薄層色譜的操作

1、.薄層色譜的操作1.方法原理 薄層色譜是一種微量分析的分離過程，它將樣品點在以玻璃板或鋁、塑料等片材為載體的多孔吸附劑薄層的固定相上,利用流動相在特定的展開室中將混合物中的組份推移到不同距離處，在色譜展開整個過程中，樣品的成份受到正反不同的力的作用。(1) 流動相利用毛細管力帶著樣品穿過固定相。(2) 樣品與固定相的相互作用是指組份在移行過程中由于偶極 - （誘導(dǎo)） - 偶極相互作用，氫鍵和范德華力的作用而產(chǎn)生不同程度的延緩、吸附、分散、離子交換和絡(luò)合等分離機理。由于樣品組份與流動相和固定相之間的相互作用力程度不同，整個毛細管流動過程中分離運動都在進行?；谶@點，TLC系統(tǒng)（流動相和固定相）必

2、須與樣品很好地匹配。用顯色試劑處理，許多組份可在日光或紫外燈光下檢視。色譜可用肉眼或使用光密度計和照相機記錄或影像系統(tǒng)方法來評價。2. 薄層板2.1手工自制板2.1.1玻璃板的要求:用于制備薄層板的玻璃板要求表面光潔、平整，最好使用厚薄12mm的優(yōu)質(zhì)平板玻璃，普通窗玻璃一般不宜用于制作薄層板，玻璃板需洗凈至不掛水，晾干，貯存于干燥潔凈處備用。玻璃板反復(fù)使用時，應(yīng)注意經(jīng)常用洗液及堿液清洗，保持玻璃板面的光潔是保證薄層板質(zhì)量的最基本要求2.1.2制作方法:除另有規(guī)定外，將1份吸附劑加適量的水（如1份硅膠G一般加3份水），在研缽中用研杵沿一個方向小心研磨至成均勻的有適當粘稠度的膠漿,立即傾入涂布器中

3、,均勻地向前推進涂布在玻璃板上;或按照不同涂布器的規(guī)定操作涂布;涂布好的薄層板于室溫下在水平臺上晾干,再在規(guī)定的溫度(一般為105110)下烘約30分鐘活化,貯于干燥器中備用。薄層板的厚度一般為0.250.5mm.。2.2 商品化供應(yīng)的預(yù)制板和高效板2.2.1板的尺寸 20x20cm 10x20cm 20x10cm 10x10cm圖1 不同的板尺寸TLC/HPTLC預(yù)制板有不同的規(guī)格供應(yīng)。常用的尺寸為20 x 20，10 x 20，20 x 10，或10 x 10 cm。使用的規(guī)格取決于TLC或HPTLC的類別和樣品的數(shù)目。2.2.3 TLC/HPTLC板的預(yù)洗及活化一般來說，色譜板應(yīng)用溶劑如

4、氯仿-甲醇(8:2)，甚至用更強的洗脫溶劑的混合物進行預(yù)洗。具體操作可通過空白色譜展開來實現(xiàn)。色譜板預(yù)洗完后,應(yīng)在105C加熱1小時進行干燥，再在室溫下置放至少2小時（需采取保護措施以防止實驗室空氣中的污染物重新附著在其上面，如放置在空的干燥器中）。3. 樣品點樣31點狀點樣和條帶狀點樣每次點樣前，TLC/HPTLC板應(yīng)在正常光線下和紫外燈下用肉眼檢查薄層的損傷情況和雜質(zhì)，只有無損傷、清潔的TLC/HPTLC板方可使用。樣品可進行點狀或條帶狀點樣。要想獲得最佳的薄層分辨率，必須保證移行方向中的起點要小，常規(guī)的TLC薄層點狀點樣每次點0.5至5微升，相比之下，HPTLC薄層最大點樣量為1微升。點

5、樣量較大的樣品可使用自動化裝置點樣，噴霧成條帶狀是一種可以點樣量大而同時又能促成最有效分離的點樣方法。在常規(guī)操作過程中，人工點樣一般使用微量毛細管（0.5/1/2/3和5 ?l），點樣時毛細管必須完全充滿和完全排空，要以垂直方向小心接觸TLC/HPTLC板面，不要損傷薄層，受損的薄層會導(dǎo)致溶劑不規(guī)律地流動而在色譜上產(chǎn)生失真的TLC譜帶。人工點樣建議使用Nanomat。它點樣位置精確并安全，使薄層免于受損。用適當?shù)慕橘|(zhì)干燥Nanomat也可用作單個量的多次點樣。樣品體積大于5 ?l，通常用如Linomat或Automatic TLC Sampler III的方法用氮氣噴霧成窄條。若（就是）要求點

6、狀樣品點樣，Linomat 和Automatic TLC Sampler III應(yīng)將條長度設(shè)定在1至2 mm。3.2 樣品點樣位置起點的最佳位置如圖2和3所示。起點下緣的最小距離b取決于溶劑量。兩個起點之間的距離c必須令平行移行的主成份不會相互觸及。點狀點樣時原點的直徑應(yīng)小于或等于3mm（高效板原點的直徑應(yīng)更?。?條帶的長度d由點樣樣品體積或樣品的種類和相對于板的尺寸點樣的數(shù)目來決定。到板側(cè)邊的距離a必須足夠大以避免分離區(qū)失真變形（見圖2和3）。圖2： 斑狀樣品點樣的一般點樣位置（a = 20mm, b = 10mm, c =兩起點之間的距離。）圖3： 條狀樣品點樣的一般點樣位置（a = 20

7、mm, b = 10mm, c = 兩起點之間的距離，d = 條的長度）。4.層析4.1展開室 4.1.1直立式雙槽展開室 具有節(jié)省溶劑、便于預(yù)平衡、可控制展開箱內(nèi)的濕度等優(yōu)點。4.1.2 水平展開室 可以從薄層板的兩側(cè)向中間水平地展開，這樣可使一塊薄層板所承受的樣品個數(shù)比常規(guī)上行展開的薄層板增加一倍。 4.1.3 自動展開室(AMD) 可使用五種溶劑對同一薄層進行多次展開，自動控制預(yù)飽和、展開方式、展開距離和干燥條件，分離效率比傳統(tǒng)方式提高三倍（可在80mm之內(nèi)分離40種成分），符合GLP/GMP要求。4.2. 溶劑使用的溶劑必須是“分析純”或“色譜純”，溶劑組成采用體積量比（如正丁醇 -

8、冰乙酸 - 水 = 4：1：1，V/V/V），或者絕對量（如18ml甲苯 + 2 ml甲醇）。其總量應(yīng)足以使TLC/HPTLC板的浸入深度約為5mm。展開劑要求新鮮配制，不要多次反復(fù)使用,如需分層，則按要求放置分層后取需要的一相（上層或下層），備用。在雙槽展開室中，對每種類型和規(guī)格和層析板，每槽通常注入的溶劑數(shù)量如表3。表3：板的規(guī)格 板的尺寸（寬高） 溶劑量預(yù)制板 2020cm2010cm1010cm 25ml15ml8ml高效板 2010cm1010cm 10ml5ml4.3展開室狀況溶劑的蒸氣相在展開箱中也參與色譜展開而形成三維的層析過程，展開箱的氣體空間在層析過程中起著重要的作用。以下

9、有四種常見的情況（A、B、C、和D）。 4.3.1方法A（展開室不飽和）方法A的特點：l 不呈飽和狀態(tài)l 無濾紙l 只有一個槽內(nèi)有溶劑 l 每個展開室只有一塊TLC/HPTLC板l 薄層向里（如圖4）圖4：有溶劑和TLC/HPTLC板的雙槽展開室方法A的操作程序：TLC/HPTLC板在倒入相應(yīng)量的展開劑后立即放至展開室中，薄導(dǎo)層板應(yīng)垂直地豎放在溶劑中，薄層向里，展開室蓋上后層析立即展開。對某些分離過程，在產(chǎn)品專用方法中有明確的說明時，另一槽可盛放一些調(diào)節(jié)液體（乙酸，濃氨水等）。 4.3.2方法B（部分飽和，無濾紙）方法B的特點：l 不完全飽和l 無濾紙l 在兩個槽內(nèi)盛放溶劑 l 每個展開室只有

10、一塊TLC/HPTLC板l 薄層向里（如圖5）圖5： 有溶劑和TLC/HPTLC板的雙槽展開室方法B的操作程序：將展開劑倒入至兩個槽內(nèi)，蓋上蓋子，置放15分鐘后，將蓋子移向一邊，TLC/HPTLC板涂層向時地豎放入溶劑中，蓋上展開室，讓TLC/HPTLC板開始展開。對某些分離過程，在產(chǎn)品專門方法中有明確的說明時，另一槽可放置調(diào)節(jié)液體（乙酸，濃氨水等）。 4.3.3方法C（展開室飽和，有濾紙）方法C的特點：l 用放入濾紙使飽和（至少30分鐘）l 在兩個槽內(nèi)盛放溶劑 l 每個展開室只有一塊TLC/HPTLC板l 薄層面向濾紙（如圖6）l 圖6： 有溶劑、濾紙和TLC/HPTLC板的雙槽展開室方法C

11、的程序：將展開劑倒入至兩個槽內(nèi)，將與展開室相同型號的濾紙（如CAMAG序號022.5243）用規(guī)定量的溶劑濕潤后貼在玻璃展開室正面，蓋上蓋子，放置30分鐘（標準時間），然后將蓋子移向一邊, TLC/HPTLC板薄層面向著濾紙豎放入溶劑中，蓋好展開室讓板進行層析。對某些分離過程，在產(chǎn)品專用方法中有明確說明時，另一槽可置放調(diào)節(jié)液體（乙酸，濃氨水等）。 4.3.4方法D（展開室飽和，薄層預(yù)穩(wěn)定）方法D的特點：l 薄層預(yù)穩(wěn)定，放置濾紙使展開室飽和l 溶劑量增加一倍l 每個展開室只有一塊TLC/HPTLC板l 薄層面向濾紙(如圖7)圖7：有溶劑， 濾紙和TLC/HPTLC板的雙槽展開室方法D的程序：將展

12、開劑倒入至一個槽內(nèi)，將與展開室相同型號的濾紙（如CAMAG序號022.5243）用規(guī)定量的溶劑濕潤后貼在玻璃展開室正面，另一槽空著,TLC/HPTLC板薄層面向濾紙地置放在空槽中，除非產(chǎn)品專用方法另有規(guī)定，15分鐘（標準時間）后，穩(wěn)穩(wěn)地傾斜使足夠量的溶劑移至有TLC/HPTLC板的槽中（圖8，只有用20x20和20x10cm的展開室才能這樣做；若為10x10cm的展開室，溶劑需從外部用移液管或類似器材實現(xiàn)轉(zhuǎn)移）。圖8： 傾斜的雙槽展開室圖9：有溶劑，濾紙和經(jīng)預(yù)穩(wěn)定TLC/HPTLC板的雙槽展開室，層析開始4.4參數(shù)4.4.1溫度 薄層色譜分析一般在室溫中進行。對這過程，溫度在20 - 25?C

13、算不上是臨界值。 在這過程，中無短期的溫度波動才是更為重要（避免抽風(fēng)）。展開室應(yīng)放置在無直射陽光和不通風(fēng)處。溫度波動對層析結(jié)果不利，故將展開室放在靠近窗口或熱源處是欠妥的。4.4.2空氣濕度 空氣濕度極高或極低主要影響有非極性溶劑 體系的無機涂層。相對空氣濕度高于70-80%會影響薄層鈍化，使Rf值增加。樣品點樣后，TLC薄層可置放在適當?shù)牧蛩岷退幕旌衔锏纳厦娌簧儆?0分鐘，調(diào)整至指定的相對濕度。有關(guān)這方面的更多資料可從HPTLC Vario系統(tǒng)的操作手冊中獲得。另一方面，在樣品點樣前，TLC/HPTLC板可在105?C再活化30分鐘進行干燥。然后薄層必須用一塊玻璃板保護起來，只有起點區(qū)露出

14、以便于樣品點樣。若空氣太干燥，可在干燥器中將TLC/HPTLC薄層置于水的上方以達到所要求的狀況。確定合適的層析條件的有效方法（用規(guī)定的濕度，溶劑蒸汽或溶劑調(diào)整使薄層達到要求的狀況）是使用HPTLC Vario體系?？刂葡鄬穸扔玫牧蛩崛芤合卤恚?相對濕度 所需硫酸濃度（V/V）硫酸（ml） + 水（ml）32%47%42%58%65%72%88% 68.0 10050.0 10057.0 10039.5 10034.0 10027.5 10010.8 1005 層析后衍生作用若層析板分離的物質(zhì)肉眼看不見又不能被紫外光活化，需加試劑 方能顯色或發(fā)射熒光者，則需使用適當?shù)脑噭┙n或均勻噴灑于薄層

15、板面上，直接觀察或加熱顯色后觀察。加熱顯色者須注意加熱時間和溫度，尤其含羧甲基纖維素鈉的薄層板，加熱溫度過高或時間過長，容易引起板面的焦化，如用硫酸等顯色劑更易造成板面的炭化而影響顯色效果。有的成分加試劑后，如揮發(fā)油成分經(jīng)香草醛硫酸顯色，加熱溫度和時間長短不同或放置時間不同均可能使斑點的顯色有所改變。有的品種可熏以試劑或試液的蒸氣（如碘蒸氣、氨蒸氣）顯色。5.1 噴霧試劑溶液以氣溶膠的形式均勻地噴灑在薄層上。電動的TLC噴霧器用最少的試劑溶液產(chǎn)生幾近理想的氣溶膠。5.2 浸漬使用適當?shù)脑O(shè)備如色譜浸漬設(shè)備III（Chromotogram Immersion Device III）,TLC/HPT

16、LC板浸漬具有重現(xiàn)的結(jié)果。通過設(shè)定垂直方向速度（進入，抽出）和規(guī)定停留時間，浸漬條件可被精確地標準化。6檢測 6.1 定性分析（同一性試驗）在相同的狀態(tài)下（相同類型的TLC/HPTLC板、相同的溶劑體系組成、相同的組份點樣體積和其它TLC設(shè)備系統(tǒng)），樣品成份的Rf值、顏色、與專用的或特殊基因衍生化試劑的反應(yīng)和參考物或標準物在同一TLC/HPTLC板同時層析所得的結(jié)果相符時，未知物就可認為是存在而被鑒別出來。分析的結(jié)果可以采用照片，照片復(fù)制品，影像記錄（如：CAMAG 薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)）或TLC掃描儀方法記錄下來。當混合物物質(zhì)被測試時，參考標準物中單個餾份的Rf值可能會與純物質(zhì)的Rf有所不同

17、，但測試物理學(xué)餾份和標準化餾份的hRf值必須相符，其DhRf在 3之內(nèi)。為增加測試物與參照物同一性的可信度，采用TLC掃描儀實時記錄其紫外光和可見光圖譜并進行比較。多波長測定將測試物和參照物的圖譜情況和hRf值相關(guān)聯(lián)供進一步鑒別。6.2 定量分析（儀器：CAMAG scanner-3；具體操作請參考操作手冊或教學(xué)軟件）定量分析采用光密度掃描法來評價。用winCATS 軟件控制薄層色譜掃描儀以及進行掃描結(jié)果的數(shù)據(jù)處理，計算出各成分的峰高和峰面積及其平均值和離散系數(shù)（CV）或置信窨（CI）。通過單水平或多水平校準計算出結(jié)果。最后以報告形式將所有掃描參數(shù)、原始資料及圖像結(jié)果保存及打印。掃描狹縫寬度根

18、據(jù)被測成份斑點的大小來調(diào)整（1）點狀點樣得到TLC中各成份，掃描其全寬度；（2）條帶狀點樣，通?？梢話呙杵渖V帶同心部份的50 - 70%。物質(zhì)的掃描波長可以通過光譜掃描來決定。TLC/HPTLC板空白部位的漫射反射光用光電倍增器（PM）來收集并定其值為10% （=0% 吸收）。掃描吸光物質(zhì)時，其吸收隨著物質(zhì)的量而增加。對于具有熒光或可轉(zhuǎn)變成具熒旋光性衍生物的物質(zhì)的測定。光源一般使用發(fā)射光譜在254 - 578 nm之間的高壓汞蒸汽燈，在254，302，313，366，405，436，546和578nm處有特別高強度的譜線。吸收了選擇性激發(fā)波長后TLC中各成份發(fā)射出的較長波長熒光由光倍增器記錄

19、下來，使用銳截止濾波器或窄帶濾波器將會阻止TLC/HPTLC板反射的激發(fā)波長光到達光電倍增器。和吸附測定一樣，熒光強度作為板上定位的函數(shù)作圖得模擬曲線（熒光定位曲線）（圖10）。TLC掃描儀的測定原理在有關(guān)的設(shè)備文獻中有報導(dǎo)。熒光測定比吸收測定優(yōu)越在于如下幾點：（1）檢出極限低1 - 3個數(shù)量級；（2）在較寬的濃度范圍內(nèi)校準曲線呈線性；（3）選擇性較高。圖10： a) 有好幾個成份的TLC/HPTLC板b) TLC/HPTLC板的模擬曲線在測定極限以上所有的檢測成份可被量化。在檢出極限以上而在測定極限以下的檢測成份會給出檢出和測定極限的平均值（作為結(jié)果）。7 標準條件下述的兩個標準條件對不同的

20、板規(guī)格適用。在產(chǎn)品專用試驗方法中，應(yīng)參考這一普通的分析方法。標準條件或?qū)藴蕳l件的偏差必須限定。71 HPTLC板10 x 10和20 x 10 cm HPTLC預(yù)涂板的標準條件總結(jié)如下以便于參考。薄層 商品化生產(chǎn)的HPTLC板規(guī)格 10 x 10和20 x 10 cm板；由樣品數(shù)目決定點樣 用毛細管移液管或Nanomat進行斑狀點樣或用自動點樣器作條狀點樣數(shù)量 一般，斑狀點樣用20 nl - 1 ml, 窄條點樣用2 - 20ml定位 起點在距板下緣10 mm處溶劑 數(shù)量限定采用體積量或絕對量。一般，對10 x 10 cm雙槽展開室的一個槽加5ml,對20 x 10 cm雙槽展開室的一個槽加

21、10ml分離距離 5 cm展開室 對10 x 10或20 x 10 cm板用雙槽展開室分離模式 線性（上行式或水平的）飽和 （A） 無濾紙放入；溶劑和TLC/HPTLC板同時加入到展開室中。（B） 無濾紙放入；至少在層析展開開始前10分鐘將溶劑倒入至展開室中。（C） 放入濾紙；至少在層析展開開始前30分鐘將溶劑倒入至展開室中。（D） 放入濾紙；用溶劑蒸汽將在無溶劑的空槽中的TLC/HPTLC板調(diào)整其狀況不少于10分鐘。將展開室傾側(cè)使層析展開開始。這方法只在用20 x 10 cm板的雙槽展開室適用。用10 x 10 cm板的雙槽展開室，溶劑需從外面用移液管或類似方法注入。溫度 室溫，通常為20

22、- 25?C空氣濕度 無機薄層必須在室溫，相對濕度50 - 60%下達到平衡檢測 如各相應(yīng)的方法所規(guī)定72 TLC板20 x 20和10 x 20 cm TLC預(yù)涂板的標準條件總結(jié)如下以便于參考。薄層 商品化生產(chǎn)的TLC板規(guī)格 20 x 20cm， 20 x 10cm或10 x 20 cm（標準的）板；由點樣樣品數(shù)目決定點樣 斑狀點樣用標準的用后即棄的毛細管移液管，條狀點樣用自動點樣器數(shù)量 一般，斑狀點樣用1 ml - 5 ml, 條狀點樣用2 - 20ml定位 起點在距板下緣15 mm處溶劑 數(shù)量限定采用體積量或絕對量。一般，對20 x 10 cm雙槽展開室的一個槽加15ml,對20 x 2

23、0 cm雙槽展開室的一個槽加25ml分離距離 對20 x 20 cm展開室為12 cm，對20 x 10 cm展開室為7 cm展開室 對20 x 20或20 x 10 cm板用雙槽玻璃展開室分離模式 線性（上行式或水平的）飽和 （A） 無濾紙放入；溶劑和TLC/HPTLC板同時加入到展開室中。（B） 無濾紙放入；至少在色譜展開開始前10分鐘將溶劑倒入至展開室中。（C） 放入濾紙；至少在色譜展開開始前30分鐘將溶劑倒入至展開室中。（D） 放入濾紙；用溶劑蒸汽將在無溶劑的空槽中的TLC/HPTLC板調(diào)整其狀況不少于10分鐘。將展開室傾側(cè)使色譜展開開始。這方法只在用20 x 10 cm板的雙槽展開室適用。用10 x 10 cm板的雙槽展開室，溶劑需從外面用移液管或類似方法注入。溫度 室溫，通常為20 - 25?C空氣濕度 無機薄層必須在室溫，相對濕度50 - 60%下達到平衡檢測 如各相應(yīng)的方法所規(guī)定鋪板鋪板用的勻漿不宜過稠或過?。哼^稠，板容易出現(xiàn)拖動或停頓造成的層紋；過稀，水蒸發(fā)后，板表面較粗糙。勻漿配比一般是硅膠G:水=1：23，硅膠G:羧甲基纖維素鈉水溶液=1:2。研磨勻漿的時間，根據(jù)經(jīng)驗來定，與空氣濕度有關(guān)，一般通過拿起研棒