等電聚焦電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)

1、. 實(shí)驗(yàn)三 等電聚焦電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解等電聚焦的原理。通過(guò)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定，掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直管式等電聚焦電泳技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理 等電聚焦（isoelectric focusing，簡(jiǎn)稱ief）是六十年代中期出現(xiàn)的新技術(shù)。近年來(lái)等電聚焦技術(shù)有了新的進(jìn)展，已迅速發(fā)展成為一門成熟的近代生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)。目前等電聚焦技術(shù)已可以分辨等電點(diǎn)（pi）只差0.001ph單位的生物分子。由于其分辨力高，重復(fù)性好，樣品容量大，操作簡(jiǎn)便迅速，在生物化學(xué)、分子生物學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)研究中得到廣泛的應(yīng)用。 蛋白質(zhì)分子是典型的兩性電解質(zhì)分子。它在大于其等電點(diǎn)的ph環(huán)境中解離成帶負(fù)電荷的陰離子，向電場(chǎng)

2、的正極泳動(dòng)，在小于其等電點(diǎn)的ph環(huán)境中解離成帶正由荷的陽(yáng)離子，向電場(chǎng)的負(fù)極泳動(dòng)。這種泳動(dòng)只有在等于其等電點(diǎn)的ph環(huán)境中，即蛋白質(zhì)所帶的凈電荷為零時(shí)才能停止。如果在一個(gè)有ph梯度的環(huán)境中，對(duì)各種不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)混合樣品進(jìn)行電泳，則在電場(chǎng)作用下，不管這些蛋白質(zhì)分子的原始分布如何，各種蛋白質(zhì)分子將按照它們各自的等電點(diǎn)大小在ph梯度中相對(duì)應(yīng)的位置處進(jìn)行聚焦，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的電泳以后，不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)分子便分別聚焦于不同的位置 。這種按等電點(diǎn)的大小，生物分子在ph梯度的某一相應(yīng)位置上進(jìn)行聚焦的行為就稱為“等電聚焦”。等電聚焦的特點(diǎn)就在于它利用了一種稱為兩性電解質(zhì)載體的物質(zhì)在電場(chǎng)中構(gòu)成連續(xù)的ph梯度，使

3、蛋白質(zhì)或其他具有兩性電解質(zhì)性質(zhì)的樣品進(jìn)行聚焦，從而達(dá)到分離、測(cè)定和鑒定的目的。 兩性電解質(zhì)載體，實(shí)際上是許多異構(gòu)和同系物的混合物，它們是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在3001000之間。常用的進(jìn)口兩性電解質(zhì)為瑞典pharmacia-lkb公司生產(chǎn)的ampholine 和pharmalyte，價(jià)格昂貴。國(guó)產(chǎn)的有中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所和上海生化所生產(chǎn)的兩性電解質(zhì)，價(jià)格便宜，質(zhì)量尚佳。兩性電解質(zhì)在直流電場(chǎng)的作用下，能形成一個(gè)從正極到負(fù)極的ph值逐漸升高的平滑連續(xù)的ph梯度。若不同的ph值的兩性電解質(zhì)的含量與pi值的分布越均勻，則ph梯度的線性就越好。對(duì)ampholine兩性電解質(zhì)

4、的要求是緩沖能力強(qiáng)，有良好的導(dǎo)電性，分子量要小，不干擾被分析的樣品等。 在聚焦過(guò)程中和聚焦結(jié)束取消了外加電場(chǎng)后，如保持ph梯度的穩(wěn)定是極為重要的。為了防止擴(kuò)散，穩(wěn)定ph梯度，就必須加入一種抗對(duì)流和擴(kuò)散的支持介質(zhì)，最常用的這種支持介質(zhì)就是聚丙烯酰胺凝膠。當(dāng)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳時(shí)，凝膠柱內(nèi)即產(chǎn)生ph梯度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品電泳到凝膠柱內(nèi)某一部位，而此部位的ph值正好等于該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，該蛋白質(zhì)即聚焦形成一條區(qū)帶，只要測(cè)出此區(qū)帶所處部位的ph值，即為其等電點(diǎn)。電泳時(shí)間越長(zhǎng)，蛋白質(zhì)聚焦的區(qū)帶就越集中，越狹窄，因而提高了分辨率。這是等電聚焦的一大優(yōu)點(diǎn)，不像一般的其他電泳，電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則區(qū)帶擴(kuò)散。

5、所以等電聚焦電泳法不僅可以測(cè)定等電點(diǎn)，而且能將不同等電點(diǎn)的混合的生物大分子進(jìn)行分離和鑒定。精品. 早期的等電聚焦電泳是垂直管式的，其特點(diǎn)是體系是封閉的，不與空氣接觸，可防止樣品氧化。近年來(lái)，又發(fā)展了超薄層水平板式等電聚焦電泳。此法的優(yōu)點(diǎn)是加樣數(shù)量多，節(jié)省兩性電解質(zhì)，電泳后固定、染色、干燥都十分迅速簡(jiǎn)便，其最大優(yōu)點(diǎn)是防止了電極液的電滲作用而引起正負(fù)兩極ph梯度的漂變。 測(cè)定ph梯度的方法有四種： 1. 將膠條切成小塊，用水浸泡后，用精密ph試紙或進(jìn)口的細(xì)長(zhǎng)ph復(fù)合電極測(cè)定ph值，然后作圖。 2. 用表面ph微電極直接測(cè)定膠條各部分的ph值，然后作圖。3. 用一套已知不同的pi值的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，

6、測(cè)定ph梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。4. 將膠條于70冰凍后切成1mm的薄片，加入0.5ml 0.01m kcl，用微電極測(cè)其ph。三、儀器和用具 1. 電泳儀 2. 垂直管式園盤電泳槽一套 3. 注射器與針頭 4. 移液管：10ml、5ml、2ml、1ml、0.1ml 5. 小燒杯若干 6. 培養(yǎng)皿一套 7. 直尺 8. 小刀 9. 精密ph試紙和帶細(xì)長(zhǎng)復(fù)合ph電極的ph計(jì) 10. 塑料薄膜和橡皮筋四、試劑 1. 丙烯酰胺 2. 甲叉雙丙烯酰胺 3. 兩性電解質(zhì)ampholine（40%，ph3.59.5） 4. 過(guò)硫酸胺（催化劑） 5. temed（四甲基乙二胺）（加速劑） 6. 磷酸 7. naoh

7、 8. 三氯乙酸（tca）五、溶液配制 1. 丙烯酰胺貯液（30%丙烯酰胺，交聯(lián)度2.6%）：，30g丙烯酰胺和0.8g甲叉雙丙烯酰胺溶于h2o，定容至100ml，濾去不溶物后存于棕色瓶，4可保存數(shù)月。（全班公用）（另一配方為29.1g 丙烯酰胺和0.9g 甲叉雙丙烯酰胺溶于h2o，定容至100ml，交聯(lián)度為3.0%）。 2. 兩性電解質(zhì)amphline（40%）的加入量為：50ml /ml 膠液。 3. 過(guò)硫酸胺：配成1mg/ml的濃度，當(dāng)天配制，配100ml全班公用。膠液中的加入量為精品.0.5mg/ml膠液。 4. temed：膠液中的加入量為1ml/ml膠液。 5. 蛋白質(zhì)樣品：選用兩

8、種等電點(diǎn)相差較大的蛋白質(zhì)，每根垂直管中每種蛋白質(zhì)的加樣量控制在100mg。蛋白質(zhì)樣品配制成各為5mg/ml的濃度。配2.5ml全班公用。 6. 固定液：10%的三氯乙酸，每組配50ml。7. 陽(yáng)極電極液：0.1m h3po4 3.4ml 濃磷酸（85%）加h2o至500ml，每個(gè)電泳槽用500ml。 8. 陰極電極液：0.5m naoh 2g naoh 加h2o溶解至500ml，每個(gè)電泳槽用500ml。六、操作步驟 1. 配膠 膠濃度 5.0% 4.8% 5.0%膠液總體積 8ml 10ml 12ml丙烯酰胺貯液 1.33ml 1.60ml 2.0mlampholine 0.40ml 0.50

9、ml 0.60mltemed 0.008ml 0.010ml 0.012ml蛋白質(zhì)樣品 0.080ml 0.100ml 0.120mlh2o 2.26ml 2.79ml 3.27ml過(guò)硫酸銨(1mg/ml) 4.0ml 5.0ml 6.0ml 裝管數(shù) 4支 5支 6支 過(guò)硫酸銨是膠聚合的催化劑，因此最后加入，加畢，立即搖勻，因膠很快就會(huì)聚合，必須立即裝管。通?；瘜W(xué)聚合的膠液，需在過(guò)硫酸銨加入前進(jìn)行減壓抽氣處理，本實(shí)驗(yàn)將此抽氣步驟省略并不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 2. 裝管 每個(gè)學(xué)生裝兩支管，每組裝四支。先用肥皂洗手，然后將圓盤電泳槽的玻璃管洗凈，底端用塑料薄膜和橡皮筋封口，垂直放在試管架上，用移液管將配

10、好的膠液移入管內(nèi)，（每根玻璃管的容量約為1.51.8ml）,液面加至距管口1mm處，用注射器輕輕加入少許h2o，進(jìn)行水封，以消除彎月面使膠柱頂端平坦。膠管垂直聚合約30分鐘，聚合完成時(shí)可觀察到水封下的折光面。精品.3. 裝槽和電泳用濾紙條吸去膠管上端的水封，除去下端的薄膜，水封端向上，將膠管垂直插入圓盤電泳槽內(nèi)，調(diào)節(jié)好各管的高度，記下管號(hào)。每支管約1/3在上槽，2/3在下槽。上槽加入500ml 0.1m h3po4，下槽加入500ml 0.1m naoh，淹沒(méi)各管口和電極，用注射器或滴管吸去管口的氣泡。上槽接正極，下槽接負(fù)極，開(kāi)啟電泳儀，恒壓160v，聚焦2至3小時(shí)，至電流近于零不再降低時(shí)，停

11、止電泳。4. 剝膠 取下膠管，用h2o 將膠管和兩端洗2次，用注射器沿管壁輕輕插入針頭，在轉(zhuǎn)動(dòng)膠管和內(nèi)插針頭的同時(shí)分別向膠管兩端注入h2o少許，膠條即自行滑出，若不滑出可用洗耳球輕輕擠出。膠條置于小培養(yǎng)皿內(nèi)，記住正極端為“頭”，負(fù)極端為“尾”，若分不清時(shí)，可用ph試紙鑒定，酸性端為正，堿性端為負(fù)。 5. 固定取2支膠條置于一個(gè)小培養(yǎng)皿內(nèi)，倒入10%三氯乙酸溶液至沒(méi)過(guò)膠條，進(jìn)行固定，約半小時(shí)后，即可看到膠條內(nèi)蛋白質(zhì)的白色沉淀帶。固定完畢，倒出固定液，用直尺量出膠條長(zhǎng)度“l(fā)2”和正極端到蛋白質(zhì)白色沉淀帶中心（即聚焦部位）的長(zhǎng)度“l(fā)”。固定后的膠條可在康強(qiáng)860紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)上用280nm或238nm波長(zhǎng)作凝膠掃描，然后用掃描圖作相應(yīng)的測(cè)量和計(jì)算。6. 測(cè)定ph梯度 將放在另一個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)未固定的膠條，用直尺量出待測(cè)ph膠條的長(zhǎng)度“l(fā)1”。按照由正極至負(fù)極的順序，用鑷子和小刀依次將膠條切成10mm長(zhǎng)的小段，分別置于小試管中，加入1ml h2o，浸泡半小時(shí)以上或過(guò)夜，用仔細(xì)校正后的帶細(xì)長(zhǎng)ph復(fù)合電極的ph計(jì)測(cè)出每管浸出液的ph值。七、數(shù)據(jù)處理 1. 以膠條長(zhǎng)度（mm）為橫座標(biāo)，ph值為縱座標(biāo)作圖，得到一條ph梯度曲線。所測(cè)每管的ph值為10mm膠條的ph的混合平均值。作圖時(shí)