普洱茶黃酮類物質(zhì)對(duì)D-galactose誘導(dǎo)氧化應(yīng)激大鼠GSH-Px活性影響的研究

1、科類農(nóng)科編號(hào)（學(xué)號(hào)） 57本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）普洱茶黃酮類物質(zhì)對(duì)D-galactose 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激大鼠GSH-Px 活性影響的研究Studies of the effects of flavonoid in pu er tea-Pxon the GSHactivity in oxidative stress rats induced by D-galactose李銀麗指導(dǎo)教師：侯 艷職稱：講 師云南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆明 650201學(xué)院：龍潤普洱茶學(xué)院專業(yè)：茶學(xué) （茶藝茶道方向）年級(jí)：2010 級(jí)論文（設(shè)計(jì)）提交日期：2014 年 4 月答辯日期： 2014 年 5 月答辯委員會(huì)主任：呂才有云南農(nóng)

2、業(yè)大學(xué)2014 年 5 月普洱茶黃酮類物質(zhì)對(duì)D-galactose 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激大鼠GSH-Px 活性影響的研究李銀麗（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，龍潤普洱茶學(xué)院，昆明，650201）摘要【目的】 探討普洱茶黃酮類物質(zhì)對(duì)D-galactose 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激大鼠GSH-Px 活性的影響；【方法 】以由 D-galactose 誘導(dǎo)引起的氧化損傷試驗(yàn)大鼠為模型動(dòng)物，造模成功的試驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為陽性（D-galactos e 模型）對(duì)照組、藥物組， 50%乙醇洗脫物（低、中、高劑量）組，30%乙醇洗脫物（低、中、高劑量）組，10%乙醇洗脫物（低、中、高劑量）組，加上為陰性（正常）對(duì)照組共 12 組，每組 12 只（

3、雌雄各半）。持續(xù)分別給予蒸餾水、Vitamin E 水溶液（混懸液）、普洱茶黃酮類物質(zhì)乙醇洗脫物50%（低、中、高）、30%（低、中、高） 10%（低、中、高）、蒸餾水。連續(xù)灌喂28 天后犧牲實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，測(cè)定試驗(yàn)大鼠心、肝、腎與腦組織中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性 ?！?結(jié)果 】與正常對(duì)照組( Vehicle group) 相比， D-galactose誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型組大鼠主要臟器（心，肝、腦與腎）組織中 GSH-Px 活性顯著降低。 藥物對(duì)照組 （Vitamin E ）與模型組比較， 大鼠臟器（心，肝、腦與腎）組織中GSH-Px 活性顯著升高（ P0.001 ）。普洱茶黃酮類提取

4、物50%，30%和 10%的乙醇洗脫物均具有增加D-galactose 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型大鼠主要臟器（心，肝、腦與腎）組織中GSH-Px 活性的作用（ P0.01 ），并具有劑量 - 效應(yīng)關(guān)系，且三種物質(zhì)的作用相當(dāng)?！窘Y(jié)論 】普洱茶黃酮類物質(zhì)具有增加氧化應(yīng)激大鼠GSH-Px 活性的作用。關(guān)鍵詞 :普洱茶，黃酮類物質(zhì)；抗氧化；GSH-Px；大鼠1Studies of the effects of flavonoid in pu er tea on theGSH-Px activity in oxidative stress rats induced byD-galactoseLi yin li(

5、Yunnan Agricultural University;College of Long-run Pu-erh tea；Kunming 650201)ABSTRACT【 OBJECTIVE 】 To investigate the effects of flavonoid in puer tea-PxonactivitytheGSHin oxidative stress rats induced by D-galactose. 【METHODS 】 In this study, we usedoxidative stress rats as animal model, the succes

6、sfully established experimental rats modelswere randomly dividedaspositivecontrolgroup,drug group (VitaminE),50% ethanolic elutiongroups(includehigh ,middleand low three dosage groups),30% ethanolic elutiongroups(includehigh ,middle,low three dosage groups),10% ethanolic elutiongroup(include high ,m

7、iddle, low three dosage groups) and negtivegroup with 12 rats in each group. Each group rats were given by gavage with distilled water,Vitamin E, high, middle, low doses of 50% ethanolic elution, high, middle,low doses of30% ethanolic elution and high , middle, low doses of 10% ethanolic elution, an

8、d distilled water respectively. The heart, liver, kidney and brain of rats were obtained 4 weeks later, in which the vitality of GSH-Px were detected.The vitality of GSH-Px in main organs of oxidative stress ratssignificantly reduced,Compared with normal control group.Thevitality of GSH-Px in main o

9、rgans of drug group rats significantly increased, Compared with positive control group(P0.001). The flavonoids in Puer tea(50% ,30% and10%ethanolicelution)couldimprovetheactivityofGSH-Px in main organs of oxidative stress rats （ P 0.01) , and showed a significant dose response relationship, and thes

10、e three elutions serve the same function.【 CONCLUSION 】Flavonoids in pu er tea have significant effect on increasing the -GSHPxactivity in oxidative stress rats induced by D-galactose.Key words: the flavonoidson of Pu-Erh Tea； antioxidatio ；D-galactose； Rats2洱茶黃酮類物質(zhì)對(duì)D-galactose 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激大鼠GSH-Px 活性影響的研

11、究1 引言1.1 普洱茶的概述及其研究現(xiàn)狀普洱茶是以云南省一定區(qū)域內(nèi)的云南大葉種曬青毛茶為原料， 經(jīng)過后發(fā)酵加工成的散茶和緊壓茶 1 。普洱茶屬于黑茶類 , 產(chǎn)于云南省西雙版納、思茅和臨滄等地 , 自古以來即在普洱集散 , 因而得名 2 , 是我國的特種茶類 3。渥堆發(fā)酵是普洱茶的特征工序，對(duì)普洱茶的保健功效起著關(guān)鍵作用4 。研究表明，普洱茶具有抗氧化 5 、減肥 9 、暖胃助消化 10 、抗癌 11 、健齒護(hù)牙 12 、降壓 13 、防治糖尿病、提高免疫力、生津止渴、醒酒解毒、降血脂 6 、降血糖 7、抗突變、防癌及防治心血管疾病等功能。普洱茶藥理作用的主要成分是茶多酚、茶色素和茶多糖等8

12、。茶葉中的多酚類包括黃烷醇類、黃酮類、黃酮醇類、花青素類、花白素類；酚酸及縮酚酸類等多種結(jié)構(gòu)類型的酚類化合物3 。從生物學(xué)角度來看，人體的生命活動(dòng)是由難以計(jì)數(shù)的酶促氧化還原反應(yīng)組成的。例如機(jī)體所需能量的產(chǎn)生，是在細(xì)胞當(dāng)中的“發(fā)電廠”線粒體中的一系列氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的。在其反應(yīng)過程中，不可避免地產(chǎn)生大量的“中間產(chǎn)物” 。這些“中間產(chǎn)物”就是所謂的“自由基” 。即帶有未成對(duì)電子的分子基團(tuán)，反應(yīng)活性極高?？晒羧梭w當(dāng)中任何的分子，因而，這種物質(zhì)常被稱為“有害垃圾” 。在正常情況下，這些“有害垃圾”或“自由基”可被細(xì)胞中的環(huán)衛(wèi)系統(tǒng)“抗自由基”分子消除掉。當(dāng)機(jī)體的垃圾清理系統(tǒng)能力不足或功能紊亂時(shí)，這些垃

13、圾就會(huì)在人體中沉積。這些“垃圾”可沉積到皮膚，人體皮膚便會(huì)出現(xiàn)“老年斑” ；當(dāng)這些“垃圾”沉積到心臟時(shí)，人體可出現(xiàn)心悸、心慌與氣短。當(dāng)這些“垃圾”堆積到腦組織時(shí)，就可出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶的障礙， 如失眠、健忘等。當(dāng)這些“垃圾”沉積到腎組織中時(shí)，人體便會(huì)出現(xiàn)腎功能的損害，如出現(xiàn)蛋白尿甚至血尿等。所謂的“氧化應(yīng)激”（ Oxidative Stress，OS），其實(shí)就是機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)活性氧自由基 ( reactive oxygen species，ROS）和活性氮自由基（ reactive nitrogen species，RNS）產(chǎn)生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡

14、，從而導(dǎo)致組織損傷。即體內(nèi)“有害垃圾”的產(chǎn)生與“垃圾清除”失衡。垃圾產(chǎn)生大于垃圾清理，結(jié)果導(dǎo)致組織的損傷。大量資料證明，炎癥、腫瘤、衰老、血液病，以及心、肝、肺、皮膚等各方面疑難疾病的發(fā)生機(jī)理與體內(nèi)自由基過多積累或清除自由基能力下降有著密切的關(guān)系。自由基和活性氧的生成，主要來自體外、體內(nèi)各種因素，體外因素主要是各種各樣環(huán)境因素中的自由基進(jìn)入到體內(nèi)，特別重要的是大氣污染物質(zhì)、藥物、紫外線、放射線等；體內(nèi)自由基的產(chǎn)生系統(tǒng)主要有：活性化的巨噬細(xì)胞，白血球 ( 嗜中性白細(xì)胞、嗜酸性白細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞 ) ，細(xì)胞內(nèi)微粒 ( 線粒體、細(xì)胞核膜、微粒體等 ) ，氧化金屬蛋白質(zhì) ( 氧合血

15、紅蛋白 ) ，酶類 ( 黃嘿吟氧化酶、叫睬胺氧添加酶等 ) ，身體內(nèi)物質(zhì)的自動(dòng)氧化 ( 兒茶酚胺、硫醇化合物等 ) 等。因此，降低自由基危害的途徑也有兩條：一是，利用內(nèi)源性自由基清除系統(tǒng)清除體內(nèi)多余自由基；二是，發(fā)掘外源性抗氧化劑自由基清除劑，阻斷自由基對(duì)人體的入侵。1.3 普洱茶黃酮類物質(zhì)的概述黃酮類 ( Flavone) 物質(zhì)是自然界廣泛存在的一類黃色色素， 茶葉中黃酮類物質(zhì)約為茶葉干重的 3%-4%。相關(guān)試驗(yàn)表明， 黃酮類物質(zhì)能通過其所含的酚羥基結(jié)構(gòu)與自由基反應(yīng)而達(dá)到可有效清除羥自由基和體內(nèi)自由基 , 實(shí)現(xiàn)抗氧化作用，且其清除自由基的能力大于維生素 C 和維生素 E12 。此外，黃酮類物

16、質(zhì)還作為一種天然的抗氧化劑，以其安全、高效地防止油脂及其制品氧化和酸敗，保證含油食品的感官品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值，延長保存期而受到人們的關(guān)注 13 。黃酮類基本結(jié)構(gòu)是 2-苯基色原酮（2-Phenylchromone），現(xiàn)在則泛指兩個(gè)具有酚羥基的苯環(huán)（ A 與 B 環(huán)）通過中央三碳原子相互連接而成的一系列化合物。黃酮具有較高的藥用價(jià)值 , 黃酮類物質(zhì)具有：抗菌作用；抗病毒作用；抗過敏作用；抗衰老作用；抗腫瘤及降血脂等多種生物活性 14 。1.4 研究目的和意義綜上所述，自由基與多種疾病的關(guān)系，已愈來愈被重視，自由基生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展使得探尋高效低毒的自由基清除劑天然抗氧化劑成為生物化學(xué)和醫(yī)藥學(xué)的研究熱點(diǎn)。

17、抗氧化被認(rèn)為是茶葉保健抗癌的最重要機(jī)理。 對(duì)普洱茶中活性物質(zhì)具有抗氧化作用的研究越來越深入，而普洱茶黃酮類物質(zhì)是否具有抗氧化作用，以及其抗氧化作用是如何發(fā)揮的還鮮見報(bào)道?；钚匝踝杂苫殡S代謝而產(chǎn)生，因而氧化應(yīng)激損傷隨時(shí)都會(huì)發(fā)生。為了應(yīng)對(duì)時(shí)時(shí)刻刻都會(huì)產(chǎn)生的損傷，人類和動(dòng)物在進(jìn)化中發(fā)展了多重防線。除了SOD 以外，生物細(xì)胞4中還存在谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px) 抗損傷系統(tǒng)，只是它們的分工不同?；钚匝踝杂苫?ROS 經(jīng)過 SOD 酶的催化，轉(zhuǎn)化為過氧化氫（ H2O2），H2O2再經(jīng)過 GSH-Px 的催化轉(zhuǎn)化為水和分子氧。 實(shí)驗(yàn)研究顯示， GSH-

18、Px 活性隨衰老的下降，與多器官的抗損傷能力下降有關(guān)。國際上的生物學(xué)家做了一些有趣的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)單純?cè)黾?SOD 的活性，并不能顯著地對(duì)抗衰老，而同時(shí)增加GSH-Px 的活性，則顯著延長衰老動(dòng)物的健康壽命。因此，本次試驗(yàn)采用柱層析法以不同乙醇濃度（ 50%，30%，10%）洗脫液獲得的普洱茶黃酮類物質(zhì)為原料，以由 D-galactose誘導(dǎo)引起的氧化損傷試驗(yàn)大鼠為模型動(dòng)物，對(duì)其持續(xù)分別經(jīng)口灌胃普洱茶黃酮類物質(zhì) 50%（高、中、低）、30%（高、中、低）、10%（高、中、低） 4 周后，犧牲試驗(yàn)動(dòng)物，測(cè)定其主要臟器（心，肝、腦與腎）組織中谷胱甘肽過氧化物酶（ GSH-Px）的活性，并確定其劑量 -

19、 效應(yīng)關(guān)系。揭示普洱茶黃酮類物質(zhì)的抗氧化作用 , 為普洱茶的抗氧化功能評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。2 研究材料與方法2.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)本試驗(yàn)自 2013 年 10 月 1 日至 2014 年 1 月 25 日進(jìn)行為期四個(gè)月的動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)。動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)是在動(dòng)科院小動(dòng)物房養(yǎng)殖 4 房間進(jìn)行，生化指標(biāo)的測(cè)定是在動(dòng)科院牧醫(yī)樓衛(wèi)檢實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。2.2 研究材料， 4保存。對(duì)照藥物 ： 采用經(jīng)過國際上證明用于抗氧化應(yīng)激有效的藥物，Vitamin E 膠囊（美國Spring valley International Vitamin Corporation Freehold公司， Catalog. No ：WMT64

20、4596，Lot. No:000020, NJ07728 USA），規(guī)格： 400I.U./per soft gel。8 周齡， SPF 級(jí) SD 大鼠，雌雄各半，體重180.0-220.0g。購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK-2009。動(dòng)物置于 12h/12h 明暗交替環(huán)境，自由進(jìn)食。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均按北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例執(zhí)行?；A(chǔ)飼料：由昆明醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，配方見表1。表 1 基礎(chǔ)飼料配方5Tab. 1 Basic feed formula成 分配 比（ g/kg ）配 比（ g/kg ）玉米350鹽麥麩250菜油豆粕250礦物添加劑魚粉80復(fù)合維生素酵母2

21、0蛋氨酸骨粉20賴氨酸配 比 （g/kg ）5510.31.30.7乳清粉10魚肝油0.5動(dòng)物墊料：購于昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。牛血清白蛋白（ Bovine serum albumin）：美國 AMRESCO 公司產(chǎn)品（目錄： 0332。批號(hào)： 3271C266）；考馬斯蛋白測(cè)定試劑盒（Coomassie Bradford Protein Assay Kit, microplate assays）：美國熱科皮爾斯生物技術(shù)產(chǎn)品（目錄： 23200,，批號(hào)：NH172158）谷胱甘肽過氧化物酶（ GSH-Px）測(cè)定試劑盒（ Cat No： A005-1）：南京建成生物工程研究所提供；西門子尿十項(xiàng)干

22、化學(xué)檢測(cè)試紙：西門子醫(yī)療診斷公司（目錄號(hào)： 8566001；批號(hào)：209044）實(shí)驗(yàn)鼠籠、灌胃器具：蘇杭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備廠；80-1/2 低速離心機(jī)：常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；80-2 電動(dòng)離心機(jī)：常州市普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；20L 微量采血管：安徽赫爾生物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科技有限公司；XW-80A 旋渦混合器：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；Epppendorf-4910單道微量可調(diào)移液器：德國Epppendorf 公司；SUNRISE酶標(biāo)儀：奧地利GmbH 公司；AU2700全自動(dòng)生化分析儀：貝克曼庫爾特商貿(mào)( 中國 ) 有限公司。6其他：磨口瓶、秒表

23、、注射器、剪刀、移液管、燒杯、玻璃勻漿器、手術(shù)刀等。2.3 方法2.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)原理D-galactose供給過量，超常產(chǎn)生活性氧， 打破了受控于遺傳模式的活性氧產(chǎn)生與消除的平衡狀態(tài)，引起試驗(yàn)小鼠氧化效應(yīng)后，采用供試樣品進(jìn)行為期4 周的干預(yù)，測(cè)定試驗(yàn)小鼠相應(yīng)的抗氧化指標(biāo)，評(píng)價(jià)受試物的抗氧化能力。2.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇參照中華人民共和國衛(wèi)生部 2003 年頒布的保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范和國際公認(rèn)動(dòng)物模型，根據(jù)所評(píng)價(jià)的功能性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要求，選擇 168 只( 雌雄各半) 外形符合健康標(biāo)準(zhǔn)的 SPF級(jí)近交系 SD 大鼠為試驗(yàn)對(duì)象，體重在 180g-220g之間。2.3.3 動(dòng)物飼養(yǎng)管理大鼠同室

24、每籠 4 只，雌雄分籠飼養(yǎng)。 動(dòng)物飼養(yǎng)條件為室溫： 22 2，濕度：45-60%，12 小時(shí)明暗交替?；\具、墊料應(yīng)舒適、衛(wèi)生、無毒和安全。每2 天換一次墊料，飲水瓶定期換水消毒，飼養(yǎng)房間定時(shí)用白醋或消毒劑消毒，房間定時(shí)通風(fēng)，使其保持一個(gè)良好的飼養(yǎng)環(huán)境。2.3.4 過氧化模型的建立試驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周后，隨機(jī)挑選 12 只（ 6 只雌性， 6 只雄性）試驗(yàn)大鼠為陰性對(duì)照組。其余 156 只大鼠，每天按照每 100g 大鼠體重，皮下注射 10% 0.1ml 的 D-半乳糖（ D-galactose， 100mg/kg.bw）溶液，連續(xù) 6 周；陰性對(duì)照組給予等容量的生理鹽水。第 6 周末，留

25、取新鮮尿液， 用西門子尿十項(xiàng)干化學(xué)檢測(cè)試紙， 對(duì)新鮮尿液中的蛋白、紅細(xì)胞進(jìn)行初步快速檢測(cè)。 以評(píng)價(jià) D-Glactose 導(dǎo)致的腎組織的氧化應(yīng)激損傷程度 （以腎組織作為評(píng)價(jià)心、肝、腦等內(nèi)臟損傷的標(biāo)志物 -biomarker）。選取造模成功的大鼠，即血清 MDA 水平較正常對(duì)照大鼠顯著增高，蛋白尿陽性（ +以上），鏡下血尿陽性（ +以上）的大鼠，隨機(jī)分組進(jìn)行下一步試驗(yàn)。2.3.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及劑量確定造模成功的試驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為陽性（D-Glactose 模型）對(duì)照組、藥物組， 50%乙醇洗脫物（低、中、高劑量）組，30%乙醇洗脫物（低、中、高劑量）組， 10%乙醇洗脫物（低、中、高劑量）組，加

26、上為陰性（正常）對(duì)照組共12 組，每組 12 只（雌雄各半）。普洱茶黃酮類提取物低、中、高劑量按照人體推薦量折算為大鼠灌胃量的 5 倍，10 倍, 20 倍，即為 20mg/kg.bw、40 mg/kg.bw、80 mg/kg.bw；對(duì)于藥物對(duì)照組的大鼠，每日灌喂Vitamin E水溶7液（混懸液），依據(jù)人的臨床劑量，按照國際通用的換算方式（human equivalent dose），換算為大鼠的試驗(yàn)劑量為：如表 2 所示：表 2 實(shí)驗(yàn)大鼠分組和劑量設(shè)計(jì)Tab 2 Experimental group and feed composition實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量飼料組成普洱茶灌胃劑量藥物組灌胃劑量實(shí)

27、驗(yàn)組別（mg/kg.bw）（I.U./kg.bw ）（只）陰性（正常）對(duì)照組-12基礎(chǔ)飼料蒸餾水D-Galactose vs Vehicle陽性（ D-半乳糖模型）對(duì)照組-12基礎(chǔ)飼料蒸餾水D-Glactose藥物干預(yù)組-41.312基礎(chǔ)飼料Vitamin E50%乙醇洗脫物低劑量干預(yù)組基礎(chǔ)飼料20-1250%-Low Vs D-alactose50%乙醇洗脫物中劑量干預(yù)組基礎(chǔ)飼料40-1250%-Medium Vs D-alactose50%乙醇洗脫物高劑量干預(yù)組基礎(chǔ)飼料80-1250%-High Vs D-alactose30%乙醇洗脫物低劑量干預(yù)組基礎(chǔ)飼料20-1230%-Low Vs

28、D-alactose30%乙醇洗脫物中劑量干預(yù)組基礎(chǔ)飼料40-1230%-Medium Vs D-alactose30%乙醇洗脫物高劑量干預(yù)組基礎(chǔ)飼料80-1230%-High Vs D-alactose10%乙醇洗脫物低劑量干預(yù)組基礎(chǔ)飼料20-1210%-Low Vs D-alactose10%乙醇洗脫物中劑量干預(yù)組基礎(chǔ)飼料40-1210%-Medium Vs D-alactose10%乙醇洗脫物高劑量干預(yù)組基礎(chǔ)飼料80-1210%-High Vs D-alactose2.3.6 給藥方法及時(shí)間根據(jù)每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的平均體重，將制備的受試樣品分別按設(shè)計(jì)劑量，每日定時(shí)經(jīng)口灌胃，除陰性對(duì)照組和模型組

29、每天灌胃等體積的蒸餾水外，其他各組將不同濃度的普洱茶黃酮提取物溶于水中，按照每100g 體重大鼠，灌喂1.0ml 的比例進(jìn)行灌胃，連續(xù)灌喂28 天，結(jié)束后即犧牲大鼠。2.3.7 生長指標(biāo)檢測(cè)8實(shí)驗(yàn)周期28/天，每日觀察大鼠活動(dòng)情況及皮毛狀況，每周稱量體重根據(jù)體重每周調(diào)整灌胃劑量，并記錄攝食量。2.3.8 普洱茶對(duì)過氧化實(shí)驗(yàn)大鼠心、肝、腎和腦組織中GSH-Px 活性影響的檢測(cè)喂養(yǎng) 28 天后， 12h 禁食不禁水，犧牲大鼠，摘取心臟、肝臟腎臟和腦組織，并制備10%組織勻漿，步驟如下：（1）取各組織 1g，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙吸干后放于小燒杯中。用移液管取預(yù)冷的勻漿介質(zhì)（0.86

30、%的生理鹽水） 6ml 于燒杯中，用剪刀將組織剪碎，并將小燒杯置于冰面上操作。（2）將剪碎的組織倒入研缽中，用移液管吸取3ml 生理鹽水沖洗殘留在燒杯上的組織，一起倒入玻璃勻漿器中，左手持勻漿管將下端插入冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)十次（6-8min），充分研碎，使組織勻漿化。（3）將制備好的 10%的勻漿分裝于兩個(gè)10ml 的離心管中，2500r/min 離心 15 分鐘，離心好以后取上清液分裝于1.5ml 的離心管中，并放于 -20 條件下儲(chǔ)存待測(cè)。 用于測(cè)定其GSH-Px 活性，測(cè)定方法均按照說明書進(jìn)行操作。2.4 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)顯示為均值標(biāo)準(zhǔn)差 （MeanS.

31、D.），不同組別的比較采用one way ANOVA withT-test 統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn) ,統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)采用Microsoft excel 軟件完成。3 結(jié)果與分析3.1 普洱茶黃酮類提取物對(duì)D-galactose誘導(dǎo)氧化應(yīng)激大鼠心肌中谷胱甘肽超氧化物歧化酶（GSH-Px）活性的影響9圖1.普洱茶提取物對(duì)D-galactoseGSH-Px 活性影響誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型大鼠心肌組織注：圖柱代表均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差，下表均同。圖 1 顯示，與正常對(duì)照組 ( Vehicle group) 相比，D-galactose誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型組大鼠心肌 GSH-Px 活性顯著降低（ P 0.001）。藥物對(duì)照組（ Vitami

32、n E ）與模型組比較，心肌 GSH-Px 活性顯著升高（ P 0.001）。與模型組比較， 50%乙醇洗脫物的中劑量（ Medium dose， 40mg/kg/day ) 和高劑量組（ High dose， 80mg/kg/day）大鼠心肌中GSH-Px 的活性均顯著增加 （ P 0.05-0.001）；30%和 10%乙醇洗脫物的高劑量組 （Highdose，80mg/kg/day）心肌中 GSH-Px 的活性均顯著增加（ P0.01），并具有劑量 - 效應(yīng)關(guān)系。3.2 普洱茶黃酮類提取物對(duì)D-galactose誘導(dǎo)氧化應(yīng)激大鼠肝組織中谷胱甘肽超氧化物歧化酶（GSH-Px）活性的影響10

33、圖 2. 普洱茶黃酮類提取物對(duì)D-galactose 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型大鼠肝肌組織GSH-Px活性的 影響圖 2 顯示，與正常對(duì)照組 ( Vehicle group)相比， D-galactose誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型組大鼠肝組織 GSH-Px 活性顯著降低（ P 0.001 ) 。藥物對(duì)照組（ Vitamin E ）與模型組比較，肝組織 GSH-Px 活性顯著升高（ P0.001 ) 。與模型組比較， 50%和乙醇洗脫物中劑量（ Medium dose， 40mg/kg/day ) 和高劑量（ High dose， 80mg/kg/day）大鼠肝組織的GSH-Px 活性顯著增加（ P0.01-0.

34、001）；30%乙醇洗脫物各劑量組大鼠肝組織的GSH-Px活性均顯著增加（ P0.001），并具有劑量 - 效應(yīng)關(guān)系。3.3 普洱茶黃酮類提取物對(duì)D-galactose誘導(dǎo)氧化應(yīng)激大鼠腦組織中谷胱甘肽超氧化物歧化酶（ GSH-Px）活性的影響11圖 3. 普洱茶提取物對(duì)D-galactose 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型大鼠腦組織GSH-Px 活性影響圖 3 顯示，與正常對(duì)照組 ( Vehicle group) 相比， D-galactose誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型組大鼠腦組織 GSH-Px 活性顯著降低 （ P 0.001）。藥物對(duì)照組（ Vitamin E ）與模型組比較，腦 GSH-Px 活性顯著升高（ P

35、0.001）。與模型組比較， 50%， 30%和 10%乙醇洗脫物高劑量（High dose，80mg/kg/day）大鼠腦組織的 GSH-Px 活性均顯著增加 （P0.001），并具有劑量 - 效應(yīng)關(guān)系。3.4 普洱茶黃酮類提取物對(duì)D-galactose誘導(dǎo)氧化應(yīng)激大鼠腎組織中谷胱甘肽超氧化物歧化酶（ GSH-Px）活性的影響圖 4. 普洱茶提取物對(duì)D-galactose 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型大鼠腎組織GSH-PX 活性影響12圖 4 顯示，與正常對(duì)照組 ( Vehicle group) 相比，D-galactose誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型組大鼠腎組織 GSH-PX 活性顯著降低（ P0.001）。藥物

36、對(duì)照組（ Vitamin E ）與模型組比較，腎 GSH-PX活性顯著升高 （P0.001）。與模型組比較， 50%乙醇洗脫物中劑量 （Medium dose，40mg/kg/day ) 和高劑量（ High dose，80mg/kg/day）大鼠腎組織的 GSH-Px 活性顯著增加（ P 0.001）；30%乙醇洗脫物高劑量（ High dose，80mg/kg/day）普大鼠腎組織的 GSH-PX活性顯著增加（ P 0.001）； 10%乙醇洗脫物中劑量（ Medium dose，40mg/kg/day )和高劑量（ High dose，80mg/kg/day）大鼠腎組織的 GSH-PX

37、活性顯著增加（ P0.05-0.01），并具有劑量 - 效應(yīng)關(guān)系。4.討論衰老是人類生命過程中無法避免的自然規(guī)律，自由基學(xué)說是近年來對(duì)衰老機(jī)制研15究中極為活躍的領(lǐng)域，該理論由Harman D 提出 , 已得到醫(yī)學(xué)界的普遍認(rèn)同。機(jī)體的主要器官（心、肝、腦和腎）組織出現(xiàn)衰老現(xiàn)都會(huì)伴隨有自由基含量的增加。GSH-Px可以抑制和阻斷自由基反應(yīng)，降低自由基產(chǎn)物丙二醛（ MDA ）的生成。 SOD則能與 GSH-Px產(chǎn)生協(xié)同作用，促使自由基迅速清除。因此，體內(nèi)GSH-Px、SOD的活性反應(yīng)了機(jī)體清除自由基的能力，是評(píng)價(jià)抗衰老藥物的重要指標(biāo)之一。而MDA是動(dòng)物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，其含量能客觀反應(yīng)機(jī)

38、體組織細(xì)胞的過氧化程度和自由基的產(chǎn)生情況。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，灌胃普洱黃酮類物質(zhì)50%、30%、 10%的乙醇洗脫物的高劑量組和中劑量組，動(dòng)物主要器官（心、肝、腦和腎）組織中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性均顯著增加（ P0.01 ）；低劑量組谷胱甘肽過氧化物酶（ GSH-Px）的活性增加不顯著。普洱茶黃酮類物質(zhì)的乙醇洗脫物的濃度越高， GSH-Px的活性越強(qiáng)。說明不同濃度的乙醇洗脫所得到的普洱茶黃酮類物質(zhì)均具有抗氧化作用，并具有良好的劑量- 效應(yīng)關(guān)系，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。5結(jié)論普洱茶黃酮類提取物 50%，30%和 10%的乙醇洗脫物均具有增加 D-galactose誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型大鼠主要臟器（心，肝、腦與腎）組織中 GSH-Px 活性的作用，并具有劑量- 效應(yīng)關(guān)系，且三種物質(zhì)的作用相當(dāng)，揭示普洱茶黃酮類物質(zhì)具有良好的抗氧化作用。參考文獻(xiàn)131方祥 , 李斌 , 陳棟 , 等 . 普洱茶功效成分及其品質(zhì)形成機(jī)理研究進(jìn)展J. 食品工業(yè)科技 , 2008,29(6): 313-316.2楊崇仁 , 陳可可 , 張穎君 . 茶葉的分類與普洱茶的定義 . 茶葉科學(xué)技術(shù) ,2006(2):37-38.3呂海鵬 .