大腸桿菌基因工程ppt課件

基因工程GeneticEngineering,主講教師：李黃金,第三章大腸桿菌基因工程,Escherichiacoli（SEM，14000）,四、工程菌構(gòu)建、分析、發(fā)酵與產(chǎn)物分離純化,三、工程菌構(gòu)建策略,二、大腸桿菌表達系統(tǒng)高效表達原理,一、大腸桿菌表達（生產(chǎn)）系統(tǒng)的優(yōu)缺點,五、利用大腸桿菌系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白案例,第三章大腸桿菌基因工程,工程菌構(gòu)建發(fā)酵工藝研究分離純化工藝研究,四、工程菌構(gòu)建、發(fā)酵與產(chǎn)物分離純化,工程菌構(gòu)建研究內(nèi)容與技術(shù)路線,目的蛋白分析,表達載體與宿主菌株選擇,目的基因的獲得與優(yōu)化,表達載體構(gòu)建與分析,轉(zhuǎn)化與表達篩選,工程菌穩(wěn)定性分析,表達產(chǎn)物確證,工程菌菌種保存,1、目的蛋白分析：糖基化？難表達？難復(fù)性？藥用？1)理化特性()*分子大?。?KD、100KD難表達（融合表達、截短表達）*氨基酸組成：Cys、Pro多的難表達（用真核系統(tǒng)）*疏水性：疏水性強的難表達（截短表達、用真核系統(tǒng)）2)生物學特性：膜蛋白難表達（截短表達、用真核系統(tǒng)）,工程菌構(gòu)建主要研究內(nèi)容,3)用途藥用：安全性、產(chǎn)量、成本（包涵體、獨立表達）工業(yè)用：產(chǎn)量、成本（包涵體、獨立表達）研究用：迅速獲得活性產(chǎn)品為首要考慮（可溶、融合表達）,工程菌構(gòu)建主要研究內(nèi)容,2、選擇表達載體與宿主菌株：1）表達載體選擇啟動子、標簽、標記基因、拷貝數(shù)等。需要可溶表達時采用弱啟動子，T7啟動子最強，PL/PR熱激誘導(dǎo)不宜工業(yè)化。從蛋白特性、用途、發(fā)酵和分離純化工藝考慮標簽。藥用避免氨芐青霉素，用卡拉霉素。4）宿主菌：符合表達要求（T7RNA酶溶源？可溶？稀有密碼tRNA？），來源與遺傳背景清楚，資料翔實。,工程菌構(gòu)建主要研究內(nèi)容,3、目的基因獲得、分析與優(yōu)化克隆、合成、索要？,工程菌構(gòu)建主要研究內(nèi)容,翻譯起始位點與終止密碼子：頭尾不要缺，中間不能斷GC含量：70%時表達水平低二級結(jié)構(gòu)：mRNA二級結(jié)構(gòu)抑制翻譯的起始或終止?；蚧蛘叩鞍椎拇笮。阂话阏f來小于5kD或者大于100kD的蛋白都是難以表達的。前者融合表達，后者截取表達（如抗原用途，選抗原性強、好表達區(qū)段）。疏水性：疏水性強的、特別是膜蛋白難表達。截取表達。N端和C端穩(wěn)定性：人為突變末端殘基。,4、表達載體構(gòu)建與分析1）根據(jù)選定載體物理圖和基因特點設(shè)計與構(gòu)建PCR擴增目的基因：*引物中引入適當?shù)拿盖形稽c，避免基因內(nèi)部位點。*是否需要目的基因帶入ATG和TAA？是否要對框？2）表達載體酶切分析：雙酶切、多酶切圖譜分析3）目的基因序列分析：目的基因或表達盒序列分析,工程菌構(gòu)建主要研究內(nèi)容,pET21a質(zhì)粒物理圖譜,pET21a質(zhì)粒多克隆位點與表達盒,pET32a質(zhì)粒物理圖譜,pET32a質(zhì)粒多克隆位點與表達盒,.,M1234,目的基因：VL-,表達載體：pET32aM：Maker，1kblader1：PCR產(chǎn)物，引物含NcoI、HindIII2：HindIII單酶切pET32a質(zhì)粒3：NcoI-HindIII雙酶切重組子4：HindIII單酶切重組子,pET32a-VL-酶切鑒定,5、轉(zhuǎn)化與表達篩選1）轉(zhuǎn)化選定的工程菌宿主株（不同于克隆宿主菌?。?）表達篩選：以表達水平（%）為指標。表達水平（%）=目的產(chǎn)物占總蛋白的百分數(shù)測定方法：SDS-PAGE+凝膠掃描分析,工程菌構(gòu)建主要研究內(nèi)容,6、表達產(chǎn)物確證1）基本要求：SDS-PAGE+Western-Blot2）特殊要求（如基因工程藥物）：A、結(jié)構(gòu)：末端順序（N-端15個/C端3個）、氨基酸組成、肽圖等B、理化特性：分子量（SDS-PAGE、質(zhì)譜）、等電點、紫外特征吸收峰等C、生物學活性,工程菌構(gòu)建主要內(nèi)容,基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制,改善工程菌不穩(wěn)定性的策略,大腸桿菌工程菌的不穩(wěn)定性,工程菌遺傳穩(wěn)定性分析,7、工程菌遺傳穩(wěn)定性分析,工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)形式,結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性,重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學功能的喪失（不表達、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)改變）,分配不穩(wěn)定性（主要）,整個重組DNA分子從受體細胞中逃逸（curing）。導(dǎo)致表達水平下降。,重組質(zhì)粒的逃逸：,工程菌部分細胞因質(zhì)粒丟失而不再攜帶重組質(zhì)粒的現(xiàn)象。重組質(zhì)粒的宏觀逃逸率：工程菌培養(yǎng)液中丟失質(zhì)粒的細胞占細胞總數(shù)的百分比。宏觀逃逸率（%）=,非選擇性平板菌落數(shù)-選擇性平板菌落數(shù),非選擇性平板菌落數(shù),100,關(guān)閉質(zhì)粒DNA合成途徑，啟動降解程序,重組質(zhì)粒逃逸的原因,環(huán)境因素誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒滲漏高溫、表面活性劑（SDS）、藥物（利福平）、染料（吖啶）,目的基因高效表達誘導(dǎo)宿主細胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),目的基因表達盒“轉(zhuǎn)錄過頭”，影響Ori區(qū)域。,目的基因本底表達產(chǎn)物引起的毒性反應(yīng),抗性標記基因過表達，抗生素消耗過快。,重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性的產(chǎn)生原因,宿主細胞中的修飾性酶系對外源重組DNA分子的破壞,環(huán)境因素誘導(dǎo)的突變,宿主細胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進重組分子的缺失重排,改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略,1、改進載體-宿主系統(tǒng),選擇性地殺死無質(zhì)粒細胞如敲除宿主基因組致死性基因（如ssb基因，缺失無法DNA復(fù)制），并將其改由表達載體提供,正確設(shè)置載體上的多克隆位點，避免DNA片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi),選擇特定質(zhì)粒最適宿主菌株,使用可控型復(fù)制子（擴增與表達誘導(dǎo)同步),改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略,2、施加選擇壓力,根據(jù)載體上的抗藥性標記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素,藥物和食品生產(chǎn)時不宜使用抗生素,采用營養(yǎng)缺陷型宿主菌，載體含營養(yǎng)標記，培養(yǎng)基不含該營,養(yǎng)組份,改善基因工程菌不穩(wěn)定性的策略,3、采用嚴緊調(diào)控型載體系統(tǒng)，減少本底表達造成的不穩(wěn)定,4、優(yōu)化工程菌的培養(yǎng)工藝,培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定,培養(yǎng)溫度：較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定,在非選擇條件下連續(xù)傳代數(shù)代后，對工程菌重組質(zhì)粒存在狀況、結(jié)構(gòu)完整性和功能完整性進行分析：A、存在狀況：宏觀逃逸率B、結(jié)構(gòu)完整性：酶切圖譜分析、序列分析C、功能完整性：表達產(chǎn)物免疫特異性（westernblotting)表達水平（%）,工程菌遺傳穩(wěn)定性分析,1、原始菌種保存：實驗室構(gòu)建而來。凍干、-70保存。表達載體（質(zhì)粒）和宿主菌分別凍存更穩(wěn)定。2、主細胞庫（mastercellbank,MCB）：由原始菌種單一克隆一次培養(yǎng)與分裝而來，供工作細胞庫制備。凍干、-70保存。3、工作細胞庫（workingcellbank,WCB）:由主細胞庫單個最小包裝甘油種培養(yǎng)與分裝而來，供生產(chǎn)用。甘油種，-70保存。,8、工程菌菌種保存（三級種子庫）,工程菌生長與表達主要影響因素工程菌搖瓶水平生長與表達試驗工程菌工業(yè)發(fā)酵工藝研究,工程菌發(fā)酵工藝研究,1、培養(yǎng)基2、菌齡與接種量3、pH值、溫度與溶解氧4、誘導(dǎo)時機與收菌時機,工程菌生長與表達主要影響因素,工程菌生長曲線與表達曲線分析,生長曲線縱坐標：生物量（細胞密度OD600、干重/體積、濕重/體積）橫坐標：培養(yǎng)時間（小時）時期：停滯期、加速期、對數(shù)期、減速期、平臺期、衰減期表達曲線縱坐標：表達水平（%）、活性單位/體積橫坐標：培養(yǎng)時間（小時）,1、培養(yǎng)基影響菌體生長、質(zhì)粒穩(wěn)定性、表達水平、產(chǎn)物可溶性等碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等應(yīng)避免外源基因表達的“葡萄糖效應(yīng)”。氮源：有機氮：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米漿無機氮：氨水、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等其他：無機鹽、微量元素維生素、生物素等,工程菌生長與表達主要影響因素,2、菌齡與接種量菌齡：自接種起培養(yǎng)的時間（小時）影響停滯期、質(zhì)粒宏觀逃逸率接種量：是指接入的種子液體積占培養(yǎng)液體積的百分比接種量過?。貉娱L菌體停滯期，質(zhì)粒宏觀逃逸率高接種量過大：菌體生長過快，代謝產(chǎn)物積累過多，抑制后期菌體的生長，降低表達水平。,3、pH值、溫度與溶解氧pH值：影響生長速度、表達水平和產(chǎn)物可溶性。生長最適pH范圍在6.8-7.4，表達最適pH為6.0-6.5溫度：影響生長速度、表達水平和產(chǎn)物可溶性。生長最適37，較低溫度利于可溶性表達。溶解氧：影響生長速度和表達水平,4、誘導(dǎo)時機與收菌時機誘導(dǎo)時機：過早影響生物量、過晚影響表達水平一般在生長曲線對數(shù)中期或?qū)?shù)后期進行誘導(dǎo)收菌時機：過早影響表達水平、過晚影響產(chǎn)物穩(wěn)定性、可溶性、并造成浪費。一般在表達曲線平臺期（誘導(dǎo)后3-4小時）收菌,主要研究參數(shù)：培養(yǎng)基、接種量、pH值、溫度、誘導(dǎo)與收菌時機等主要觀察指標表達水平（%）、生物量、表達產(chǎn)物積累（包涵體形成）情況、質(zhì)粒宏觀逃逸率等結(jié)果：生長曲線與表達曲線,工程菌搖瓶水平生長與表達試驗,基本要求：高表達、高生物量、便于放大、低成本重點問題：1）質(zhì)粒穩(wěn)定性問題2）表達與生長的矛盾問題3）發(fā)酵方式問題：分批式or流加式發(fā)酵？常規(guī)發(fā)酵or高密度發(fā)酵？,工程菌發(fā)酵工藝基本要求與重點問題：,工程菌工業(yè)發(fā)酵工藝研究,工程菌工業(yè)發(fā)酵工藝流程,甘油種,活化試管/搖瓶,放大/種子罐,發(fā)酵/發(fā)酵罐,工程菌發(fā)酵工藝流程,1、菌種活化：參數(shù)：培養(yǎng)基、溫度、培養(yǎng)時間（菌齡）指標：菌體濃度（OD600）、質(zhì)粒宏觀逃逸率2、放大培養(yǎng)（種子液制備）：參數(shù)：菌齡、接種量、培養(yǎng)基、溫度、溶氧、攪拌速度、轉(zhuǎn)接時機（菌齡）、放大級數(shù)指標：菌體濃度（OD600）、質(zhì)粒宏觀逃逸率結(jié)果：生長曲線,工程菌發(fā)酵工藝研究主要內(nèi)容,3、發(fā)酵（放大培養(yǎng)與表達）：參數(shù)：種子液菌齡、接種量、培養(yǎng)基、溫度、溶氧、攪拌速度、誘導(dǎo)時機、收菌時機指標：菌體濃度、表達水平、質(zhì)粒宏觀逃逸率結(jié)果：生長曲線、表達曲線,工程菌發(fā)酵工藝研究主要內(nèi)容,4、發(fā)酵方式：1）批式發(fā)酵：較常用，高表達、但菌體量較少。2）流加發(fā)酵：較常用，主要補充碳源，菌體量大、表達水平下降，碳源流加時機和速度是關(guān)鍵。*高密度發(fā)酵：無機鹽介質(zhì)，通過碳源限制和流加實現(xiàn)高密度發(fā)酵。3）連續(xù)發(fā)酵：少用，高表達、高總生物量、難控制。,工程菌發(fā)酵工藝研究主要內(nèi)容,基因工程發(fā)酵,表達產(chǎn)物分離純化工藝研究,分離純化工藝研究的目的、任務(wù)和要求分離純化工藝設(shè)計原則粗提工藝精純工藝*精純主要任務(wù)*分離純化總策略*色譜技術(shù)為基礎(chǔ)的精純工藝,分離純化工藝研究的目的、任務(wù)和要求,目的：建立高效、便于規(guī)模放大和質(zhì)控的表達產(chǎn)物分離純化工藝任務(wù)：1、建立粗提工藝：從菌體或培養(yǎng)液中獲取目的產(chǎn)物，包涵體形式表達的尚包括變性和復(fù)性處理。2、建立精純工藝：去除蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)，使純度達到指定要求。3、建立工藝過程質(zhì)控體系要求：高活性、高得率、高純度、低費用,表達產(chǎn)物分離純化原則,要建立一個方便靈敏的蛋白檢測方法，以估價每一步的提純程度；分離步驟要盡可能少，每一步便于工業(yè)放大；盡量采用柱層析技術(shù)，各步驟間樣品應(yīng)無需復(fù)雜處理；初步分離要快速、大規(guī)模，精純要高分辨率；盡可能避免帶入有害物質(zhì);每步需統(tǒng)計：得率、純度、純化倍數(shù),粗提,離心,發(fā)酵液,發(fā)酵液,菌體,包涵體,裂解液,復(fù)性液,菌體,粗提液,上清,破菌、離心,洗滌、裂解,復(fù)性,胞內(nèi)表達,分泌表達,工藝流程,精純工藝主要任務(wù),1、去除非蛋白質(zhì)類大分子雜質(zhì)：內(nèi)毒素、DNA、RNA、脂類、多糖等2、去除蛋白質(zhì)類雜質(zhì)：宿主蛋白、融合表達的Tag、質(zhì)粒上其它元件表達產(chǎn)物、培養(yǎng)基帶來的蛋白等。3、去除純化方法帶來的雜質(zhì),分離純化策略,分離純化三步策略,分離純化工藝設(shè)計考慮要素,離子交換（Ionexchangechromatography，IEC)速度快，分辯率較高，適合前1-2步；疏水層析（Hydrophobicinteractionchromatography,HIC)速度快，分辯率較高，適合前1-2步；凝膠過濾(Gelfilter,GF)分辯率高，上樣體積和洗脫速度受限制,適合最后親和層析(Affinitychromatography,AC)速度快，分辯率較高，但成本高，配基污染，適合1-3步反相色譜（Reversedphasechromatography，RPC)分辯率高，但不適合蛋白質(zhì),主要色譜技術(shù)特點,色譜技術(shù)為基礎(chǔ)的精純工藝,層析系統(tǒng)工作流程,中壓層析系統(tǒng)AKTAexplorer100,AKTA-ready系統(tǒng)（生產(chǎn)型）,四、工程菌構(gòu)建、分析、發(fā)酵與產(chǎn)物分離純化,三、工程菌構(gòu)建策略,二、大腸桿菌表達系統(tǒng)高效表達原理,一、大腸桿菌表達（生產(chǎn)）系統(tǒng)的優(yōu)缺點,五、利用大腸桿菌系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白案例,第三章大腸桿菌基因工程,重組人胰島素,*胰島素是糖尿病特效藥，全球約1億患者*傳統(tǒng)的為豬源性產(chǎn)品*1982年，美國ElyLiLi公司首先使用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素*1987年，Novo公司推出重組酵母菌生產(chǎn)的人胰島素*目前主要在突變型方面進行研發(fā)，已有長效型與速效型入市,胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成,S,S,S,S,C,N,S,S,B肽（30）,C肽（31）,A肽（21）,R,R,R,K,S,S,S,S,C,N,S,S,N,C,高爾基體內(nèi)的特異性肽酶,N,C,信號肽,B肽,C肽,A肽,信號肽酶,利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素,A、B鏈分別表達法,胰島素原（BCA）表達法,A、B鏈共表達法,A鏈和B鏈分別表達法,基因工程菌的構(gòu)建策略：,tac,tac,b-Gal,b-Gal,Apeptide,Bpeptide,ori,ori,Apr,Apr,Met,Met,Met,Met,M,M,N,C,M,M,N,C,化學合成A鏈,和B鏈的編碼,序列,A鏈和B鏈分別表達法,表達產(chǎn)物的后處理路線：,M,M,N,C,M,M,N,C,b-Gal,b-Gal,A,B,CNBr處理,N,C,N,C,N,C,N,C,Cys體外氧化和重折疊,分離純化,人胰島素原（BCA）表達法,基因工程菌的構(gòu)建策略：,tac,b-Gal,Cpeptide,ori,Apr,Met,Met,M,M,N,C,Bpeptide,Apeptide,人胰島素原的cDNA,重組人胰島素原,轉(zhuǎn)化,分離純化,表達產(chǎn)物的后處理路線：,S,S,S,S,C,N,胰蛋白酶,Cpeptide,Apeptide,Bpeptide,M,R,R,K,R,CNBr,R,S,S,S,S,C,N,N,C,R,羧肽酶B,B鏈中第22位上的Arg和第29,位上的Lys由于良好折疊的原,因，對胰蛋白酶不敏感,人胰島素原（BCA）表達法,A鏈和B鏈同時表達法,tac,b-Gal,ori,Apr,Met,Met,M,M,N,C,Bpeptide,Apeptide,化學合成AB鏈編碼序列,重組人胰島素,轉(zhuǎn)化,分離純化,CNBr處理,特異性裂解,體外折疊,1、試述大腸桿菌表達系統(tǒng)工程菌構(gòu)建技術(shù)路線及工程菌鑒定內(nèi)容。2、工程菌質(zhì)粒不穩(wěn)定性的表現(xiàn)形式和機制是什么？有哪些改進策略？3、如何進行工程菌遺傳穩(wěn)定性分析？分析項目包括哪些？什么是質(zhì)粒的宏觀逃逸率？如何測定？4、工程菌常規(guī)保存條件為何？菌種庫包括哪幾種形式？相互關(guān)系如何？5、影響工程菌發(fā)酵的主要因素有哪些？什么是工程菌的生長曲線和表達曲線？最佳誘導(dǎo)時機在工程菌生長曲線中的什么時期？6、工程菌工業(yè)發(fā)酵工藝流程如何？發(fā)酵工藝研究需要解決的主要問題是什么？如何實現(xiàn)大腸桿菌高密度發(fā)酵？7、表達產(chǎn)物分離純化研究的主要內(nèi)容和原則是什么？8、大腸桿菌系統(tǒng)表達產(chǎn)物粗提工藝包括哪些內(nèi)容？9、表達產(chǎn)物精純的主要任務(wù)是什么？為什么主要采用色譜柱分離（層析）技術(shù)？在分離純化三步