《 基因工程的基本操作程序》PPT精選文檔

1,1.2基因工程的基本操作程序,2,1、目的基因的獲取,2、基因表達載體的構(gòu)建,3、將目的基因?qū)胧荏w細胞,4、目的基因的檢測與鑒定,基因工程基本操作的四個步驟,有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。,使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用,載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。,才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達。,一、目的基因的獲取,(一)、目的基因主要是_,編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,請舉出三個以上的例子,（二）、獲取目的基因的常用方法有哪些?,1、從基因文庫中獲取,2、利用PCR技術(shù)擴增,3、人工合成,4,一、目的基因的獲取,（一）從基因文庫中直接獲取,1.基因文庫：,2.基因文庫的分類:按外源DNA片段的來源分類,種類,基因組DNA文庫：含有一種生物的全部基因,部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫,3.基因文庫的目的,為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。,4.獲取目的基因的根據(jù)：,5,提取某種生物的全部DNA,用適當?shù)南拗泼盖?一定大小的DNA片段,將DNA片段與載體連接,導(dǎo)入受體菌中儲存,基因組文庫,5.基因文庫的構(gòu)建方法之一,（1）直接分離法(鳥槍法),6,某種生物的單鏈mRNA,單鏈互補DNA,雙鏈cDNA片段,導(dǎo)入受體菌中儲存,與載體連接,cDNA文庫,反（逆）轉(zhuǎn)錄酶,DNA聚合酶,反轉(zhuǎn)錄法：cDNA的合成流程圖解,5.基因文庫的構(gòu)建方法之,基因組文庫和部分基因組文庫(cDNA文庫)比較,8,2、利用PCR技術(shù)擴增目的基因,9,四種脫氧核苷酸(dNTP),一對引物：,熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）,模板DNA(需含有目的基因),Mg2+(激活劑),條件：,緩沖溶液,一對寡核苷酸序列：與目的基因的起始段互補,一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物,前提：,10,過程,高溫變性（解旋為單鏈）,低溫退火（引物與單鏈互補結(jié)合）,適溫延伸（在Taq酶的作用下合成與模板互補的DNA雙鏈）,重復(fù)循環(huán),預(yù)變性（增加DNA變性的概率）,11,2、具體過程,12,PCR(多聚酶鏈式反應(yīng)),概念：PCR全稱為_，是一項在生物_復(fù)制_的核酸合成技術(shù),條件：_、_、_、_.等,原理：_,方式：以_方式擴增，即_（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）,結(jié)果：,聚合酶鏈式反應(yīng),體外,特定DNA片段,DNA復(fù)制,四種脫氧核苷酸,一對引物,DNA聚合酶,指數(shù),2n,使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增,要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提條件）,過程：,a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_斷裂，形成_,b、退火（復(fù)性55-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的_。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,15,PCR技術(shù)擴增與DNA復(fù)制的比較,堿基互補配對,四種脫氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高溫下變性解旋,解旋酶催化,體外復(fù)制,細胞核內(nèi),熱穩(wěn)定的DNA聚合酶,細胞內(nèi)的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整個DNA分子,16,目的基因的mRNA,單鏈DNA(cDNA）,雙鏈DNA(即目的基因),反轉(zhuǎn)錄,合成,1）反轉(zhuǎn)錄法：以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列,目的基因,推測,推測,化學(xué)合成,2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：,3、人工合成的目的基因,17,二、基因表達載體的構(gòu)建基因工程的核心,1、目的：所需物質(zhì)：,使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。,它們各自的作用是什么?,2、基因表達載體的組成：,復(fù)制原點+目的基因+啟動子+終止子+標記基因,它們各自的作用是什么?,19,啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來,載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和復(fù)制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。,注意,三、將目的基因?qū)胧荏w細胞,（一）轉(zhuǎn)化：,（二）方法,將目的基因?qū)胫参锛毎?將目的基因?qū)雱游锛毎?將目的基因?qū)胛⑸锛毎?農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,顯微注射法,感受態(tài)細胞,目的基因進入_內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持_和_的過程,受體細胞,穩(wěn)定,表達,1、將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎ海?）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌特點：,易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力,原理：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。,23,過程：,優(yōu)點,（2）基因槍法（3）花粉管通道法,2、將目的基因?qū)雱游锛毎椒ǎ猴@微注射法程序：,目的基因表達載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動物,26,3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎松锾攸c：繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)少方法：,用Ca2+處理細胞感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA分子,四、目的基因的檢測與鑒定,檢查是否成功,（一）、檢測,1、檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因(關(guān)鍵步驟),.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標記,以此做探針.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中,（1）方法:,DNA分子雜交,（2）過程:,歸納步驟,30,DNA分子雜交示意圖,采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。,P15思考與探究,（二）、鑒定（個體生物學(xué)水平）,2、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法:,分子雜交,方法:,抗原抗體雜交,過程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA,歸納步驟,33,(四)目的基因的檢測與鑒定,檢查是否成功,檢測,鑒定,檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因,檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法,方法,方法,DNA分子雜交,分子雜交（注意與上不同之處）,抗原抗體雜交,歸納:基因工程的基本操作程序,獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達載體目的基因、啟動子、終止子、標記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定：,35,練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的處，DNA連接酶作用于處。（填“a”或“b”）,a,a,36,練習(xí)1：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（2）將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和法。（3）由導(dǎo)入目的基因的水稻細胞培養(yǎng)成植株需要利用技術(shù)，該技術(shù)的核心是和。（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標記的作探針進行分子雜交檢測，又要用方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。,基因槍法（花粉管通道法）,植物組織培養(yǎng),脫分化和再分化,耐鹽基因,一定濃度鹽水澆灌,1）以下說法正確的是（）A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運載體C、運載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與外源基因連接D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來,C,練習(xí),2）不屬于質(zhì)粒被選為基因運載體的理由是A、能復(fù)制（）B、有多個限制酶切點C、具有標記基因D、它是環(huán)狀DNA,D,練習(xí),3）有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是（）A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得C、目的基因須由運載體導(dǎo)入受體細胞D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶,A,練習(xí),4）有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）A、限制酶只在獲得目的基因時才用B、重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成C、質(zhì)粒都可作為運載體D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料,D,練習(xí),5）基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是（）A、人工合成目的基因B、目的基因與運載體結(jié)合C、將目的基因?qū)胧荏w細胞D、目的基因的檢測和表達,C,練習(xí),42,知識點一：1.原核細胞的基因結(jié)構(gòu),非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結(jié)合位點,啟動子,終止子,啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。,RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì).(以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落),43,不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。,：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì),編碼區(qū),非編碼區(qū),原核細胞的基因結(jié)構(gòu),有調(diào)控遺傳信息表達的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點。,非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,啟動子,終止子,44,編碼區(qū),與RNA聚合酶結(jié)合位點,內(nèi)含子,外顯子,能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子,不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列