【基金標(biāo)書(shū)】2010CB912000-神經(jīng)元信息感受重要蛋白質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)、調(diào)控及功能研究

項(xiàng)目名稱： 神經(jīng)元信息感受重要蛋白質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)、調(diào)控及功能研究 首席科學(xué)家： 羅建紅 浙江大學(xué) 起止年限： 2010 年 1 月 8 月 依托部門(mén)： 教育部 一、研究?jī)?nèi)容 （ 1）離子通道和受體的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制機(jī)制：系統(tǒng)分析電壓門(mén)控鈉離子和鈣離子通道、谷氨酸受體通道及 G 蛋白偶聯(lián)受體的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留 /返流信號(hào)，發(fā)現(xiàn)新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留 /返流信號(hào)和關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，篩選參與離子通道 /受體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制的關(guān)鍵相互作用蛋白，探討蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)作用，提出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制新的分子機(jī)制； （ 2）離子通道和受體的 囊泡分選、轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)節(jié)機(jī)制：分析離子通道 /受體轉(zhuǎn)運(yùn)的囊泡類型和轉(zhuǎn)運(yùn)模式，篩選和鑒定與轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)相關(guān)的蛋白質(zhì)復(fù)合物組分、離子通道和受體分選的分子內(nèi)部信號(hào)及其相互作用和調(diào)控機(jī)制，研究馬達(dá)蛋白和細(xì)胞骨架在離子通道和受體的囊泡和細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用和機(jī)制； （ 3）受體膜表面和突觸定位、內(nèi)化及再循環(huán)過(guò)程及其機(jī)制：分析谷氨酸受體、 G 蛋白偶聯(lián)受體及酪氨酸激酶受體在神經(jīng)元膜表面分布、突觸定位、內(nèi)化及再循環(huán)的分子和細(xì)胞機(jī)制，解析相關(guān)的受體結(jié)構(gòu)域、調(diào)控位點(diǎn)及相互作用蛋白，探討磷酸化和泛素化對(duì)相關(guān)環(huán)節(jié)的調(diào)控； （ 4）離子通道的膜轉(zhuǎn)運(yùn)與 神經(jīng)元興奮性調(diào)控：探討電壓門(mén)控鈉離子和鈣離子通道轉(zhuǎn)運(yùn)插入細(xì)胞膜數(shù)量的調(diào)控機(jī)制，分析離子通道在細(xì)胞膜上數(shù)量的改變對(duì)其電流和神經(jīng)元興奮性變化的貢獻(xiàn)，提出離子通道膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控神經(jīng)元遞質(zhì)釋放和信號(hào)傳導(dǎo)的新機(jī)制； （ 5）突觸后受體的動(dòng)態(tài)變化與突觸可塑性：研究在突觸可塑性產(chǎn)生過(guò)程中突觸后受體（特別是谷氨酸能受體）的數(shù)量和構(gòu)成的動(dòng)態(tài)變化及其受體亞型對(duì)不同類型突觸可塑性形成的作用，探討關(guān)鍵激酶和磷酸酶參與該過(guò)程協(xié)同調(diào)控機(jī)制，提出調(diào)節(jié)受體轉(zhuǎn)運(yùn)影響突觸可塑性的新機(jī)制 。 二、預(yù)期目標(biāo) （一） 總體目標(biāo) 高度特化的神經(jīng)元是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形 成和神經(jīng)信息正確處理的結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)，而負(fù)責(zé)信息感受的離子通道和受體蛋白在神經(jīng)元的正確定位和動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)對(duì)此具有特殊重要的意義。本項(xiàng)目整合了在相關(guān)領(lǐng)域已做出優(yōu)秀工作的科學(xué)家，擬選擇一組與神經(jīng)信息感受和傳導(dǎo)密切相關(guān)的離子通道和受體蛋白，系統(tǒng)研究其膜轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域、相互作用蛋白質(zhì)、磷酸化等調(diào)節(jié)及對(duì)神經(jīng)元興奮性和突觸功能的調(diào)控。通過(guò)發(fā)現(xiàn)新機(jī)制和新規(guī)律，加深對(duì)神經(jīng)信息處理過(guò)程中關(guān)鍵蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)及其相互關(guān)系的理解。通過(guò)該項(xiàng)目的實(shí)施獲得一系列具有國(guó)際領(lǐng)先和擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的研究成果，同時(shí)凝聚和造就一支在該領(lǐng)域 達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平的研究隊(duì)伍。 （二）五年預(yù)期目標(biāo) 1. 在基礎(chǔ)理論研究方面 ： （ 1） 系統(tǒng)分析電壓門(mén)控鈉離子和鈣離子通道、谷氨酸受體通道、 G 蛋白偶聯(lián)受體及酪氨酸激酶受體膜轉(zhuǎn)運(yùn)所依賴的分子內(nèi)部信號(hào)和關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，重點(diǎn) 解析并得 到 若干 新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留 /返流、內(nèi)吞 和再循環(huán) 、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和分選 的信號(hào) 或 關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域 ； （ 2） 鑒定 參與電壓門(mén)控鈉離子和鈣離子通道、谷氨酸受體通道、 G 蛋白偶聯(lián)受體及酪氨酸激酶受體膜轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵相互作用蛋白，闡明磷酸化 或 泛素化 對(duì)蛋白相互作用的 調(diào)控 機(jī)制 ， 提出新的 蛋白 相互作用模型 ； （ 3） 闡述電壓門(mén)控鈉離子和鈣離子通道、谷氨酸受體通道、 G 蛋白偶聯(lián)受體及酪氨酸激酶受體膜轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)神經(jīng)元興奮性和突觸可塑性的調(diào)控作用，深化離子通道和受體膜轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)神經(jīng)信息處理調(diào)控的認(rèn)識(shí) 。 2. 成果考 核指標(biāo) ： 在國(guó)際一流雜志（ 0）發(fā)表論文 5 - 8 篇，在有影響力的雜志（ ）上發(fā)表論文 25 - 30 篇。 3. 人才培養(yǎng) ：培養(yǎng)研究生 50 - 80 人， 培養(yǎng)出學(xué)科領(lǐng)軍型人才 3 - 5 名。 三、研究方案 （一） 學(xué)術(shù)思路 蛋白質(zhì)是生命活動(dòng) 也是神經(jīng)信息處理的主要 執(zhí)行者 ，其功能具有不同層次的解析。蛋白質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)和功能是一個(gè)基本層次，然而，細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)蛋白質(zhì)則通過(guò)蛋白 質(zhì)蛋白質(zhì)的相互作用、蛋白質(zhì)復(fù)合物及其網(wǎng)絡(luò)的形成、以及與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)復(fù)雜的相互作用等才最后達(dá)成具有細(xì)胞生理學(xué)意義的功能，這里包含了蛋白質(zhì)表征細(xì)胞生命活動(dòng)時(shí)所需要的精確、有序的時(shí)空調(diào)控。 神經(jīng)元信息處理相關(guān)的離子通道和受體如何通過(guò)其分子內(nèi)部信號(hào)、關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域和相互作用蛋白來(lái)決定和調(diào)節(jié)膜轉(zhuǎn)運(yùn)，達(dá)成正確的分布和定位并實(shí)現(xiàn)其在神經(jīng)元中的功能，這是一個(gè)蛋白質(zhì)科學(xué)與神經(jīng)科學(xué)相結(jié)合的重要前沿科學(xué)問(wèn)題。 本項(xiàng)目以理解神經(jīng)信息處理為引導(dǎo)，以與神經(jīng)信息感受和傳導(dǎo)相關(guān)的一組離子通道和受體為研究對(duì)象，圍繞膜轉(zhuǎn)運(yùn)（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制、囊泡分選和 轉(zhuǎn)運(yùn)、膜和突觸定位及內(nèi)化再循環(huán)）這條主線，采用分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、生物化學(xué)、蛋白組學(xué)、組織細(xì)胞免疫化學(xué)、活細(xì)胞熒光成像和電生理學(xué)等多層次先進(jìn)研究技術(shù)組合，以解析 蛋白質(zhì) 分子內(nèi)部信號(hào)或結(jié)構(gòu)域、鑒定相互作用蛋白質(zhì)、闡明調(diào)控機(jī)制及與神經(jīng)元信息處理關(guān)系為立足點(diǎn) ，對(duì)上述的蛋白質(zhì)活動(dòng)過(guò)程 中結(jié)構(gòu)和功能的基本問(wèn)題 進(jìn)行系統(tǒng)研究 （見(jiàn)下圖） ， 力爭(zhēng) 做出國(guó)際 領(lǐng)先 水平的研究工作 ，提升 我國(guó)在 該 領(lǐng)域 的學(xué)術(shù) 地位。 （二） 技術(shù)途徑 本項(xiàng)目選擇的研究對(duì)象是一組與神經(jīng)信息感受和傳導(dǎo)相關(guān)的膜蛋白，對(duì)其膜轉(zhuǎn)運(yùn)及調(diào)控的研究手段上具有共性，但針對(duì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)的不同 環(huán)節(jié)、調(diào)控機(jī)制及功能關(guān)系等研究又需要有不同的技術(shù)組合?？傮w來(lái)說(shuō)，本項(xiàng)目對(duì)研究?jī)?nèi)容和目標(biāo)強(qiáng)調(diào)整體設(shè)計(jì)，結(jié)合原有的研究基礎(chǔ)，將同時(shí)采用假設(shè)驅(qū)動(dòng)和探索驅(qū)動(dòng)的研究策略。強(qiáng)調(diào)綜合運(yùn)用基因、蛋白質(zhì)、細(xì)胞組織及整體多層次現(xiàn)代生物學(xué) 研究 技術(shù)，對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)不同環(huán)節(jié)的機(jī)制進(jìn)行解析，著眼于解析蛋白質(zhì)（包括新鑒定的相互作用蛋白質(zhì)）內(nèi)部信號(hào)或關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域、相互作用機(jī)制、膜和突觸定位及動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)運(yùn)、磷酸化等修飾調(diào)節(jié)機(jī)制，以達(dá)成對(duì)神經(jīng)元興奮性和突觸功能調(diào)節(jié)更為深入的理解。 離子通道和受體的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制機(jī)制 離子通道 /受體要表達(dá)到細(xì)胞膜上并履行其功能，必須首先要通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的質(zhì)量監(jiān)控。只有正確折疊，裝配， 暴露出一些前向運(yùn)輸信號(hào)或者屏蔽掉 留 /返流信號(hào)，甚至是具備正常功能的離子通道 /受體才能表達(dá)到細(xì)胞膜上。否則，它們將被滯留在 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) ，或者啟動(dòng) 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 相關(guān)降解途徑（ ER 降解，或者因過(guò)分堆積而引起相應(yīng)的病理過(guò)程。到目前為止，一些神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的重要離子通道 /受體的 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 質(zhì)控機(jī)制并不是 非常清楚，即便有些離子通道 /受體雖然鑒定出存在某種 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 駐留 /返流信號(hào)，但是其神經(jīng)元信息感受和傳導(dǎo)相關(guān) 的重要 蛋白 電壓門(mén)控離子通道 離子型谷氨酸受體 酪氨酸激酶受體 結(jié)構(gòu)相關(guān)信息的分析 內(nèi)部信號(hào)或關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的鑒定 分子及遺傳學(xué)技術(shù) （基因突變和基因敲除） 組織細(xì)胞免疫化學(xué)和 活細(xì)胞熒光成像技術(shù) 總體研究方案的學(xué)術(shù)思路和技術(shù)途徑示意圖 電生理技術(shù) 和藥理學(xué)方法 生物化學(xué)技術(shù) （ 生化 及 蛋白 質(zhì) 組學(xué)技術(shù)） 神經(jīng)信息傳導(dǎo)和可塑性調(diào)控 蛋白質(zhì)相互作用： 1. 新蛋白質(zhì)的鑒定 2. 分子機(jī)制研究 亞細(xì)胞定位 /動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白質(zhì)磷酸化等修飾 囊泡分選和轉(zhuǎn)運(yùn) 膜和突觸定位 內(nèi)化和 再循環(huán) 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 質(zhì)量控制 膜蛋白轉(zhuǎn)運(yùn) 和定位環(huán)節(jié) 神經(jīng) 系統(tǒng) 信息 處理 神經(jīng)元興奮性和 突觸功能調(diào)節(jié) 內(nèi)在的分子機(jī)制不是非常清楚，這些信號(hào)是如何發(fā)揮作用，又是如何被屏蔽的還需要進(jìn)一步探討。因此，我們擬以 電壓門(mén)控鈉離子通道 ，配體門(mén)控離子通道谷氨酸受體為模型，結(jié)合分子克隆技術(shù)，免疫熒光技術(shù)， 白電泳技術(shù)及電生理技術(shù)等 系統(tǒng)分析 其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留的分子機(jī)制 ，發(fā)現(xiàn)新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留 /返流信號(hào)和 /或 關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域， 然后通過(guò)雙相蛋白電泳技術(shù)，質(zhì)譜分析等 篩選參與 其 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制 相關(guān)的 關(guān)鍵作用蛋白，提出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制新的分子 模型 ； 并進(jìn)一步探討 炎性因子和各信號(hào)途徑對(duì) 電壓門(mén)控鈉離子通道 ，谷氨酸受體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制及 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留 /返流 信號(hào) 的調(diào)節(jié)作用 。 離子通道和受體的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制機(jī)制研究技術(shù)途徑示意圖 離子通道和受體的囊泡分選、轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)節(jié)機(jī)制 離子通道和受體的囊泡分選、轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)節(jié)機(jī)制 神經(jīng)元的軸突和樹(shù)突是神經(jīng)元與神經(jīng)元相互信息傳遞及感受外界化學(xué)和物理信息的最主要的部位，主要負(fù)責(zé)信息感受的離子通道和受體在神經(jīng)元的胞體合成后，要通過(guò)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜，這些囊泡更要通過(guò)軸漿運(yùn)輸?shù)姆绞较蜉S突和樹(shù)突 轉(zhuǎn)運(yùn)（正向運(yùn)輸），插入到軸突和樹(shù)突的細(xì)胞膜上，介導(dǎo)神經(jīng)元的信息加工過(guò)程。同時(shí)，神經(jīng)末梢的一些受體在受到其激動(dòng)劑的作用后被激活，進(jìn)入內(nèi)吞小體的囊泡狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)軸漿運(yùn)輸?shù)姆绞綄⑿盘?hào)傳遞到胞體（逆向運(yùn)輸），影響神經(jīng)元中一些基因的表達(dá)調(diào)控，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)元的功能。目前，在離子通道 /受體轉(zhuǎn)運(yùn)的囊泡類型、轉(zhuǎn)運(yùn)模式、蛋白序列的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)、相互作用蛋白和調(diào)控機(jī)制方面遠(yuǎn)未闡述清楚。因此，本研究將以電壓門(mén)控的鈉離子通道和鈣離子通道、配體門(mén)控的離子通道（谷氨酸受體、 體）等的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)作為切入點(diǎn)，利用分子克隆、神 經(jīng)元培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染、活細(xì)胞成像技術(shù)動(dòng)態(tài)描述離子通道 /受體轉(zhuǎn)運(yùn)的囊泡類型和轉(zhuǎn)運(yùn)模式，采用囊泡分離、免疫共沉淀和質(zhì)譜等方法和技術(shù)鑒定與轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)相關(guān)的蛋白質(zhì)復(fù)合物組分及相互作用，用基因過(guò)表達(dá)和沉默方法區(qū)分相互作用蛋白對(duì)離子通道 /受體轉(zhuǎn)運(yùn)的重要性，結(jié)合基因定點(diǎn)突變和刪減篩選決定離子通道和受體囊泡分選的分子內(nèi)部信號(hào)和相互作用蛋白的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，選擇不同外界信號(hào)刺激和信號(hào)通路激活模式觀察分子內(nèi)部信號(hào)和相互作用蛋白的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域在調(diào)控離子通道 /受體囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)中的機(jī)制，重點(diǎn)關(guān)注馬達(dá)蛋白和細(xì)胞骨架的磷酸化和乙?；{(diào)控作用，最終加深離子通 道 /受體囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控機(jī)制對(duì)神經(jīng)元興奮性和突觸可塑性的理解。 離子通道和受體的囊泡分選、轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)節(jié)機(jī)制研究技術(shù)途徑示意圖 受體膜表面和突觸定位、內(nèi)化及再循環(huán)過(guò)程及機(jī)制 神經(jīng)元受體 /離子通道轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜或突觸部位是其感受胞外信號(hào)并發(fā)揮正常功能的必要條件，這種定向轉(zhuǎn)運(yùn)通常依賴于胞內(nèi)復(fù)雜的蛋白質(zhì)運(yùn)輸調(diào)控機(jī)制來(lái)完成。受體膜表面和突觸定位、內(nèi)化及再循環(huán)過(guò)程的調(diào)控，依賴于受體分子中特定的結(jié)構(gòu)序列以及一系列與能與該結(jié)構(gòu)序列結(jié)合的分選蛋白質(zhì)分子，這些分選分子與目的蛋白質(zhì)中的特定序列相結(jié)合，幫助目的蛋白質(zhì)定向轉(zhuǎn)運(yùn)。不同 受體決定其膜表面和突觸定位、內(nèi)化及再循環(huán)過(guò)程的結(jié)構(gòu)序列以及相對(duì)應(yīng)的分選蛋白質(zhì)分子各不相同，這也是不同神經(jīng)元受體膜表面胞內(nèi)定位及運(yùn)輸不同的原因，因此有必要全面地建立神經(jīng)元受體胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)慕Y(jié)構(gòu)與相互作用蛋白質(zhì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此，本研究將以谷氨酸受體、 G 蛋白偶聯(lián)受體（甘丙肽受體 和 體）及酪氨酸激酶受體（ 體）為研究對(duì)象，利用包括免疫共沉淀、液 母雙雜交等大規(guī)模篩選和鑒定等手段，系統(tǒng)地篩選蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)復(fù)合物，然后將應(yīng)用包括免疫細(xì)胞化學(xué)染色、免疫電鏡、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)熒光追蹤、熒光相 關(guān)光譜分析 (光漂白后熒光恢復(fù)術(shù)（ 熒光共振能量轉(zhuǎn)移術(shù) (全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)（ 成像 技術(shù)進(jìn)行 亞細(xì)胞定位和實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)分析并結(jié)合 基 因操作、電生理和動(dòng)物模型等技術(shù)對(duì)其進(jìn)行深入的 結(jié)構(gòu)和 功能研究，解析這些蛋白質(zhì)分子是如何通過(guò)與相應(yīng)受體中的特定結(jié)構(gòu)域結(jié)合，調(diào)控受體膜表面和突觸定位、內(nèi)化及再循環(huán)過(guò)程，進(jìn)而影響到受體功能的執(zhí)行，調(diào)控突觸可塑性及神經(jīng)信號(hào)的感知與傳導(dǎo)。 膜 受體 關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域鑒定 受體膜表面和突觸定位、內(nèi)化及再循環(huán)過(guò)程及機(jī)制 研究技術(shù)途徑示意圖 篩選、鑒定與 膜 受體 相互作用的新蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn) 運(yùn)機(jī)制 蛋白質(zhì)剪切 加工調(diào)控 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留 /返流 受體 膜表面 動(dòng)態(tài)分布、亞細(xì)胞定位和功能 膜表面和突觸定位 內(nèi)化和分揀 酵母雙雜交 /免疫共沉淀 /質(zhì)譜技術(shù) 活細(xì)胞 熒光 成像技術(shù) （ 電生理技術(shù)和藥理學(xué)方法 細(xì)胞膜表面 受體熒光或 生物素標(biāo)記 技術(shù) 基因突變 /分子克隆 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 激光共聚焦成像技術(shù) 磷酸化 泛素 化 蛋白剪切 細(xì)胞興奮性的調(diào)控及 信號(hào)的感 知 降解 神經(jīng)信 息傳導(dǎo)的 調(diào)控 再循環(huán) 離子 型谷氨酸受體 酪氨酸激酶受體 離子通道的膜轉(zhuǎn)運(yùn)與神經(jīng)元興奮性調(diào)控 離子通道是神經(jīng)信號(hào)的發(fā)生和中樞信息處理的基礎(chǔ)。電壓門(mén)控鈉離子和鈣離子通道作為可興奮性細(xì)胞膜表面最重要的離子通道，其主要功能是形成動(dòng)作電位，將細(xì)胞電活動(dòng)轉(zhuǎn)化為鈣信號(hào)而激活其下游信號(hào)通路，從而構(gòu)成了神經(jīng)元的興奮性，導(dǎo)致神經(jīng) 遞質(zhì)釋放并產(chǎn)生一系列的胞內(nèi)活動(dòng)如細(xì)胞骨架、蛋白質(zhì)產(chǎn)生、磷酸化和去磷酸化及細(xì)胞增殖。對(duì)于電壓門(mén)控鈉離子和鈣離子通道的功能調(diào)控的研究，除了對(duì)其通道特性調(diào)控的研究外，細(xì)胞膜表面電壓門(mén)控鈉離子和鈣離子通道通道轉(zhuǎn)運(yùn)插入到細(xì)胞膜數(shù)量的調(diào)控機(jī)制也是重要的研究方面，即其膜轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控。離子通道膜轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控可能與通道的結(jié)構(gòu)、相關(guān)作用的分子、外界的調(diào)控因子和胞內(nèi)的信號(hào)通路有關(guān)，對(duì)于與離子通道相互作用分子的研究以往多集中在其輔助亞基，對(duì)于其它相互作用分子的研究只局限于個(gè)別分子，有必要全面地建立離子通道復(fù)合物相互作用蛋白質(zhì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 。該內(nèi)容試圖以電壓門(mén)控的鈉離子通道和鈣離子通道的膜轉(zhuǎn)運(yùn)為切入點(diǎn)，結(jié)合生物化學(xué)、分子生物學(xué)、電生理學(xué)等多種研究方法，研究通道的定位、轉(zhuǎn)運(yùn)和內(nèi)化等膜轉(zhuǎn)運(yùn)的不同環(huán)節(jié)對(duì)離子通道插入到細(xì)胞膜的數(shù)量的調(diào)控機(jī)制，并重點(diǎn)闡明其膜轉(zhuǎn)運(yùn)在初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元興奮性、中樞神經(jīng)元興奮性和突觸傳遞中的功能和調(diào)節(jié)，從而為以電壓門(mén)控鈉離子和鈣離子通道膜轉(zhuǎn)運(yùn)為靶點(diǎn)的特異性干預(yù)手段提供重要的理論基礎(chǔ)。 離子通道的膜轉(zhuǎn)運(yùn)與神經(jīng)元興奮性調(diào)控研究技術(shù)途徑示意圖 受體膜轉(zhuǎn)運(yùn)磷酸化調(diào)節(jié)與突觸可塑性 谷氨酸受體在突觸后胞漿及后膜間亞單位特異性的轉(zhuǎn)運(yùn)的動(dòng) 態(tài)變化是造成長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)及長(zhǎng)時(shí)程抑制等可塑性現(xiàn)象的重要分子機(jī)制 (et 1999;)。相對(duì)而言， 此，深入研究谷氨酸 氨酸受體在突觸后膜的動(dòng)態(tài)變化受到包括酪氨酸激酶受體、酪氨酸磷酸酶以及支架蛋白等多種信號(hào)的調(diào)控。 因此，本研究將以 酪氨酸激酶受體 酪氨酸激酶受體 用蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)技術(shù)、基因操作、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型、 細(xì)胞膜表面 受體熒光或生物素標(biāo)記技術(shù)、 活細(xì)胞 熒光 成像技術(shù)（ ，觀察它們對(duì) 膜以及內(nèi)化等動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的調(diào)控，并進(jìn)一步運(yùn)用藥理學(xué)方法和電生理學(xué)技術(shù)探討其對(duì)突觸傳遞和突觸可塑性的影響。 受體膜轉(zhuǎn)運(yùn)磷酸化調(diào)節(jié)與突觸可塑性 研究技術(shù)途徑示意圖 對(duì)話 匯聚 相互 作用 上膜 /內(nèi)化 突觸可塑性 受體介導(dǎo)的熒光素配體內(nèi)化法 生物素標(biāo)記表面受體生化法 電生理技術(shù) 電生理技術(shù) 蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)技術(shù) 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型 干擾小肽 藥理學(xué) 四、年度計(jì)劃 年度 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 一 年 1. 系統(tǒng)分析電壓門(mén)控鈉離子通道跨膜區(qū)段 ， 谷氨酸受體的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留 /返流信號(hào)，建立膜蛋白跨膜區(qū)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留 /返流信號(hào)的分子檢測(cè)模型，發(fā)現(xiàn)新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留 /返流信號(hào)和關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。 2. 篩查、識(shí)別和鑒定氧化代謝紊亂引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)細(xì)胞未知因子或蛋白因子，尤其是細(xì)胞趨化因子。 3. 系統(tǒng)分析胞內(nèi)信使、突觸蛋白、各信號(hào)途徑和胞外調(diào)控因子對(duì)受體或離子通道膜表面表達(dá)的影響。 4. 用生物信息學(xué)和 蛋白質(zhì)組學(xué)，質(zhì)譜分析等 方法篩選參與囊泡或線粒 體動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。 5. 中樞神經(jīng)系統(tǒng)海馬 件性敲除動(dòng)物模型的一般生理學(xué)與行為學(xué)觀察，探討磷酸酶 號(hào)缺失對(duì)海馬神經(jīng)元一般生理功能的影響 1. 發(fā)現(xiàn)鈉離子通道跨膜區(qū)段和谷氨酸受體的新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留 /返流信號(hào)。 2. 證實(shí)細(xì)胞趨化因子是神經(jīng)元調(diào)節(jié)腦內(nèi)免疫反應(yīng)的開(kāi)關(guān)分子。 3. 確定離子通道或受體軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)，上膜的基本模式。揭示胞內(nèi)信使、突觸蛋白、各信號(hào)途徑中關(guān)鍵蛋白和胞外調(diào)控因子對(duì)鈣離子通道的細(xì)胞及亞細(xì)胞定位和分布的影響。 4. 豐富參與囊泡和線粒 體動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)運(yùn)的膜蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。 5. 完成 海馬區(qū)（ 布、定位與時(shí)序表達(dá)差異（胚胎、新生、成年），完成 除品系 海馬區(qū)神經(jīng)元發(fā)生、分化及凋亡功能檢測(cè)。 第 二 年 1. 建立篩選參與離子通道 /受體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制的關(guān)鍵相互作用蛋白方法，并用于關(guān)鍵相互作用蛋白篩選。 2. 分析離子通道和受體在細(xì)胞膜上數(shù)量的改變對(duì)其通道電流、中樞神經(jīng)元興奮性變化和神經(jīng)遞質(zhì)釋放的貢獻(xiàn)。 3. 探討 力蛋白復(fù)合物及其它參與囊泡分選和融合的新的膜蛋白質(zhì)在囊泡形成、分選、轉(zhuǎn)運(yùn)、融合、釋放以及細(xì)胞器修復(fù)或周轉(zhuǎn)中的作用 。 4. 在體內(nèi)驗(yàn)證抗氧化劑對(duì)神經(jīng)元在氧化應(yīng)激情況下產(chǎn)生細(xì)胞趨化因子的調(diào)節(jié)作用。 5. 利 用 海 馬 神 經(jīng) 元 細(xì) 胞 株 明 確 合 物 在 介 導(dǎo)號(hào)的磷酸化調(diào)控機(jī)制。 以及 號(hào)調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)受體的膜分布、突觸定位與功能調(diào)控的影響 1. 揭示胞內(nèi)信使、突觸蛋白、各信號(hào)途徑中關(guān)鍵蛋白和胞外調(diào)控因子對(duì)離子通道或受體的電流、神經(jīng)元興奮性變化和神經(jīng)遞質(zhì)釋放的影響。 2. 確定 鑒定新的相關(guān)膜蛋白質(zhì)在囊泡形成、分選、轉(zhuǎn)運(yùn)、融合、釋放以及細(xì)胞器修復(fù)或周轉(zhuǎn)中的作用。發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)元中特異表達(dá)的動(dòng)力蛋白中鏈不同亞型的分布；以及在囊泡和細(xì)胞器選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)中的功能及機(jī)理。 3. 闡明細(xì)胞趨化因子調(diào)控腦內(nèi)免疫 /炎癥反應(yīng)的分子、細(xì)胞機(jī)制。 年度 研究?jī)?nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 三 年 1. 進(jìn)一步尋找鈣離子通道，谷氨酸受體 ，體 ， 體等分子內(nèi)部決定轉(zhuǎn)運(yùn)的信號(hào)。同時(shí)，在已發(fā)現(xiàn)的信號(hào)序列的基礎(chǔ)上，通過(guò)酵母雙雜交，雙向凝膠電泳，質(zhì)譜分析等方法篩選與信號(hào)序列有相互作用的蛋白質(zhì)。 2. 分析胞內(nèi)信使、突觸蛋白和各信號(hào)途徑對(duì)電壓門(mén)控鈣離子通道或者谷氨酸受體本身特性的影響及相應(yīng)的電流變化、中樞神經(jīng)元興奮性的改變和神經(jīng)遞質(zhì)釋放的影響。 3. 在整體水平（如轉(zhuǎn)基因鼠）探討相關(guān)蛋白質(zhì)復(fù)合物在不同囊泡及細(xì)胞器的逆行轉(zhuǎn)運(yùn)和選擇性調(diào)節(jié)相關(guān)機(jī)理及功能，闡明細(xì)胞趨化因子是 介導(dǎo)氧化代謝紊亂引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫 /炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子，及其可能的機(jī)制。 4. 在海馬腦切片水平，檢測(cè) 因敲除對(duì)海馬 影響。如有影響，將進(jìn)一步結(jié)合藥理學(xué)方法找尋其作用機(jī)制。 5. 完成 此基礎(chǔ)上選定另外目標(biāo)蛋白，用同樣方法研究目標(biāo)蛋白的磷酸化。 6. 總結(jié)前 2 年的實(shí)驗(yàn)，在總結(jié)過(guò)程中對(duì)實(shí)驗(yàn)方案有偏差部分做修正。 1. 發(fā)現(xiàn)與離子通道相偶聯(lián)的信號(hào)分子。 2. 進(jìn)一步確定細(xì)胞膜鈣離子通道特性和數(shù)量的改變與神經(jīng)元突觸傳遞的關(guān)系。明確分別由 活所誘導(dǎo)的制是否相同。 3. 闡明不