層析和膜技術(shù)在生物制藥中的應(yīng)用演示課件

1、1,層析技術(shù)在 生物制藥中的應(yīng)用,2,一. 離子交換層析技術(shù),定義：利用溶液中各種帶電顆粒與離子交換劑之間結(jié)合力的差異進(jìn)行物質(zhì)分離的操作稱離子交換法。 離子交換劑由惰性的不溶性載體，功能基團(tuán)和平衡離子組成。 平衡離子帶正電荷的為陽離子交換劑，平衡離子帶負(fù)電荷的為陰離子交換劑，可見離子交換劑是一類具有活性基團(tuán)的荷電固相顆粒。,3,離子交換層析技術(shù),離子交換反應(yīng)：,離子交換劑與交換離子間的作用是由靜電引力而產(chǎn)生的，是一個(gè)可逆的反應(yīng)過程，當(dāng)這個(gè)反應(yīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，其平衡點(diǎn)隨著pH、溫度、溶劑的組成及交換劑本身性質(zhì)的改變而變化。例如，向平衡體系中加入過量的X+離子，反應(yīng)傾向于生成R-SO3-X+。,4

2、,離子交換層析技術(shù),由于待分離的溶質(zhì)分子帶有不同性質(zhì)的電荷和不同電荷量，因而在作為固定相的離子交換劑和流動(dòng)相的洗脫液之間發(fā)生可逆交換作用，并通過調(diào)節(jié)pH值、或改變同性離子的濃度等方法，使溶質(zhì)分子移動(dòng)的速度發(fā)生變化，從而達(dá)到分離的目的。,5,離子交換層析的應(yīng)用,如慶大霉素，小諾霉素的提煉，應(yīng)用了離子交換技術(shù)。,6,慶大霉素的提煉,酸化的目的在于將慶大霉素從菌絲體中釋放出來，然后為了便于離子交換，將酸化液中和，再于中性溶液中投入732強(qiáng)酸性陽離子樹脂。因?yàn)閼c大霉素屬于堿性抗生素，系有機(jī)堿，能與多種酸成鹽，在水溶液中以離子狀態(tài)G+存在，可以為陽離子樹脂所吸附，對(duì)吸附了慶大霉素的732樹脂進(jìn)行洗滌，先

3、用稀酸洗至無Ca2+、Mg2+，接著用無鹽水洗至無Cl-，然后用稀氨洗去小組分雜質(zhì)，最后用濃氨進(jìn)行洗脫，洗脫液（解吸液）用711陰離子樹脂進(jìn)行脫色，然后經(jīng)濃縮，轉(zhuǎn)鹽、活性炭脫色，噴霧干燥即得慶大霉素成品。,7,8,離子交換層析的應(yīng)用,粗卵蛋白的分級(jí)分離 卵蛋白中：主要有卵清蛋白54-57%（pI4.5)；藍(lán)清蛋白12-15%（pI6.1)；卵粘蛋白3-4%(pI4.7)。 卵白過濾，用polybuffer74稀釋，離心，上PBE94柱，以0.025mol/L咪唑-HCl (pH7.2)平衡，用1:10polybuffer74洗脫，分辨率良好。,9,二. 凝膠層析,凝膠層析，是指樣品混合物通過一

4、定孔經(jīng)的凝膠固定相，由于流經(jīng)體積的差異，使不同分子量的組分得以分離的一種分離技術(shù)。 因整個(gè)層析過程與過濾相似也稱凝膠過濾。 又由于物質(zhì)在分離過程中的阻滯減速現(xiàn)象，也稱排阻層析?；蚍Q凝膠擴(kuò)散層析。 凝膠的每個(gè)顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)如同一個(gè)篩子，小的分子可以進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔，大的分子被排阻于凝膠顆粒之外，因而也稱分子篩層析。,10,凝膠層析分離原理,分子篩理論最容易理解，當(dāng)含有大小分子的混合物品流給凝膠層析柱時(shí)，各組分隨洗脫液的流動(dòng)而移動(dòng). 大分子進(jìn)入不了顆粒內(nèi)部，最先流出；中分子部分地進(jìn)入顆粒，流出速度中等；小分子進(jìn)入所有顆粒內(nèi)部，移動(dòng)速度慢，最后流出。整個(gè)樣品接分子量大小順序先后流出層析柱，從而達(dá)到分離。

5、,11,凝膠層析分離原理,12,凝膠層析分離原理,當(dāng)將含有三種不同分子量物質(zhì)的混合樣品用某種規(guī)格的凝膠柱進(jìn)行分離，然后以洗脫體積為橫坐標(biāo)，各物質(zhì)濃度為縱座標(biāo)，即得下圖的洗脫曲線。,13,凝膠層析的應(yīng)用,凝膠層析目的（或稱分離形式）一般有二種：分組分離和分級(jí)分離。 分組分離亦稱類分離，其目的是將分子量極為懸殊的兩類物質(zhì)分開，如蛋白質(zhì)與鹽的分離,常用Sephadex G-25，因?yàn)槠浞蛛x范圍是1,000-5,000，被分離的兩組物質(zhì)的分子量正好落在分離范圍的兩側(cè)，大分子組為全排阻，而小分子組為全滲入，其Kd值的差可達(dá)最大值1。,14,凝膠層析的應(yīng)用,分級(jí)分離，將分子量相差不很大的大分子物質(zhì)加以分離

6、，如分離血清球蛋白與白蛋白。 對(duì)于這種分子量相近的物質(zhì)的分離常常選用排阻限略大于樣品中最高分子量的凝膠，即OKd1。 如果樣品中含有3個(gè)組分的話，最好一個(gè)接近全排阻，另一個(gè)接近全滲入，第三個(gè)為部分滲入，且分子量大于滲入限的3倍，并小于排阻限的1/3。,15,凝膠層析的應(yīng)用,脫鹽 濃縮 去熱原 分子量測(cè)定 純化,16,凝膠層析的應(yīng)用:脫鹽和濃縮,脫鹽和濃縮屬類分離，選擇凝膠使大分子組為全排阻，小分子組為全滲入（Kd=1）。 脫鹽用的凝膠多用大粒度的、高交聯(lián)度的凝膠。 交聯(lián)度大，凝膠顆粒的強(qiáng)度較好； 粒度大，柱層操作比較便利，流速也高。 洗脫多為易揮發(fā)鹽的緩沖溶液； 用水洗脫時(shí)，有些蛋白質(zhì)脫鹽后溶

7、解度下降，造成被凝膠粒吸附甚至以沉淀狀態(tài)析出。 樣品體積最好不大于內(nèi)水體積的三分之一，以便得到理想的脫鹽效果。,17,凝膠層析的應(yīng)用:脫鹽和濃縮方法：,柱層析 包埋法 樣品置于透析袋中埋入干膠顆粒堆內(nèi)，經(jīng)過相當(dāng)時(shí)間后，樣品中的鹽與水分一道為干膠所吸收。 直接投入法 即將一定量的干膠投入盛樣品容器或直接使樣品溶液從干膠柱上流下。,18,凝膠層析的應(yīng)用:分離純化,用SephadexG-50純化牛、豬胰島素:,19,用SephadexG-25分離氨基酸混合物,20,用SephadexG-25分離氨基酸混合物,用葡聚糖凝膠分離多組分混合物，除利用分子篩效應(yīng)外，還可利用某些物質(zhì)與凝膠具有程度不等的弱吸附

8、作用。如圖7.31，用SephadexG-25分離氨基酸混合物，各個(gè)氨基酸流出的先后順序并不是按分子量大小的順序，而是按照吸附作用強(qiáng)弱的順序，其中二個(gè)酸性氨基酸，谷氨酸（pI3.22），甘氨酸（pI5.97）先被流出，而pI分別為5.48和5.66的苯丙氨酸，酪氨酸，由于是苯環(huán)化合物，存在弱吸附故后被流出，而色氨酸是雜環(huán)合物，堿性氨基酸，吸附最強(qiáng)，所以最后流出.,21,凝膠層析的應(yīng)用,分子量測(cè)定 測(cè)定依據(jù)：不同分子量的物質(zhì)，只要在凝膠的分離范圍內(nèi)（滲入限與排阻限之間），其洗脫體積Ve及分配系數(shù)Kd值隨分子量增加而下降。 待測(cè)物質(zhì)洗脫體積與分子量關(guān)系符合下式： Ve=-KlogM+C K、C 是

9、常數(shù)，為直線方程的斜率和外推截距。 同時(shí) Kav=-KlogM +C,22,凝膠層析的應(yīng)用,測(cè)定分子量方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法。 先以3個(gè)以上的已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白（有標(biāo)準(zhǔn)蛋白商品出售）過柱，測(cè)取各目Ve值，以Ve做縱坐標(biāo)，logM 做橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，之后在同一測(cè)定系統(tǒng)測(cè)取未知物質(zhì)的Ve值，即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得分子量。 注意：測(cè)得的分子量是近似分子量，誤差在10%。 該法操作簡(jiǎn)便，需要樣品量較少，實(shí)用價(jià)值較大。,23,凝膠層析的應(yīng)用:分子量測(cè)定,24,三. 親和層析,人們發(fā)現(xiàn)生物體中許多高分子化合物具有和某些相對(duì)應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特性， 例如 酶與底物、抗原與抗體、激素與受體、核糖核酸與其互補(bǔ)的

10、脫氧核糖核酸，多糖與蛋白復(fù)合體等，都具有這種特性。 生物分子間的這種結(jié)合能力稱為親和力，根據(jù)生物分子特異親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù)稱為親和層析，在親和層析中起可逆結(jié)合的特異性物質(zhì)稱為配基，與配基結(jié)合的層析介質(zhì)稱為載體。,25,親和層析的設(shè)計(jì)原理和過程:,26,3.親和層析的應(yīng)用,由于親和層析技術(shù)具有簡(jiǎn)便，快速、專一和高效等特點(diǎn)，應(yīng)用十分廣泛，已普及到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。 應(yīng)用范圍如下： （1）提取、分離純化、濃縮各類生物分子； （2）分離純化各種功能細(xì)胞，細(xì)胞器，膜片段和病毒顆粒； （3）用于各種生化成分的分析檢測(cè)； （4）其他；,27,3.親和層析的應(yīng)用,最大優(yōu)點(diǎn)：利用它從粗提液中經(jīng)過一次簡(jiǎn)單的

11、處理便可得到所需的高純度活性物質(zhì)。 例如分離胰島素受體時(shí)，把胰島素作為配基，偶聯(lián)于瓊脂載體上，經(jīng)親和層析，從肝臟勻漿中提取胰島素受體，純化達(dá)8000倍。,28,金屬螯合親和層析,原理：蛋白質(zhì)分子能夠與金屬離子發(fā)生親和反應(yīng)，并與之結(jié)合，可用于吸附純化蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)表面的氨基酸殘基，如組氨酸的咪唑基團(tuán)、半胱氨酸的巰基、色氨酸的吲哚基團(tuán)，可提供電子，與金屬離子結(jié)合，從而發(fā)生親和層析。配基與生物大分子的結(jié)合機(jī)理包括范德華力、疏水鍵、靜電以及金屬螯合作用。,29,金屬螯合親和層析柱的制備：,將環(huán)氧活化型Sepharose 6B與金屬螯合劑（如亞氨二醋酸）偶聯(lián)成配基，再用金屬離子溶液處理（如Zn2+、Cu

12、2+、Co2+、Ni2+、Cd2+），即成。,30,金屬螯合親和層析,上樣：柱子經(jīng)平衡后，可將含有生物活性物質(zhì)的樣品上柱，與固定化的金屬配基復(fù)合物有親和力的分子都將被滯留，其余則流出柱外。 洗脫：可通過改變鹽的濃度、改變pH、或由競(jìng)爭(zhēng)性的試劑將蛋白質(zhì)置換下來，這些方式的機(jī)理都是通過降低固定化金屬離子和蛋白質(zhì)之間的親和常數(shù)。,31,金屬螯合親和層析的應(yīng)用: 利用含汞樹脂分離谷胱甘肽,谷胱甘肽中的半胱氨酸含有巰基，巰基化合物與汞具有很強(qiáng)的化學(xué)親和作用，因此用含汞樹脂提取含巰基化合物能取得很好的效果。 谷胱甘肽多從酵母中提取，也可從啤酒生產(chǎn)的廢酵母中提取。酵母的提取液中除了含谷胱甘肽外，還含有其他含

13、巰基的氨基酸和短肽，含汞樹脂對(duì)這些物質(zhì)也有一定的吸附。可通過調(diào)節(jié)酵母提取液的pH值，改變樹脂對(duì)各種雜質(zhì)成分的吸附力，以達(dá)到分離的目的。,32,有機(jī)染料親和層析,基本原理：一些有機(jī)染料如蒽醌化合物和偶氮化合物具有類似于NAD+的結(jié)構(gòu)，因此一些需要核苷酸類物質(zhì)為輔酶的酶，對(duì)這些染料有一定的親和力，如果這些染料作為配基共價(jià)偶聯(lián)到纖維素或瓊脂糖等多糖載體上，就能制得染料親和層析柱。常用的有機(jī)染料有二羥偶氮復(fù)合物。 有機(jī)染料親和層析已成功地分離純化了多種酶，以及應(yīng)用于白蛋白、脂蛋白和干擾素等的分離。,33,有機(jī)染料親和層析應(yīng)用： 苯丙氨酸脫氫酶的純化,苯丙氨酸脫氫酶的純化應(yīng)用了有機(jī)染料親和層析法。將一種

14、模擬生物的染料配基（商品名：Procion Red HE-3B）,結(jié)合在Sepharose CL-4B上。Procion Red HE-3B與依靠NAD/NADH作輔酶的酶有特異性的結(jié)合，因而在分離這種類型的酶時(shí)，應(yīng)用很廣。,34,有機(jī)染料親和層析應(yīng)用： 苯丙氨酸脫氫酶的純化,將含有苯丙氨酸脫氫酶的酶提取液上柱，親和柱專一性地吸附苯丙氨酸脫氫酶。然后，用平衡緩沖液洗去雜蛋白，再用1mmol/L的 NADH（配于平衡緩沖液中）將酶洗脫下來。經(jīng)過這種方法純化的酶，純度達(dá)到單一區(qū)帶，達(dá)到了診斷用酶制劑的純度要求。 苯丙氨酸脫氫酶可作為診斷試劑，用于測(cè)定和監(jiān)測(cè)遺傳性代謝疾病苯丙酮酸尿。作為診斷用酶制劑

15、的市場(chǎng)很大。,35,四.膜分離技術(shù),膜分離的概念：利用膜的選擇性（孔徑大?。?，以膜的兩側(cè)存在的能量差作為推動(dòng)力，由于溶液中各組分透過膜的遷移率不同而實(shí)現(xiàn)分離的一種技術(shù)。,36,透析技術(shù),透析是應(yīng)用得最早的膜分離技術(shù)。 透析法的特點(diǎn), 是用于分離兩類分子量差別較大的物質(zhì)。即將分子量103級(jí)以上的大分子物質(zhì)與分子量在103級(jí)以下的小分子物質(zhì)分離，屬于分子水平的分離，無相的改變。透析法都是在常壓下依靠小分子物質(zhì)的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)來達(dá)到分離濃縮目的。此點(diǎn)不同于超濾。,37,透析技術(shù),優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便，不需要復(fù)雜裝置。 缺點(diǎn)：速度慢、處理量小。 用途： （1）透析法多用于去除大分子溶液中的小分子物質(zhì)，稱為脫鹽； （2

16、）常用來對(duì)溶液中小分子成分進(jìn)行緩慢的改變。即所謂的透析平衡，如濃縮大分子、透析結(jié)晶等。,38,旋轉(zhuǎn)透析裝置,39,連續(xù)透析器,40,平面透析器 用塑料框把透析管張開成為很薄的平面透析管，使透析面積增大，提高了效率。 淺流透析器 可兼用于透析和超濾。,41,超濾技術(shù),超濾技術(shù)是近幾十年迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)分子級(jí)薄膜分離手段，它以特殊的超濾膜為分離介質(zhì)，以膜兩側(cè)的壓力差為推動(dòng)力將不同分子量的物質(zhì)進(jìn)行選擇性分離。 超濾膜的最小截留分子量為500道爾頓，在生物制藥中可用來分離蛋白質(zhì)、酶、核酸、多糖、多肽、抗生素、病毒等。,42,超濾技術(shù),優(yōu)點(diǎn)：沒有相轉(zhuǎn)移，無需添加任何化學(xué)物質(zhì)，可以在低溫下操作，過濾速度

17、較快，便于做無菌處理，分離操作簡(jiǎn)便，避免生物活性物質(zhì)的活力損失和變性。 用途：大分子物質(zhì)的脫鹽和濃縮； 小分子物質(zhì)的純化； 大分子物質(zhì)的分級(jí)分離； 生化制劑或其他制劑的去熱原處理。,43,超濾技術(shù)的應(yīng)用,濃縮和脫鹽 優(yōu)點(diǎn)是不消耗試劑，無相轉(zhuǎn)移，可在低溫下進(jìn)行，濃縮的同時(shí)還可脫掉鹽和其他小分子雜質(zhì)。 脫鹽方法： （1）稀釋超濾法 鹽離子等小分子雜質(zhì)隨溶劑（水）不斷透過濾膜而去，當(dāng)濃縮到一定濃度時(shí)再加入溶劑至原體積，如此反復(fù)多次，絕大部分小分子物質(zhì)可被除去。 （2）滲濾法脫鹽 原理與稀釋法相同。,44,超濾的應(yīng)用,分級(jí)分離與純化 如右圖所示，按分子量截留值由大而小串聯(lián)幾個(gè)超濾器，各自保持一定體積，

18、用10-20倍體積的緩沖液逐級(jí)洗下，不同分子量物質(zhì)相應(yīng)下移，在各濾器中獲得不同分子量范圍的組分，從而使大分子量得到分離和純化，同時(shí)也進(jìn)行了濃縮。,45,超濾的應(yīng)用,除菌 超濾是一種很好的冷滅菌法，適合于不能高壓消毒滅菌的生化產(chǎn)品； 去熱原 適合一些分子量較小的生物藥物的去熱原；,46,超濾的應(yīng)用,超濾與酶反應(yīng)器聯(lián)用 使分解產(chǎn)物生成后立即與底物分離，提高底物利用率，減少酶用量，提高酶促反應(yīng)速度。,47,微孔膜過濾,微孔膜過濾又稱“精密過濾”，是最近20多年發(fā)展起來的一種薄膜過濾技術(shù)。 主要用于分離亞微米級(jí)顆粒，是目前應(yīng)用最廣泛的一種分離分析微細(xì)顆粒和超凈除菌的手段。 優(yōu)點(diǎn)：（1）設(shè)備簡(jiǎn)單； （2）操作簡(jiǎn)便、快速； （3）分離效率高，重現(xiàn)性好； （4）一些微孔濾膜具有結(jié)合生物大分子的特殊能力。,48,微孔濾膜過濾的應(yīng)用,藥液中微粒及細(xì)菌的濾除 靜脈注射若受微粒及細(xì)菌的污染，對(duì)人體危害性很大。 微孔濾膜過濾在制藥工業(yè)中對(duì)于濾除藥液中微粒、微生物和