研究生基因分子生物學(xué)課程-2,2007

1、1,二 分子克隆中常用的其它酶 使用好工具酶應(yīng)注意： 1保持反應(yīng)混合液中蛋白質(zhì)的濃度不小于0.1mg/ml, 對維 持酶在反應(yīng)混合液中的穩(wěn)定性十分重要。牛血清白蛋白（ 組分V是一種很好的可加入酶反應(yīng)液中的中性蛋白質(zhì)，它 的使用終濃度應(yīng)為0.1mg/ml。 2提供合適濃度的底物，酶反應(yīng)才能有效地進(jìn)行。應(yīng)盡量 使反應(yīng)在接近Km（使酶活性達(dá)最大值的一半時的底物濃度 的條件下進(jìn)行。 3應(yīng)盡量采用最佳的反應(yīng)條件，包括特定的pH值、溫度及 離子濃度。,2,（一DNA聚合酶 最常用的依賴于DNA的DNA聚合酶有： 大腸桿菌DNA聚合酶 I（全酶 大腸桿菌DNA聚合酶 I大片段（Klenow片段 T4和T7噬

2、菌體DNA聚合酶（來源于T4和T7噬菌體感染的大腸 桿菌 經(jīng)修飾的T7噬菌體DNA聚合酶（測序酶 熱穩(wěn)定D NA 依賴性 DNA聚合酶 反轉(zhuǎn)錄酶（依賴于RNA的DNA聚合酶 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶,3,3,Substrates required for DNA synthesis,4,Diagram of the mechanism of DNA synthesis,5,Illustration of the path of the template DNA through the DNApolymerase,6,Base tautomers,7,Proofreading exonuclease

3、s removes bases from the 3 end of mismatched DNA,8,外切核酸酶的校對工作方式就像電腦鍵盤上的“delete key”, 只糾正最近的一個錯誤。這種校對功能極大地增加了DNA 合成的準(zhǔn)確性。 DNA聚合酶摻入錯誤堿基的幾率1/105 外切核酸酶的校對功能降低了摻入錯誤堿基的幾率1/107 事實上一個細(xì)胞中發(fā)生突變的幾率1/1010,9,1大腸桿菌DNA聚合酶 I（全酶： 由單一多肽鏈組成（Mr約103 000），由大腸桿菌polA基因 編碼，可通過三個明確的功能域執(zhí)行三種酶反應(yīng)。,10,具有3種活性： 5 DNA聚合酶活性 5 及 外切核酸酶活性

4、 主要用途用切口平移方法標(biāo)記DNA，在所有聚合酶中 只有大腸桿菌DNA聚合酶 I能用于此反應(yīng)，因為它具有 5外切核酸酶活性，可以在聚合酶沿DNA鏈推進(jìn)之 前，從DNA鏈上去除核苷酸。 還可用于cDNA第二鏈的置換合成及對帶有3突出尾的 DNA分子進(jìn)行末端標(biāo)記。,11,5 3 3 5 Mg2+ DNase I 5 3 5 3 5 3 3 5 3 5 dATP dCTP 大腸桿菌DNA聚合酶I dGTP (全酶 dTTP 5 3 3 5 5 3 3 5 在鎂離子存在下，用低限量的DNA酶 I處理雙鏈DNA，產(chǎn)生的切口 可作為大腸桿菌DNA聚合酶 I（全酶催化DNA合成的引物。合成 過程中，dNTP

5、不斷摻入到正在增長的DNA鏈上，同時利用全酶的 5外切核酸酶活性使切口沿5 方向平移。,12,2 大腸桿菌DNA聚合酶 I大片段（Klenow片段： 用枯草芽孢桿菌蛋白酶溫和處理后，DNA聚合酶I可被切 割成兩個片斷：較大的片斷（包含326928位殘基）稱為 Klenow片斷，執(zhí)行DNA聚合酶和3 5外切核酸酶活性。 全酶的5 3 外切核酸酶活性存在于較小的氨基端片斷 （1325位殘基）。 主要用途1補平限制酶切割DNA產(chǎn)生的3凹端，可用 32PdNTP進(jìn)行DNA片段末端標(biāo)記。 2在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二鏈。 3用于DNA測序以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。,13,示例： p Cp Cp G

6、OH 3 3 Gp Gp Cp Tp Ap Cp Gp Ap 5 Mg2+ 大腸桿菌DNA dNTP 聚合酶 I Klenow 片段 5p C p C p G pA pTp Gp CpTOH 3Gp Gp Cp Tp Ap Cp Gp Ap5,用 Klenow DNA聚合酶補平DNA片斷的3凹端,注：標(biāo)記反應(yīng)中含有三種為標(biāo)記的dNTP及一種標(biāo)記的dNTP，根據(jù) DNA末端的序列進(jìn)行選擇。,14,3 T4噬菌體DNA聚合酶： (來源于噬菌體感染的大腸桿菌） 特點是具有很強的35外切核酸酶的活性，比 Klenow片 段強200倍，對單鏈DNA的作用比對雙鏈DNA更強。 主要用途1對于帶有3突出端的

7、DNA分子進(jìn)行標(biāo)記，首 選T4噬菌體DNA聚合酶。首先利用35外 切核酸酶活性切除DNA 3突出尾，產(chǎn)生3凹 端，然后在高濃度的某一種放射性標(biāo)記的dNTP 存在下，外切降解反應(yīng)與dNTP摻入3端的反 應(yīng)達(dá)到平衡。 2將雙鏈DNA的末端轉(zhuǎn)化成平端。,15,示例 ： 5p A p C p T p G p C p AOH 3 Tp G p 5 Mg2+ -32PdCTP T4噬菌體DNA聚合酶 5p A p C 3OH 3Tp G p 5 5p A p C OH3 3Tp G p 5,外切核酸酶活性,DNA聚合酶活性,*,*,16,5 3 3 5,EcoRI,BamHI,3 5外切酶活性 32PdN

8、TP T4噬菌體DNA聚合酶 5 3 3 5 聚合反應(yīng) 5 3 3 5 限制性消化 BamHI EcoRI 5 3 3 5 通過凝膠電泳純化鏈特異性探針,EcoRI,BamHI,鏈特異性雜交探針的生成,17,4 T7噬菌體DNA聚合酶： 特點是所催化的合成的DNA平均長度要比其他DNA聚合酶 催化合成的DNA的平均長度大得多，在用于Sanger雙脫氧 鏈終止法測定DNA序列時，具有很大的優(yōu)勢。T7噬菌體 DNA聚合酶的35外切核酸酶活性也很強，約為大腸桿 菌DNA聚合酶I Klenow片段的1000倍。沒有53外切核 酸酶活性。 主要用途用于拷貝長段摸板的引物延伸反應(yīng)。,18,5 熱穩(wěn)定 DN

9、A依賴性 DNA聚合酶： 第一個被發(fā)現(xiàn)的熱穩(wěn)定DNA聚合酶是從極度嗜熱的棲熱水 生菌中純化而來的，其中最早分離出來的一個是Taq DNA 聚合酶。Taq基因編碼一個823個氨基酸的蛋白，Mr=93.3kDa,I II III A B C D E,3 5外切酶結(jié)構(gòu)域 聚合酶結(jié)構(gòu)域 5 3外切酶結(jié)構(gòu)域 DNA結(jié)合區(qū) 1 928,大腸桿菌DNA 聚合酶I Taq DNA 聚合酶,832,19,Taq和它的衍生物是耐熱的依賴于DNA的DNA聚合酶，具 有依賴于聚合作用的53外切核酸酶活性，它的3 5 外切核酸酶結(jié)構(gòu)域無催化活性，因此缺乏校正功能。其熱 穩(wěn)定性是由該酶核心區(qū)的高度疏水性、靜電作用力的穩(wěn)定

10、 性、與溶劑分子的相互作用以及酶分子表面的脯氨酸引起 的。最佳作用溫度為 7580，于60時聚合酶活性僅剩 1/2, 于37時活性僅剩1/10 主要用途可用于對DNA進(jìn)行測序，及通過聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)對DNA分子的特定序列進(jìn)行體外擴增,20,熱穩(wěn)定DNA聚合酶的特點 酶 廠家 最佳溫度 外切核酸 錯誤率 穩(wěn)定性（在特定 酶活性 10-6 溫度的時間 Taq BM,Pro 7580 53 20100 97.5時9min Strat,P-E rTth BM,P-E 7580 53 -20 95時20min Tfl Pro 70 無 100 70時120min Deep Vent NEB 7080 3

11、5 2045 100時480min Pfu Strat 7278 35 1.6 95時240min,21,6 反轉(zhuǎn)錄酶（依賴于RNA的DNA聚合酶） 兩種反轉(zhuǎn)錄酶：來自純化的禽源成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）； 能表達(dá)克隆化的Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV)反轉(zhuǎn)錄酶 基因的大腸桿菌中分離得到的。 AMV Mo-MLV 結(jié)構(gòu) 兩條多肽鏈 Mr 84kDa的單鏈多肽 RNaseH 活性很強 較弱 反應(yīng)溫度 42 42迅速失活，突變體 可在50反應(yīng) pH 8.3 7.6,22,主要用途用于將mRNA轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA。在此反應(yīng) 中可用3種引物： 寡核苷酸脫氧胸苷1218聚體oligo (dT)1

12、2 18。 合成時，模板3端的序列有可能被過量拷貝，從而在 cDNA中所占比例過大，這取決于反轉(zhuǎn)錄酶的質(zhì)量及 反應(yīng)條件。 隨機序列的寡核苷酸。 旨在使用序列極為多樣的一個寡核苷酸集群，以期至 少能有一些寡核苷酸與模板退火并作為反轉(zhuǎn)錄的引物。 特定序列的寡核苷酸，作為合成與某一段特定的mRNA 相對應(yīng)的cDNA的引物。,23,24,First strand synthesis,Second strand synthesis,25,【注】 反轉(zhuǎn)錄酶與大腸桿菌DNA聚合酶I不同之處是不具有35 外切核酸酶活性，缺乏校對功能，因此容易出錯，在高濃 度dNTP和Mn2+存在下，大約每500個堿基會出現(xiàn)一

13、個堿基 的錯誤摻入。,26,7 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶： 末端轉(zhuǎn)移酶來源于小牛胸腺，是僅存在于前淋巴細(xì)胞及分 化早期的類淋巴樣細(xì)胞內(nèi)的一種不尋常的DNA聚合酶。在 二價陽離子存在下，末端轉(zhuǎn)移酶催化dNTP加于DNA分子 的3羥基端。受體DNA可短至3個核苷酸。此酶強烈偏向 于以帶3突出端的DNA作為受體，也能在含有Co2+、Mg2+ 或Mn2+的低離子強度緩沖液中以帶3平端或3凹端的DNA 作為受體，但效率相對較低,27,主要用途給載體或cDNA加上互補的同聚尾 單鏈DNAOH Mn2+或 Mg2+ dATP, dTTP 末端轉(zhuǎn)移酶 dGTP, dCTP DNA-(pdN)n+nPPi,28,（

14、二依賴于DNA的RNA聚合酶 SP6噬菌體及T7和T3噬菌體RNA聚合酶 (來源于SP6噬菌體感染的鼠傷寒沙門氏菌LT2株，T7或T3噬菌體感染的 大腸桿菌） 識別雙鏈DNA模板上相應(yīng)的噬菌體特異性的啟動子，并 沿此雙鏈DNA模板起始RNA合成。三種RNA聚合酶都對 其相應(yīng)的啟動子呈現(xiàn)高度的特異性，能合成任何置于適 當(dāng)啟動子控制下的DNA的全長轉(zhuǎn)錄物,29,主要用途1）用于在體外合成大量與外源DNA一條鏈互 補的單鏈RNA，可作為雜交用探針、體外翻譯 系統(tǒng)中的功能性mRNA。,30,2）已用T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)在大腸桿菌、酵母中表達(dá)克 隆化基因。將靶基因克隆于噬菌體啟動子序列的下游及 適當(dāng)轉(zhuǎn)錄終

15、止序列的上游。再將所產(chǎn)生的重組質(zhì)粒（第 一質(zhì)粒）導(dǎo)入含有以可調(diào)控方式表達(dá)噬菌體RNA聚合酶 的第二個質(zhì)粒的細(xì)胞。因而，誘導(dǎo)聚合酶基因可導(dǎo)致第 一個質(zhì)粒中靶DNA的轉(zhuǎn)錄及其所編碼產(chǎn)物隨后的充分表 達(dá)。T7噬菌體RNA聚合酶和啟動子是大腸桿菌中應(yīng)用最 廣泛的二元表達(dá)系統(tǒng)。,31,（三連接酶、激酶及磷酸酶 包括： T4噬菌體DNA連接酶 大腸桿菌DNA連接酶 （已不常用） T4噬菌體RNA連接酶 T4噬菌體多核苷酸激酶 堿性磷酸酶,32,1 T4噬菌體DNA連接酶 : 由T4噬菌體的基因30編碼，是487個氨基酸組成的單體蛋白 （Mr=55 230)。催化相鄰的核苷酸分子間5磷酸基與3羥基 之間形成

16、磷酸二酯鍵。 用途1連接帶匹配粘端的DNA分子。 2是平端的雙鏈DNA分子互相連接或與合成接頭相 連接。 【注】i 聚乙二醇（PEG可增強水溶液中大分子間的有效 作用, 可促進(jìn)DNA的分子間連接，提高連接效率。 ii 連接反應(yīng)中需要ATP,33,失去磷酸二酯鍵的缺口 3 5,缺失核苷酸的缺口,連接酶封閉缺口 連接酶無法封閉缺口,無活性,(a) (b) (a)具有 3OH和 5P基團(tuán)的一個缺口被 DNA連接酶封閉起來 (b)如果是缺失一個或數(shù)個核苷酸的缺口，DNA連接酶則不能將它封閉,DNA連接酶的活性,34,35,Cloning in a plasmid vector,36,DNA片段之間的拼

17、接方法 1 同種限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物之間的連接：同一種限制酶酶 切產(chǎn)物之間的末端是互補的，因此可以是正方向，也可 以是反方向插入載體，為防止載體自身環(huán)化，常用堿性 磷酸酶（CIP處理線性的載體DNA分子，移去其末端 的5磷酸基團(tuán)，使其不能再被連接酶共價連接。相同的 兩種限制酶雙切處理的載體與目的DNA的連接是定向的， 稱為定向連接。,37,堿性磷酸酶的脫磷酸作用阻止線性的質(zhì)粒DNA分子再環(huán)化,38,外源DNA片段定向克隆,39,2 產(chǎn)生相同末端結(jié)構(gòu)的不同限制酶切產(chǎn)物之間的連接： 同尾酶處理的目的基因和載體之間進(jìn)行連接，但連接 后，原來的酶切位點都喪失。 3 平末端DNA片段連接：平端可用T4 DN

18、A連接酶連接， 其連接效率比粘端之間的連接效率要低，但因平端連接 具有普適性，故極其有用。,40,連接酶的活性單位 Weiss單位規(guī)定，37下 20 min內(nèi)可使1nmol 32P在有機焦 磷酸于ATP之間產(chǎn)生交換所需的酶量為1個活性單位 供貨商多使用的是“隨意”單位，其依據(jù)是連接酶連接DNA 粘性末端的能力。粗略估計：1個Weiss活性單位約等于60 個DNA粘性末端單位（New England Biolabs公司定義）。 因此，0.015Weiss單位的T4 噬菌體DNA連接酶在16下 30min內(nèi)可使50%的用HindIII消化5g 噬菌體DNA所產(chǎn)生 的片段得以連接。,41,連接反應(yīng)的

19、一般原則 為獲得最大效率的連接，反應(yīng)體系越小越好，一般為10l。 連接反應(yīng)中，載體和插入的目的片段的摩爾比一般為1:1或 1:3。DNA 終濃度約為10ng/l。先用瓊脂糖凝膠電泳檢查 DNA樣品的大概濃度，然后計算DNA的用量。 ng of vectorkb size of insert insert kb size of vector vector,molar ratio of =ng of insert,舉例：500bp目的片段，100 ng 3.0kb的質(zhì)粒載體，載體與 片段用1:3摩爾比 100 ng of vector 0.5kb insert 3 3.0kb vector 1,=

20、50ng of insert,42,連接反應(yīng)的溫度是影響連接效果的另一個重要因素， DNA片段間的連接常采用較低溫度（1216和 較長的時間（1224小時，目的是維持片段粘性 末端間的氫鍵，便于連接酶的作用。,43,2 T4噬菌體多核苷酸激酶： （來源于T4噬菌體感染的大腸桿菌） 催化ATP的磷酸基轉(zhuǎn)移至DNA或RNA的5末端。在 正向反應(yīng)中，ATP的-磷酸基被轉(zhuǎn)移到去磷酸化的DNA 的5端。在交換反應(yīng)中，過量的ATP存在時，也可將磷 酸化的DNA的5端磷酸轉(zhuǎn)移給ADP，然后DNA從-32P ATP中獲得放射性標(biāo)記的磷酸而重新磷酸化。該酶 催化5突出端磷酸化的速度比催化平端或5凹端快得多， 在

21、雙鏈DNA切口或缺口處進(jìn)行磷酸化的效率比單鏈末端 的磷酸化效率要低。,*,44,用途1標(biāo)記DNA 5末端。 示例： 5 pCp GpC+過量ATP -32PATP T4噬菌體多核苷 二硫蘇糖醇 酸激酶 Mg2+ 5 p Cp GpC+ADP 2對準(zhǔn)備用于連接但缺乏5磷酸的DNA或合 成接頭進(jìn)行磷酸化。 示例： 5 HOCp GpC ATP T4噬菌體多核苷 二硫蘇糖醇 酸激酶 Mg2+ 5 p Cp GpC+ADP,*,*,45,3 堿性磷酸酶： 細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP和牛小腸堿性磷酸酶（CIP均 能催化去除DNA、RNA、rNTP和dNTP的5磷酸的反應(yīng)。 用途1在用-32PATP標(biāo)記5末端

22、前，去除DNA或RNA 的5磷酸。 2去除DNA片段5磷酸，所產(chǎn)生的5羥基不再參 與連接反應(yīng)，以防止載體分子的自身環(huán)化。 3）作為非放射性系統(tǒng)中的報道酶，與配體偶聯(lián)， 如能與生物素化靶分子特異性相互作用的鏈親 和素偶聯(lián)，可用于檢測和定位核酸和蛋白。,46,【注】BAP對高溫和去污劑耐受性強，在去磷酸化反應(yīng)結(jié) 束后，若不能完全抑制其活性，則不能保證隨后的連接反 應(yīng)有效地進(jìn)行,。CIP具有明顯的優(yōu)點，在蛋白酶K及或在 5mmol/L EDTA存在下加熱（65 60min或75 1015 min)可完全失活，去磷酸化的DNA可通過酚-氯仿抽提純 化，因此目前主要使用CIP。,47,（四核酸酶 BAL

23、31核酸酶主要活性為3外切核酸酶活性，可從 線狀DNA兩條鏈的3端去除單核苷酸。用于 通過可控 方式去除雙鏈DNA的末端核苷酸，縮短后的分子具有 多種用途，如產(chǎn)生缺失、對啟動子或其他調(diào)控序列進(jìn) 行定位等。 S1核酸酶降解單鏈DNA或RNA，產(chǎn)生帶5磷酸的單 核苷酸或寡核苷酸，用于分析DNA：RNA雜交體的 結(jié)構(gòu)，打開雙鏈cDNA合成中的發(fā)夾環(huán)，去除DNA片 段中突出的單鏈尾以產(chǎn)生平端。,48,核糖核酸酶A（胰）內(nèi)切核糖核酸酶，可特異地攻擊 RNA 上嘧啶殘基的3端，切割與相鄰核苷酸形成的磷酸 二酯鍵。用于從DNARNA或RNARNA雜合體中去 除未雜合的RNA區(qū)。 注意：要制備不含DNA酶的核

24、糖核酸酶，在配置貯存 液時需加熱到100，15 min,49,(五蛋白水解酶 蛋白酶K是枯草桿菌類的高活性絲氨酸蛋白酶，由 靜止培養(yǎng)的溫和的霉菌菌種分泌產(chǎn)生。催化水解多肽 鍵，對芳香類和去電荷的氨基酸多肽鍵的羧基端尤甚 用途消化天然蛋白，能快速滅活細(xì)胞溶液中的DNA 和RNA酶，便于高相對分子質(zhì)量DNA和完整RNA的分 離 備用溶液 貯存溫度 反應(yīng)濃度 反應(yīng)緩沖液 溫度 20mg/ml水溶 20 50g/ml 0.01mol/L tris-Cl 3756 液（50mol/L (pH7.8) tris-Cl (pH8.0) 0.005mol/LEDTA 1.5mol/ Ca (CH3COO)2

25、0.5%SDS,50,第三節(jié) 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR,多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction, PCR)是一種 在體外模擬天然DNA復(fù)制過程的核酸擴增技術(shù)，實際上 是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核酸存在的條件下依 賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)，用于擴增位于兩段已知序 列之間的DNA區(qū)段。Mullis等人于1985年發(fā)明PCR.EXE,51,基本原理：以分別位于待擴增DNA區(qū)段兩側(cè)的兩段序列 互不相同并分別與模板DNA兩條鏈上的各一段互補的寡 核苷酸為引物。反應(yīng)分三步：(1)變性(denaturation)-通過 加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA

26、； (2)退火(annealling)-隨之將反應(yīng)混合液突然冷卻至某一溫 度，反應(yīng)體系中摩爾數(shù)大大過量的引物DNA可與其互補 的模板在局部形成雜交鏈；(3)延伸(extension)-在DNA聚 合酶、4種dNTP底物及Mg2+存在下，催化以引物為起始 點的53的DNA鏈延伸反應(yīng)。如此反復(fù)進(jìn)行變性、退 火和DNA合成的循環(huán)，新合成的DNA鏈又成為下一輪循 環(huán)的模板，這一周而復(fù)始的過程每完成一個循環(huán)，基本 上目的DNA就增加1倍，使介于兩個引物間的特異性DNA 片段得到了大量復(fù)制，數(shù)量可達(dá)2106-7拷貝,52,防止PCR污染的重要性及措施 PCR是一項敏感性極高的技術(shù)，即使104細(xì)胞中含有一個

27、 拷貝的待檢核酸序列，也可被檢測出來。PCR的特性決 定了進(jìn)入反應(yīng)的唯一DNA必須是實驗者所加的模板，所 以PCR應(yīng)該在一個沒有DNA的環(huán)境中進(jìn)行。隨著PCR的 廣泛使用，最嚴(yán)重的問題是靶序列的污染，這在PCR之 前就可能發(fā)生。如果不認(rèn)識控制模板和PCR產(chǎn)物引起的 污染的重要性，不采取相應(yīng)的措施，PCR對你的研究只 會有害，不會有益。,53,防止污染的措施： 1）PCR實驗室的建立：從事對污染很敏感的PCR分析，如 測定樣品中靶序列的數(shù)量及以靶序列的有無作為診斷標(biāo) 志，必須建立嚴(yán)格的工作區(qū)域?qū)CR的樣品制備、PCR 反應(yīng)區(qū)以及PCR產(chǎn)物分析區(qū)完全隔離。對把PCR用作對 污染不敏感的分子生物學(xué)

28、工具，如基因的克隆及探針的 制備，也應(yīng)加以注意，分開區(qū)域操作。 2）樣品制備應(yīng)按無菌操作的原則進(jìn)行，避免樣品間的污染。 3）試劑的配制、分裝和保存的有關(guān)操作都應(yīng)在無PCR產(chǎn)物 的環(huán)境中進(jìn)行，小量分裝試劑，配制總反應(yīng)混合液。 4）設(shè)立空白對照，即除了不加入模板DNA外，實驗的全 過程都處于完全同等的條件。,54,PCR中遺留污染的酶法控制 污染的DNA可能有三個來源：來自其它測試樣品的DNA、 來自實驗材料如重組克隆的DNA、或者來自同一靶序列 前一次PCR的擴增產(chǎn)物。最后一種污染，通常稱作“遺留” （carryover)污染，是由于操作PCR產(chǎn)物時的氣溶膠所致， 是最為麻煩的一種。 診斷PCR

29、中最廣泛應(yīng)用的控制污染的方法就是UNG和 dUTP系統(tǒng)。在PCR中常規(guī)使用dUTP，置換dTTP，使產(chǎn) 物中含有尿嘧啶，對尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG，也稱 尿嘧啶N-糖基化產(chǎn)物或UNG）敏感,可以有效地抑制PCR 產(chǎn)物的重擴增。,55,CTGACTAGT GACTGATCA,在dNTP存在下 PCR擴增N個循環(huán),CUGACUAGU GACUGAUCA,2N,PCR試劑不小心被dU-DNA所污染,向下一個PCR反應(yīng) 混合物中加入UDG 于37溫育10min消化dU-DNA,C GAC AG GAC GA CA,95,10min，滅活UDG 消化DNA片段,CAG,AC,GAC,AG,C GA,

30、污染的DNA沒有被擴增,UDG法防止PCR中遺留污染簡圖,56,PCR反應(yīng)的成分和作用 1 PCR反應(yīng)的緩沖液 Mg2+濃度：是影響反應(yīng)特異性和擴增片段產(chǎn)率的重要因素， 一般為1.52.0mmol/L，范圍從0.55.0 mmol/L。 10mmol/L TrisCl(室溫下pH=8.38.8)：主要靠其調(diào)節(jié)pH 使 Taq DNA聚合酶的作用環(huán)境維持偏堿性。 標(biāo)準(zhǔn)PCR緩沖液內(nèi)含有50mmol/L KCl，它對于擴增500bp 長度的DNA片斷是有益的。 DMSO（二甲基亞砜：可減少模板的二級結(jié)構(gòu)，提高PCR 反應(yīng)的特異性，在擴增高GC含量的DNA模板時可以加入 適量（10%)。,57,2

31、底物(dNTPs)濃度 標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中包含4種等摩爾濃度的dNTPs，dNTPs 濃度應(yīng)在20200mol/L。dNTP濃度過高可加快反應(yīng)速度， 同時還可增加堿基的錯誤摻入和實驗成本。反之，低濃度 的dNTP會導(dǎo)致反應(yīng)速度下降，但可提高實驗的精確型。 4種dNTP在使用時必須以等當(dāng)量濃度配制，以減少錯配誤 差和提高使用效率。dNTP溶液具有較強的酸性，使用時應(yīng) 以NaOH將pH值調(diào)至7.07.5（公司銷售的為pH8.0), 分裝小 管，與20存放，可防止原液在冷凍與融化時損壞dNTP 分子結(jié)構(gòu)。,58,3 引物 引物濃度一般為0.10.5mol/L（即6101231013個分 子），濃度

32、偏高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增，還可 增加引物之間形成二聚體的機率，均會使目的DNA合成 產(chǎn)率下降。 在整個PCR擴增體系中，引物的設(shè)計占有十分重要的地位。 PCR作為一個體外酶促反應(yīng)，其效率和特異性取決于兩個 方面，一是引物與模板的特異結(jié)合，二是多聚酶對引物的 有效延伸。引物的精心設(shè)計其目的在于獲得高產(chǎn)率的目的 擴增產(chǎn)物，抑制非特異序列的擴增以及擴增DNA產(chǎn)物的后 續(xù)操作。,59,引物設(shè)計一般遵循下列原則： 1引物長度以1825bp為宜，上下游引物的長度差別3bp。 2引物堿基盡可能隨機分布，GC含量宜在4060%左右。 3引物的堿基順序不應(yīng)與非擴增區(qū)域有同源性。 4引物內(nèi)部不能有大于3b

33、p的反向重復(fù)序列或自身互補序列， 這種序列可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，會阻止寡核苷酸核靶DNA的 復(fù)性。 5）兩個引物之間尤其在3末端不應(yīng)有互補鏈存在，引物間的 微弱互補，都會導(dǎo)致引物間形成雜交，引發(fā)引物二聚體 的形成和擴增。 6）計算出來的兩個引物的解鏈溫度（Tm）值相差5。,60,7引物3末端的性質(zhì)非常關(guān)鍵，原則上堿基一定要與模板 DNA配對。 8引物5末端堿基并沒有嚴(yán)格的限制，只要與模板DNA 結(jié)合的引物長度足夠，其5末端堿基可以不與模板DNA 匹配而呈游離狀態(tài)。一般在引物5末端最多可以游離數(shù) 10個堿基并不影響PCR反應(yīng)的進(jìn)行。引物設(shè)計時可以 在5末端加上限制性內(nèi)切酶位點或其它短的序列，由于 位于

34、DNA分子的5末端的限制性內(nèi)切酶位點的切割效率 比較低，所以引物應(yīng)超出限制性內(nèi)切酶識別位點至少3個 堿基。,61,4 耐熱DNA聚合酶 在2550l反應(yīng)體系中，一般所需Taq DNA聚合酶的用量為 0.52.5U，根據(jù)擴增片段的長短及其復(fù)雜程度（GC含量 不同而有所區(qū)別。 Taq DNA聚合酶具有良好的熱穩(wěn)定性, 測試結(jié)果為：92.5、 95、 97.5下， Taq DNA聚合酶的生物半衰期分別為 130分鐘、40分鐘和56分鐘。在PCR反應(yīng)中，變性溫度一 般為9430秒1分鐘，以循環(huán)30次計算， Taq DNA聚合酶 可保證PCR反應(yīng)的需要。,62,Taq DNA聚合酶缺乏35外切酶活性，因

35、此，在PCR反應(yīng) 中如果發(fā)生某些單核苷酸的錯配，這種酶是沒有校正功能的。所以需要對PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列分析。 不同來源的Taq DNA聚合酶在擴增效率，擴增片段的長度 和保真度上都有差異。Taq DNA聚合酶是常規(guī)擴增小片段 DNA時的首選酶類。為了得到某個基因高保真度的拷貝， 就應(yīng)選用具有校正功能的酶；如果要對擴增片段進(jìn)行克隆， 則需選用產(chǎn)生平端的酶。,63,Taq DNA聚合酶有類似于末端轉(zhuǎn)移酶的非模板依賴的延伸性， 并對A有優(yōu)先選擇性，使得PCR產(chǎn)物的兩單鏈的3端往往帶有 一個非模板依賴的堿基A，給PCR產(chǎn)物的直接與平端載體相連 接造成困難，效率很低。解決方法：（1先利用T4 DNA

36、聚 合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I大片段對PCR產(chǎn)物進(jìn)行處理，然 后再與平端載體連接，可以明顯提高克隆的效率。（2在合 成PCR的引物上直接引入限制性酶切點，擴增完成后再用限制 酶切從而獲得粘性末端而進(jìn)行連接。（3目前已有商品化提 供的利用ddT或dT加尾的載體專供PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行克隆。,64,5NNNAAGCTT,HindIII序列,CCATGGNNN5 KpnI序列,PCR擴增,5NNNAAGCTT 3NNNTTCGAA,CCATGGNNN5 GGTACCNNN3,用HindIII和KpnI消化,5AGCTT 3A,GGTAC3 C5,PCR產(chǎn)物加入限制性酶切位點,65,5 模板 PCR反

37、應(yīng)中對DNA模板的要求并不嚴(yán)格。首先對純度要 求不是十分嚴(yán)格，樣品間沒有交叉污染很重要。其次， 模板用量很低，理論上102104拷貝的模板足可滿足各種 要求的PCR反應(yīng)。 *1g人單拷貝基因組DNA的靶細(xì)胞數(shù)3105，100 l PCR 反應(yīng)體系中，加0.1 g基因組DNA。 10 g酵母DNA靶細(xì)胞數(shù)3105，摸板量10ng。 1 g大腸桿菌DNA靶細(xì)胞數(shù)3105, 細(xì)菌和質(zhì)粒的摸板量依次 是1ng和1pg。,66,模板的來源可以是血液（新鮮抗凝血、陳舊血塊等、新 鮮組織塊和石蠟包埋組織、各種脫落細(xì)胞、毛發(fā)、尿樣及 糞便，還有從新鮮組織細(xì)胞中制備RNA模板。根據(jù)不同樣 品，采用不同的方法。

38、抑制劑 PCR反應(yīng)體系中任何成分的過量存在都有可能成為抑制PCR 反應(yīng)的因素。常見的抑制劑有蛋白酶K，苯酚和EDTA。其 他的一些物質(zhì)，例如離子型去垢劑，肝素，血紅蛋白和上樣 凝膠中的染料如溴酚藍(lán)等。,67,6 PCR反應(yīng)條件的選擇 變性：9095條件下，即使再復(fù)雜的DNA分子，如人基 因組DNA也可變性成為單鏈，一般情況下先進(jìn)行94 3分鐘，然后進(jìn)入循環(huán)，每次變性為9445秒。 退火：復(fù)性過程采用的溫度（Ta)至關(guān)重要，通常在比理論 計算的引物和模板形成的雜合分子的溶解溫度低35C 的條件下進(jìn)行。溫度的選擇可以根據(jù)引物的長度和其 GC含量確定。長度在1525bp之間，可通過公式 計 算得到：

39、 Tm/C=4 (G+C)+2 (A+T) 長度14bp, 長達(dá)60-70bp 可用以下公式： Tm/ C =81.5-16.6 lgK+0.41(%G+C )-(675/n) 在Tm允許的范圍內(nèi)，選擇較高的退火溫度可大大減少 引物與模板之間的非特異結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異 性。退火時間設(shè)置為30秒。,68,延伸：溫度建議選擇在7278之間，此時Taq DNA聚合 酶具有最高活性。時間根據(jù)擴增片段的長度而定，在 最適反應(yīng)溫度下, Taq DNA聚合酶的聚合速率約為 2000bp/min, 一般 1kb以內(nèi)的片段，用1分鐘即可。 循環(huán)次數(shù)：主要取決于反應(yīng)體系中起始的模板拷貝數(shù)以及 引物延伸和擴

40、增的效率。用Taq DNA聚合酶（效率約為 0.7)在一個含有105個拷貝的靶序列的反應(yīng)體系中進(jìn)行30 個循環(huán)后既達(dá)到理想情況，以含有單拷貝的靶序列的哺 乳動物DNA為模板，至少需要進(jìn)行25個循環(huán)才能得到 足夠量的擴增產(chǎn)物。最后一次循環(huán)的延伸時間一般要保 持5分鐘。,69,平臺效應(yīng)：是指PCR循環(huán)的后期，合成產(chǎn)物到達(dá)0.31pmol 水平，由于產(chǎn)物的堆積，使原來以指數(shù)增加的速率變 成平坦曲線。到達(dá)平臺期所需PCR循環(huán)次數(shù)取決于樣 品中模板的拷貝數(shù)、底物或引物等消耗、DNA聚合酶 的種類和活性、以及非特異性產(chǎn)物的競爭等因素。平 臺期在PCR反應(yīng)中是不可避免的，但一般在此之前， 合成的目的基因片段

41、的數(shù)量足可滿足實驗的需要。,70,熱啟動：是一種在PCR反應(yīng)中優(yōu)化目標(biāo)擴增產(chǎn)物的方 法，同時也抑制非特異擴增。這是通過控制PCR反應(yīng) 的必須組分如DNA聚合酶或鎂離子，直到反應(yīng)混合液 被加熱到可以阻止非特異引導(dǎo)和引物聚合的溫度啟動 PCR來實現(xiàn)的。熱啟動主要用于下列情況：非特異擴 增較為嚴(yán)重；反應(yīng)中的模板DNA少于104個拷貝數(shù)；模 板DNA復(fù)雜度非常高；多重PCR。,71,介紹幾種PCR 反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcriptase-PCR, RT-PCR) RTPCR是從RNA擴增cDNA拷貝的方法，對于從非常 少量的mRNA樣品構(gòu)建大容量的cDNA文庫是極為靈敏 與通用的方法。RT-PCR還可用于鑒定已轉(zhuǎn)錄序列是否 發(fā)生突變及呈現(xiàn)多態(tài)性，測定基因表達(dá)強度，尤其是在 獲得的