙皮甙；從大黃制備大黃羥基蒽醌甙元；從洋地黃葉中制備洋地黃毒甙；從虎杖中分離提純白藜蘆醇和白藜蘆醇甙等。,-,40,3、高效液相色譜(HPLC),HPLC是在經(jīng)典液相色譜基礎上引入氣相色譜的塔板理論，并采用了高壓輸液泵、高效固定相和高靈敏度的檢測器，具有分析速度快、分離效率高和操作自動化特點的一種色譜技術。HPLC特別適合高沸點、大分子和熱穩(wěn)定性差的化合物的分離分析。中藥的成分非常復雜，以往常用的薄層色譜等方法因其精密度、準確度、靈敏度、重現(xiàn)性差而不能滿足中藥現(xiàn)代化發(fā)展的需要。高效液相色譜正是以其穩(wěn)定、可靠、高效的特點成為中藥研究的最重要的分析方法。常用于中藥質(zhì)量的控制、天然藥物化學成分的分離及分析測定等。,-,41,3、高效液相色譜(HPLC),檢測器是液相色譜的三大關鍵部件（高壓輸液泵、高效色譜柱和檢測器）之一。其發(fā)展在某種意義上決定著HPLC技術的進步。理想的檢測器應具有以下特點：靈敏度高；對溫度變化和流量波動不敏感；死體積小，不使峰額外地擴展；對溶劑無響應，能用于梯度洗脫操作線性范圍寬；對所有樣品都有響應；對樣品無破壞性。,-,42,3、高效液相色譜(HPLC),檢測器的種類繁多，至今還沒有一種檢測器可以同時滿足以上幾點要求。有紫外可見分光檢測器、熒光檢測器、示差折光檢測器、電化學檢測器、二極管陣列檢測器、測定大分子絕對分子量的多角度激光光散射儀。另外還有蒸發(fā)光檢測器、化學發(fā)光檢測器、手性檢測器(旋光檢測器、圓二色檢測器)、分子量檢測器、放射性檢測器、熱學性質(zhì)檢測器、光電導檢測器、磁旋光檢測器等。,-,43,常用的HPLC檢測器,紫外-可見分光檢測器示差折光檢測器二極管陣列檢測器蒸發(fā)光檢測器,-,44,紫外檢測器（UVD）,優(yōu)點UVD結構簡單，使用方便，售價便宜、高靈敏度和穩(wěn)定性。局限性UVD檢測的物質(zhì)必須具有吸收紫外光的生色團，而相應的流動相在檢測波長下則應當是無紫外吸收的。這一特性大大限制了其能檢測的物質(zhì)范圍和一些良好溶劑的使用。許多成分沒有紫外吸收或為紫外末端吸收，有時可用低波長紫外檢測器，但梯度洗脫時出現(xiàn)基線漂移，溶劑峰干擾，溶劑選擇受其截止波長限制。,-,45,示差折光檢測器(RID),RID是一種通用的檢測器，它基于色譜柱流出物光折射率的變化來連續(xù)測定樣品濃度。特點穩(wěn)定、易于操作，樣品不被破壞和具有較好的靈敏度。缺點對工作環(huán)境要求很苛刻，要求恒溫、恒流速，且無法采用梯度洗脫其檢測靈敏度也不夠高。,-,46,光電二極管陣列檢測器(DAD),原理光源經(jīng)光學反射鏡通過流動池，再經(jīng)分光系統(tǒng)、狹縫照射到一組光電二極管上，由數(shù)據(jù)收集系統(tǒng)實時記錄下組分的光譜吸收，得到三維的立體譜圖。用一組光電二極管同時檢測透過樣品的所有波長紫外光，而不是某一個或幾個波長，和普通的紫外可見分光檢測器不同的是進入流動池的光不再是單色光。它具有以下優(yōu)點：可得任意波長的色譜圖，極為方便；可得任意時間的光譜圖，相當于與紫外聯(lián)用；提供組分的定性信息。,-,47,蒸發(fā)光檢測器（ELSD）,ESLD是質(zhì)量型、高靈敏度的通用液相色譜檢測器。它檢測的三個主要過程：霧化色譜柱流出物經(jīng)過針頭式的細導管進入霧化器，與氣體混合噴成均勻一致的霧滴；蒸發(fā)霧滴經(jīng)過加熱的漂移管，流動相被蒸發(fā)，溶質(zhì)形成極細的顆粒；檢測溶質(zhì)顆粒氣體在檢測池發(fā)生散射作用，經(jīng)光電倍增管成電信號輸出。,-,48,ESLD的優(yōu)點,適用范圍廣原則上對所有的化合物都能測定，不論化合物是否存在生色團或電活性基團。適用于梯度洗脫流動相在樣品檢測前揮去；高靈敏度與示差檢測器(RI)及低波長紫外檢測相比。由于它的這些優(yōu)點，它有可能像氣相色譜中的氫火焰檢測器(FID)那樣成為液相色譜的高靈敏度通用檢測器。,-,49,ESLD的應用,沒有紫外吸收或為紫外末端弱吸收的樣品ELSD的響應與被測物的質(zhì)量成正比，而不依賴于被測物的光學特性及官能團。理論上可用于揮發(fā)性低于流動相的任何組分的檢測。在天然藥物化學成分中常見的有糖類、皂甙類（皂甙無紫外吸收或僅為末端吸收，使得皂甙測定在應用HPLC-UV法及選擇流動相優(yōu)化分離時均存在一定的困難。ELSD檢測則較好地解決了這個問題。從目前國內(nèi)文獻報道來看，ELSD的應用亦以分析這類成分及甾類等最多。流動相有紫外吸收干擾或梯度洗脫時基線漂移影響測定的情況用ELSD檢測，流動相在漂移管便氣化蒸發(fā)，不影響樣品檢測。,-,50,高效液相色譜的應用,中藥化學成分分析成分分離制備(1)特別適用于極性較大的成分(如皂苷類)分離；(2)先以分析色譜摸索分離條件；(3)樣品一定要用流動相溶解，再以濾膜過濾。,-,51,根據(jù)物質(zhì)的吸附性差別進行分離,在天然有機化合物分離及精制工作中，吸附現(xiàn)象利用得十分廣泛。其中又以固-液吸附用得最多，其分：物理吸附(表面吸附，physicaladsorption)：以硅膠、氧化鋁及活性炭為吸附劑化學吸附（chemicaladsorption）半化學吸附（semichemicaladsorption）：聚酰胺層析,-,52,1、物理吸附,液-固物理吸附色譜是運用較多的一種方法，特別適用于很多中等分子量的樣品（分子量小于1，000的低揮發(fā)性樣品）的分離，尤其是脂溶性成分。一般不適用于高分子量樣品如蛋白質(zhì)、多糖或離子型親水性化合物等的分離。吸附層析的分離效果，決定于吸附劑、溶劑和被分離化合物的性質(zhì)這三個因素。,-,53,吸附劑,硅膠氧化鋁活性炭,-,54,硅膠,層析用硅膠為一多孔性物質(zhì)，分子中具有硅氧烷的交鏈結構，同時在顆粒表面又有很多硅醇基。硅膠吸附作用的強弱與硅醇基的含量多少有關。硅醇基能夠通過氫鍵的形成而吸附水分，因此硅膠的吸附力隨吸著的水分增加而降低。硅膠是一種酸性吸附劑，適用于中性或酸性成分的層析。同時硅膠又是一種弱酸性陽離子交換劑，其表面上的硅醇基能釋放弱酸性的氫離子，當遇到較強的堿性化合物，則可因離子交換反應而吸附堿性化合物。,-,55,氧化鋁,氧化鋁帶有堿性，對于分離一些堿性中草藥成分，如生物堿類的分離頗為理想。但是氧化鋁不宜用于醛、酮、酸、內(nèi)酯等類型的化合物分離。因為堿性氧化鋁可與上述成分發(fā)生次級反應，如異構化、氧化、消除反應等。用稀硝酸或稀鹽酸處理氧化鋁，不僅可中和氧化鋁中含有的堿性雜質(zhì)，并可使氧化鋁顆粒表面帶有NO3-或Cl-的陰離子，從而具有離于交換劑的性質(zhì)，適合于酸性成分的層析，這種氧化鋁稱為酸性氧化鋁。,-,56,活性炭,是一種非極性吸附劑?；钚蕴恐饕糜诜蛛x水溶性成分，如氨基酸、糖類及某些甙。活性炭為吸附作用，在水溶液中最強，在有機溶劑中則較低弱。故水的洗脫能力最弱，而有機溶劑則較強。例如以醇-水進行洗脫時，則隨乙醇濃度的遞增而洗脫力增加?；钚蕴繉Ψ枷阕寤衔锏奈搅Υ笥谥咀寤衔铮瑢Υ蠓肿踊衔锏奈搅Υ笥谛》肿踊衔?。利用這些吸附性的差別，可將水溶性芳香族物質(zhì)與脂肪族物質(zhì)分開，單糖與多糖分開，氨基酸與多肽分開。,-,57,吸附劑的特點,硅膠和氧化鋁為極性吸附劑，有以下特點：對極性物質(zhì)具有較強的親和能力。故同為溶質(zhì)，極性強者將被優(yōu)先吸附。溶劑極性越弱，則吸附劑對溶質(zhì)將表現(xiàn)出越強的吸附能力。溶劑極性增強，則吸附劑對溶質(zhì)的吸附能力即隨之減弱。溶質(zhì)即使被硅膠、氧化鋁吸附，但一旦加入極性較強的溶劑時，又可被后者置換洗脫下來。,-,58,吸附劑的特點,活性炭因為是非極性吸附劑，故與硅膠、氧化鋁相反，對非極性物質(zhì)具有較強的親和能力，在水中對該類物質(zhì)表現(xiàn)出強的吸附能力。溶劑極性降低，則活性炭對該類物質(zhì)的吸附能力也隨之降低。故從活性炭上洗脫被吸附物質(zhì)時，洗脫溶劑的洗脫能力將隨溶劑極性的減弱而增強。,-,59,溶劑,洗脫劑的選擇，須根據(jù)被分離物質(zhì)與所選用的吸附劑性質(zhì)這兩者結合起來加以考慮。在用極性吸附劑進行層析時，當被分離物質(zhì)為弱極性物質(zhì)，一般選用弱極性溶劑為洗脫劑；被分離物質(zhì)為強極性成分，則須選用極性溶劑為洗脫劑。如果對某一極性物質(zhì)用吸附性較弱的吸附劑（如以硅藻土或滑石粉代替硅膠），則洗脫劑的極性亦須相應降低。,-,60,被分離物質(zhì)的性質(zhì),被分離的物質(zhì)與吸附劑，洗脫劑共同構成吸附層析中的三個要素，彼此緊密相連。在指定的吸附劑與洗脫劑的條件下，各個成分的分離情況，直接與被分離物質(zhì)的結構與性質(zhì)有關。對極性吸附劑而言，成分的極性大，吸附性強。,-,61,化合物的極性及其強弱判斷,官能團的極性強弱化合物的極性則由分子中所含官能團的種類、數(shù)目及排列方式等綜合因素所決定。,-,62,官能團的極性強弱,-,63,化合物的極性,化合物的極性則由分子中所含官能團的種類、數(shù)目及排列方式等綜合因素所決定。極性基團的數(shù)目愈多，化合物的極性越大，被吸附的性能就會更大些，在同系物中碳原子數(shù)目少些，被吸附也會強些。總之，只要兩個成分在結構上存在差別，就有可能分離，關鍵在于條件的選擇。,-,64,化合物的極性,被分離物質(zhì)極性很小為不含氧的萜烯，或雖含氧但非極性基團，則需選用吸附性較強的吸附劑，并用弱極性溶劑如石油醚或苯進行洗脫。但多數(shù)中藥成分的極性較大，則需要選擇吸附性能較弱的吸附劑（一般級）。采用的洗脫劑極性應由小到大梯度遞增，或可應用薄層層析以判斷被分離物在某種溶劑系統(tǒng)中的分離情況。此外，能否獲得滿意的分離，還與選擇的溶劑梯度有很大關系。多組分的混合物，象植物油脂系由烷烴、烯烴、甾醇酯類、甘油三酸醋和脂肪酸等組份。當以硅膠為吸附劑時，使油脂被吸附后選用一系列混合溶劑進行洗脫，油脂中各單一成分即可按其極性大小的不同依次被洗脫。,-,65,2、吸附簿層色譜,薄層層析是一種簡便、快速、微量的層析方法。一般將吸附劑撒布到平面如玻璃片上，形成一薄層進行層析時，即稱薄層層析。針對某些性質(zhì)特殊的化合物的分離與檢出，有時需采用一些特殊薄層。,-,66,特殊薄層,熒光薄層絡合薄層酸堿薄層和PH緩沖薄層,-,67,熒光薄層,有些化合物本身無色，在紫外燈下也不顯熒光，又無適當?shù)娘@色劑時，則可在吸附劑中加入熒光物質(zhì)制成熒光薄層進行層析。展層后置于紫外光下照射，薄層板本身顯熒光，而樣品斑點處不顯熒光，即可檢出樣品的層析位置。常用的熒光物質(zhì)多為無機物。其一是在254nm紫外光激發(fā)下顯出熒光的，如錳激化的硅酸鋅。另一種為在365nm紫外光激發(fā)下發(fā)出熒光的，如銀激化的硫化鋅、硫化鎬。,-,68,絡合薄層,常用的有硝酸銀薄層，用來分離碳原子數(shù)相等而其中C一C雙鍵數(shù)目不等的一系列化合物，如不飽和醇、酸等。其主要機理是由于C-C鍵能與硝酸銀形成絡合物，而飽和的C-C鍵則不與硝酸銀絡合。因此在硝酸銀薄層上，化合物可由于飽和程度不同而獲得分離。層析時飽和化合物由于吸附最弱而Rf最高，含一個雙鍵的較含兩個雙鍵的Rf值高，含一個三鍵的較含一個雙鍵的Rf值高。在一個雙鍵化合物中，順式的與硝酸銀絡合較反式的易于進行。因此，還可用來分離順反異構體。,-,69,酸堿薄層和pH緩沖薄層,為了改變吸附劑原來的酸堿性，可在鋪制薄層時采用稀酸或稀堿以代替水調(diào)制薄層。例如硅膠帶微酸性，有時對堿性物質(zhì)如生物堿的分離不好，如不能展層或拖尾，則可在鋪薄層時，用稀堿溶液0.105NNa0H溶液制成堿性硅膠薄層。例如豬屎豆堿在以硅膠為吸附劑時，以氯仿-丙酮-甲醇（821）為展開劑Rf0.1，采用堿性硅膠薄層用上述相同展開劑，Rf值增至0.4左右。說明豬屎豆堿為-堿性生物堿。,-,70,薄層層析法應用,化學成分的預試化學成分的鑒定探索柱層分離的條件,-,71,化學成分的預試,用薄層層析法進行中草藥化學成分預試，可依據(jù)各類成分性質(zhì)及熟知的條件，有針對性地進行。由于在薄層上展層后，可將一些雜質(zhì)分離，選擇性高，可使預試結果更為可靠。,-,72,化學成分的鑒定,以薄層層析法進中草藥化學成分鑒定，最好要有標準樣品進行共薄層層析。如用數(shù)種溶劑展層后，標準品和鑒定品的Rf值、斑點形狀顏色都完全相同，則可作初步結論是同一化合物。但一般需進行化學反應或紅外光譜等一種儀器分析方法加以核對。,-,73,探索柱層分離的條件,在進行柱層分離時，首先考慮選用何種吸附劑與洗脫劑。在洗脫過程中各個成分將按何種順序被洗脫，每一洗脫液中是否為單一成分或混合體，均可由薄層的分離得到判斷與檢驗。通過薄層的預分離，還可以了解多組分樣品的組成與相對含量。如在薄層上摸索到比較滿意的分離條件，即可將此條件用于干柱層析。,-,74,3、制備薄層色譜（PTLC）,一種是流動相靠毛細管作用力流經(jīng)固定相（傳統(tǒng)的制備型薄層薄層色譜），另一些方法是流動相靠外力強制流動，如離心薄層色譜和加壓薄層色譜。,-,75,3、制備薄層色譜（PTLC）,吸附劑硅膠是最常用的吸附劑。上樣量與吸附劑的厚度有關。上樣上樣是進行PTLC分離的一個最關鍵的步驟。上樣前先用樣品溶于少量溶劑，低揮發(fā)性溶劑可引起點樣帶變寬，因此最好選用揮發(fā)性溶劑（如己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等）。樣品濃度應在5%-10%左右。點樣帶應盡可能狹窄，以獲得更好的分離效果。點樣可用手工進行或自動點樣儀。展開劑的選擇及展開在進行PTLC之前應用分析型TLC預試驗來確定展開劑。被分離物質(zhì)的回收,-,76,3、吸附柱色譜（柱層析）,吸附劑的用量一般為樣品量的3060倍。樣品極性較小、難以分離者，吸附劑用量可適當提高到樣品量的100200倍。據(jù)此可選擇適當規(guī)格的色譜管，實驗室中常用色譜管的規(guī)格如下所示，其高度與直徑比（h/d）約為（151）（20：1）。柱色譜用的硅膠及氧化鋁通常以100200目或200300目為宜，或甚至直接采用薄層色譜用規(guī)格，其分離效果可以大大提高。,-,77,4、吸附柱色譜,洗脫劑的選擇，以TLC摸索洗脫條件裝柱，濕法裝柱（以起始洗脫劑拌勻裝柱）或干法裝柱,-,78,4、吸附柱色譜,（3）樣品的預處理能直接溶于洗脫劑的樣品用適量洗脫劑溶解樣品，盡可能少，以利樣品在吸附劑柱上形成狹窄的原始譜帶。不能溶解于洗脫劑的樣品，則將用能使之溶解的溶劑溶解后，再用少量吸附劑拌勻，并減壓抽干溶劑或在60下加熱揮盡溶劑，置真空干燥器中減壓干燥或直接減壓抽干、研粉后再小心鋪在吸附劑柱上。,-,79,4、吸附柱色譜,（4）洗脫用溶劑的極性宜逐步增加，跳躍不能太大。實踐中多用混合溶劑，并通過巧妙調(diào)節(jié)比例以改變極性，達到梯度洗脫分離物質(zhì)的目的。一般混合溶劑中強極性溶劑的影響比較突出，故不可隨意將極性差別很大的兩種溶劑組合在一起使用。實驗室中最常應用的混合溶劑組合如下：,-,80,吸附柱色譜常用混合洗脫溶劑,-,81,4、吸附柱色譜,（5）為避免發(fā)生化學吸附，酸性物質(zhì)宜用硅膠、堿性物質(zhì)則宜用氧化鋁進行分離。硅膠、氧化鋁用適當方法處理成中性時，情況會有所緩解。通常在分離酸性（或堿性）物質(zhì)時，洗脫溶劑中分別加入適量醋酸（或氨、吡啶、二乙胺），?？墒盏椒乐雇衔?、促進分離的效果。,-,82,5、聚酰胺吸附色譜法,聚酰胺（poliamide）吸附屬于氫鍵吸附，是一種用途十分廣泛的分離方法，極性物質(zhì)與非極性物質(zhì)均可適用，但特別適合分離酚類、醌類、黃酮類化合物。,-,83,（1）聚酰胺的吸附原理,系通過分子中的酰胺羰基與酚類、黃酮類化合物的酚羥基，或酰胺鍵上的游離胺基與醌類、脂肪羧酸上的羰基形成氫鍵締合而產(chǎn)生吸附。至于吸附強弱則取決于各種化合物與之形成氫鍵的能力。,-,84,聚酰胺的吸附原理,在含水溶劑中大致有以下規(guī)律：形成氫鍵的基團數(shù)目越多，則吸附能力越強。成鍵位置對吸附力也有影響。易形成分子內(nèi)氫鍵者，其在聚酰胺上的吸附即相應減弱。分子中芳香化程度高者，則吸附性增強；反之，則減弱。,-,85,聚酰胺的吸附原理,吸附因為是在溶液中進行，故溶劑也會參加吸附劑表面的爭奪，或通過改變聚酰胺對溶質(zhì)的氫鍵結合能力而影響吸附過程。聚酰胺與酚類或醌類等化合物形成氫鍵締合的能力在水中最強，在含水醇中則隨醇濃度的增高而相應減弱，在高濃度醇或其它有機溶劑中則幾乎不締合。故在聚酰胺柱色譜分離時，通常用水裝柱，樣品也盡可能作成水溶液上柱以利聚酰胺對溶質(zhì)的充分吸附，隨后用不同濃度的含水醇洗脫，并不斷提高醇的濃度，逐步增強從柱上洗脫物質(zhì)的能力。,-,86,聚酰胺的吸附原理,甲酰胺、二甲基甲酰胺及尿素水溶液因分子中均有酰胺基，作為第三者可以同時與聚酰胺及酚類等化合物形成氫鍵締合，故有很強的洗脫能力。此外，水溶液中加入堿或酸均可破壞聚酰胺與溶質(zhì)之間的氫鍵締合，也有較強的洗脫能力，可用于聚酰胺的精制及再生處理。常用的聚酰胺再生劑有10%醋酸、3%氨水及5%氫氧化鈉水溶液等。,-,87,聚酰胺的吸附原理,各種溶劑在聚酰胺柱上的洗脫能力由弱至強，可大致排列成下列順序：水甲醇丙酮氫氧化鈉水溶液甲酰胺二甲基甲酰胺尿素水溶液,-,88,聚酰胺色譜的應用,聚酰胺對一般酚類、黃酮類化合物的吸附是可逆的（鞣質(zhì)除外），分離效果好，加以吸附容量又大，故聚酰胺色譜特別適合于該類化合物的制備分離。對生物堿、萜類、甾體、糖類、氨基酸等其它極性與非極性化合物的分離也有廣泛的用途。因為對鞣質(zhì)的吸附特強，近乎不可逆，故用于植物粗提取物的脫鞣質(zhì)處理特別適宜。聚酰胺色譜也有薄層色譜和柱色譜兩種方式。,-,89,6、大孔吸附樹脂,大孔吸附樹脂是一種具有多孔立體結構人工合成的聚合物吸附劑，具有較好的吸附性能。它的吸附作用是通過表面吸附、表面電性或形成氫鍵。大孔樹脂吸附分離技術是采用特殊的吸附劑，選擇地吸附其中的有效成分，去除無效成分的一種提取精制的新工藝。,-,90,大孔吸附樹脂的性質(zhì),大孔吸附樹脂多為白色的球狀顆粒粒度多為2060目，通常分為非極性和極性兩大類，根據(jù)極性大小還可分為弱極性、中等極性和強極性。常用的為苯乙烯型和丙烯腈型，在樹脂合成時根據(jù)需要引入極性基團則成為極性樹脂從而增強吸附能力。大孔吸附樹脂的理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸、堿及有機溶劑。對有機物的選擇性較好，不受無機鹽類及強離子低分子化合物存在的影響。,-,91,大孔吸附樹脂的分離原理,吸附性范德華引力或生成氫鍵的結果。篩選原理本身多孔性結構所決定。由于吸附和篩選原理，有機化合物根據(jù)吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附脂上經(jīng)一定的溶劑洗脫而分開。,-,92,大孔吸附樹脂的分離原理,有機物與無機物的分離一般的吸附樹脂對溶液中的無機離子沒有任何吸附能力，在吸附混合物時，有機物被樹脂吸附，無機離子則隨水流出，因而很容易將二者分離。在中藥成分的提取中，此特征可使提取物中的重金屬和灼燒灰分降至要求的范圍內(nèi)。,-,93,大孔吸附樹脂的分離原理,解離物與非解離物的分離吸附樹脂對有機解離物與非解離物的吸附能力有很大差異。因此，可將二者分離。如有機酸在高pH值成鹽，很難被吸附，因此在堿性條件下可把有機酸分離出來。生物堿在酸性介質(zhì)中可以成鹽，因而能通過調(diào)節(jié)pH值進行分離。,-,94,大孔吸附樹脂的分離原理,一般有機物與強水溶性物質(zhì)的分離一般有機物，包括大多數(shù)中藥有效成分，是指有一定的水溶性，但溶解度不大的物質(zhì)，這些物質(zhì)容易被樹脂吸附。強水溶性物質(zhì)如低級醇類、低級胺類、糖及多糖、多數(shù)氨基酸、肽類、蛋白質(zhì)等，難被普通吸附樹脂吸附。用普通樹脂可很容易地將此兩類物質(zhì)分離。,-,95,（3）大孔吸附樹脂分離條件的確立,1、樹脂的選擇首先，要根據(jù)被分離化合物的分子體積的大小通過預實驗確定適當孔徑的樹脂。其次，要根據(jù)分子中是否含有酚羥基、羧基或堿性氮原子來確定樹脂的型號和分離條件。,-,96,大孔吸附樹脂分離條件的確立,2、洗脫液的選擇對非極性大孔吸附樹脂，洗脫劑極性越小，洗脫能力越強。對中等極性大孔樹脂和極性較大的化合物來說，則用極性較大的洗脫劑為佳。根據(jù)吸附力強弱選用不同的洗脫劑及濃度。為達到滿意的效果，可通過幾種洗脫劑濃度的比較來確定最佳洗脫濃度。實際工作中甲醇、乙醇、丙酮應用較多。,-,97,大孔吸附樹脂在中藥生產(chǎn)中應用的優(yōu)點,1、縮小劑量，提高制劑的內(nèi)在質(zhì)量大孔吸附樹脂處理可減少提取物中的雜質(zhì)，提高效成分的含量，使制劑劑量減小，有利于制成現(xiàn)代劑型的中藥制劑，并便于質(zhì)量控制。,-,98,大孔吸附樹脂在中藥生產(chǎn)中應用的優(yōu)點,2、減小產(chǎn)品的吸濕性傳統(tǒng)的提取方法所提的中成藥大部分具有較強的吸潮性，是中藥生產(chǎn)及儲藏中長期存在的問題。而經(jīng)大孔吸附樹脂處理可有效去除吸潮成分，增強產(chǎn)品的穩(wěn)定性。3、有效去除重金屬既保證了患者的用藥安全，同時也解決了中藥重金屬超標的難題，為中藥進入國際市場創(chuàng)造了條件。,-,99,大孔吸附樹脂在中藥生產(chǎn)中的應用,活性成分的提取分離如皂甙（人參總皂甙、蒺藜總皂昔）、黃酮（葛根總黃酮、山楂總黃酮、淫羊藿總黃酮）、內(nèi)酯、生物堿等化合物；,-,100,大孔吸附樹脂在中藥生產(chǎn)中的應用,質(zhì)量標準制定除去干擾成分，如金向群等在用薄層掃描法測定益壽永真口服液中人參皂甙Rg1的含量時，用YPRII型大孔吸附樹脂對樣品進行處理，70乙醇的洗脫液即為含人參皂甙Rg1的流分，由于去除了人參皂甙Rg1的色譜位置的干擾成分，可進行薄層掃描來確定人參皂苛Rg1的含量，為復方中的人參皂甙Rg1的含量測定提供了一個簡便可行的方法。,-,101,大孔吸附樹脂的處理,市售大孔吸附樹脂一般含有未聚合的單體、致孔劑（多為長碳鏈的脂肪醇類）、分散劑和防腐劑等雜質(zhì)，使用前必須經(jīng)過處理。處理方法是：采用乙醇濕法裝柱，隨用乙醇在柱上作流動清洗，并不時檢查流出的乙醇，直至流出的乙醇液與水混合不呈現(xiàn)白色乳濁現(xiàn)象即可，然后用大量蒸餾水洗去乙醇。,-,102,大孔吸附樹脂柱色譜,樣品一般用水溶液上柱。洗脫時根據(jù)吸附作用強弱不同選用不同濃度的甲醇、乙醇等含水溶劑，直至純的甲醇、乙醇，乃至丙酮、乙酸乙酯等。對非極性大孔吸附樹脂，洗脫溶劑極性越小，洗脫能力越強。對于中等極性的大孔吸附樹脂和極性較大的化合物來說，則以用極性較大的溶劑為宜。,-,103,根據(jù)物質(zhì)分子大小差異進行分離,天然有機化合物分子大小各異，中藥的化學成分非常復雜，通常含有無機鹽、生物堿、氨基酸和有機酸、酚類、酮類、皂昔、甾族和萜類化合物以及蛋白質(zhì)、多糖、粘液質(zhì)、鞣質(zhì)、淀粉、纖維素、無機鹽等。相對分子質(zhì)量的分布很寬，從幾十到幾百萬道爾頓。故可據(jù)此進行分離。表1列出了部分中藥所含主要成分的相對分子質(zhì)量范圍。,-,104,部分中藥主要成分的相對分子質(zhì)量,-,105,根據(jù)物質(zhì)分子大小差異進行分離,一般來講，高相對分子質(zhì)量物質(zhì)主要是膠體和纖維素等非藥效成分或藥效較低的成分，藥物有效部位的相對分子質(zhì)量一般較小，僅有幾百到幾千道爾頓。,-,106,根據(jù)物質(zhì)分子大小差異進行分離,1、凝膠過濾法2、透析法3、超濾法4、超速離心法,-,107,1、凝膠過濾法（gelfiltration）,也叫凝膠滲透色譜法（gelpermeationchromatography）、分子篩過濾（molecularsievefiltration）、排阻色譜(exclusionchromatography）。利用分子篩分離物質(zhì)的一種方法。,-,108,凝膠過濾法分離原理,葡聚糖凝膠在水中膨脹成球形顆粒，具有三維空間的網(wǎng)狀結構。由于凝膠網(wǎng)孔半徑的限制，大分子將不能滲入凝膠顆粒內(nèi)部（即被排阻在凝膠粒子外部），故在顆粒間隙移動，并隨溶劑一起從柱底先行流出；小分子因可自由滲入并擴散到凝膠顆粒內(nèi)部，故通過色譜柱阻阻力增大、流速邊緩，將較晚流出。樣品混合物中各個成分因分子大小