水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的測定-楊洪生PPT優(yōu)秀課件

1、1,水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的測定,楊洪生 江蘇省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心 農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（南京）,2,目 錄,3,1. 簡 介,4,孔雀石綠,中文名稱：孔雀石綠、堿性綠、嚴(yán)基塊綠、孔雀綠 英文名稱：malachite green , MG CAS No. ：2437-29-8(oxalate salt) ；569-64-2(chloride salt) 分 子 量 ：929.0 (oxalate salt)；364.9 (chloride salt) 金屬光澤的綠色結(jié)晶 易溶于水，溶液呈藍(lán)綠色；溶于甲醇、乙醇和戊醇 見光易分解,孔雀石：Cu2(CO3)(OH)2 僅僅顏色相近,5,

2、鹽酸鹽,草酸鹽,孔雀石綠結(jié)構(gòu)式,6,無色孔雀石綠,英文名稱： leucomalachite green, LMG CAS No. ： 129-73-7 分 子 量 ： 330.5 不溶于水，但易溶于乙腈、二氯甲烷等 LMG比MG更加穩(wěn)定； 在體內(nèi)殘留的主要形態(tài),無色孔雀石綠,7,8,孔雀石綠的危害,高殘留,高致癌,孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物無色孔雀石綠能迅速在組織中蓄積，如已在受精卵和魚苗的血清、肝、腎、肌肉和其他組織中檢測到。 無色孔雀石綠由于其不溶于水，殘留毒性比孔雀石綠更強(qiáng)。,孔雀石綠分子中與苯基相連的甲基受苯環(huán)影響，有較高的反應(yīng)活性，可生成自由基三苯甲基；此外孔雀石綠也能抑制人類谷光甘肽S轉(zhuǎn)

3、移酶的活性。 此兩者均能造成人類器官組織細(xì)胞的異常，誘發(fā)腫瘤和脂質(zhì)過氧化。,9,高致畸,致突變,當(dāng)孔雀石綠濃度低于0.1mg/mL時(shí)，它仍能使兔和魚繁殖致畸；當(dāng)孔雀石綠濃度高于0.2 mg/L時(shí)，軟體動(dòng)物（東風(fēng)螺）的受精卵或是幼體都有不同程度的發(fā)育畸形。,研究發(fā)現(xiàn)孔雀石綠可使鳙魚和尼羅羅非魚的紅細(xì)胞產(chǎn)生微核，且微核率隨藥物濃度的升高而增加。,10,研究發(fā)現(xiàn)MG與LMG均能使大鼠肝細(xì)胞空泡化，無色孔雀石綠還能使甲狀腺濾泡上皮大量凋亡，減少公鼠甲狀腺激素的釋放； 能抑制血漿膽堿脂酶的作用，進(jìn)而有可能造成乙酰膽堿的蓄積而出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。 此外，它還能通過溶解足夠的鋅，引起水生動(dòng)物急性鋅中毒，并引起魚類

4、消化道、鰓和皮膚輕度發(fā)炎，從而影響魚類的正常攝食和生長，能阻礙腸道酶（如胰蛋白酶、a-淀粉酶）的活性，影響動(dòng)物的消化吸收功能。,高毒性,11,目前禁用孔雀石綠的主要國家和地區(qū),加拿大于1992年禁止其作為漁場殺菌劑 美國規(guī)定在食用水產(chǎn)品中禁止檢出 歐盟于2002年6月頒布法令禁止在漁場中使用 日本禁止在水產(chǎn)品中檢出孔雀石綠,12,2005年，英國一家知名的超市連鎖店出售的有機(jī)鮭魚體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)含孔雀石綠，隨即在全球引發(fā)“圍剿”孔雀石綠的活動(dòng)。 同年8月，韓國在福建、江西和安徽等地的出口鰻魚產(chǎn)品中檢出含有孔雀石綠。 數(shù)日后在香港市場出售的多種淡水魚中檢出含有孔雀石綠。 對我國的水產(chǎn)品出口貿(mào)易造成了不

5、可挽回的經(jīng)濟(jì)損失。,13,中國孔雀石綠監(jiān)控歷程,2000年度中華人民共和國出口動(dòng)物及動(dòng)物源性食品中有毒有害物質(zhì)殘留監(jiān)控計(jì)劃 首次將出口鰻魚中孔雀石綠殘留量的監(jiān)控列入年度計(jì)劃 無公害食品水產(chǎn)品中漁藥殘留限量（NY 5070-2001） 孔雀石綠規(guī)定為“不得檢出” 食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單農(nóng)業(yè)部農(nóng)牧發(fā)20021號 孔雀石綠為禁用藥物 2004年度中華人民共和國出口動(dòng)物及動(dòng)物源性食品有毒有害物質(zhì)監(jiān)控計(jì)劃 將養(yǎng)殖蝦和鰻魚中孔雀石綠的限量要求規(guī)定為“不得檢出”,14,孔雀石綠常用檢測方法,15,孔雀石綠屢禁不止的原因,價(jià)廉易得 對水霉病等療效好，缺少替代藥 缺乏有力的監(jiān)管 養(yǎng)殖者對孔雀石綠副作

6、用了解不深,16,2.樣品前處理,17,水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定 （GB/T 19857-2005),18,儀器與設(shè)備,1100液相色譜儀（DAD二極管陣列檢測器）（美國Agilent公司）； 酸性氧化鋁柱，1g/3mL（美國Supelco公司）； 固相萃取裝置（美國Supelco公司）； XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）； AllegraTM 21R臺式高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman公司）； R-205Avanec旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Buchi公司）； 0.22m濾膜（江蘇漢邦科技有限公司）。,19,藥品與試劑,乙腈、二氯甲烷、冰乙酸 （色譜純，Tedia公司）；

7、 孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品、隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品（美國Sigma公司）； 無水乙酸鈉（南京化學(xué)試劑一廠）； 對甲苯磺酸（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）； 鹽酸羥胺（南京化學(xué)試劑有限公司）； 二甘醇（Fluka公司）； 酸性氧化鋁，100-200目（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； Millipore 超純水。,20,樣品準(zhǔn)備,實(shí)驗(yàn)中所采用的樣品為魚樣，去鱗、去皮，沿背脊取肌肉，用高速萬能試樣粉碎機(jī)打成勻漿，冷凍保存，用前解凍。,21,樣品稱取,稱取5.00 g樣品于50 mL離心管內(nèi),22,提取,加入： 1.5 mL 20%的鹽酸羥胺溶液 2.5 mL 1.0 mol/L的對-甲苯磺酸溶液 5.0 mL pH4.

8、5 乙酸鹽緩沖溶液， 渦旋混合3min； 加入10 mL乙腈劇烈混合3min。,23,在國家標(biāo)準(zhǔn)中，渦旋混合的時(shí)間為30s； 但從實(shí)際出發(fā)，渦旋混合時(shí)間長一些有助于提取液從肉樣中充分提取出目標(biāo)物； 在實(shí)際處理過程中建議在3min以上。,24,加入5g酸性氧化鋁 再次混合3min,25,提取孔雀石綠時(shí)酸性氧化鋁的加入量由樣品所含的雜質(zhì)量決定。如蟹黃等雜質(zhì)較多的肉樣可多加一些，鱈魚、青蝦等可少加一些，不一定要求為5g。,26,10 000 r/min離心15 min 上清液轉(zhuǎn)移至100 mL離心管中 預(yù)先裝有10 mL 水和2 mL 二甘醇,27,在50 mL離心管中加入10 mL乙腈，重復(fù)上述操

9、作，合并乙腈層。,28,在100 mL離心管中加入 15 mL 二氯甲烷 混合2min 4 000 r/min離心10 min，,29,將二氯甲烷層轉(zhuǎn)移至100 mL的棕色圓底燒瓶中 再用5 mL乙腈、10 mL 二氯甲烷重復(fù)上述操作一次，合并二氯甲烷層于100 mL棕色圓底燒瓶中。,30,35旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約1 mL，用2.5 mL乙腈溶解殘?jiān)?將酸性氧化鋁柱安裝在固相萃取裝置上，用5mL乙腈活化柱子。 將圓底燒瓶中的溶液轉(zhuǎn)移到柱上，再用乙腈洗滌瓶兩次，每次2.5 mL, 再用5mL乙腈沖洗柱子，把洗滌液依次通過柱，控制流速不超過0.6mL/min，收集全部流出液。,31,如果試樣雜質(zhì)較少，本身

10、比較潔凈，如鱈魚、青蝦等，是否可以跳過過柱這一步，直接將二氯甲烷提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干以簡化前處理？ 對此作了8個(gè)樣品加標(biāo)試驗(yàn)，每個(gè)樣品各加 0.05gmL-1標(biāo)樣1mL，前4個(gè)不過柱，后4個(gè)過柱。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：過酸性氧化鋁柱是必需的，它對無色孔雀石綠的回收率沒什么影響，卻有效的挽回了孔雀石綠回收率的損失。而且，除去大量雜質(zhì)，使樣品譜圖更干凈、美觀。,32,35旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干 準(zhǔn)確用1.0mL乙腈溶解 過0.22m有機(jī)相濾膜，濾液供液相色譜測定,33,3.樣品檢測,34,液相色譜檢測條件,色譜柱：C18柱，250mm4.6mm(i.d.)，5m，在C18色譜柱和檢測器之間連接 25%PbO2氧化柱；

11、 流動(dòng)相：乙腈和乙酸銨緩沖溶液(pH 4.5)(體積比為80：20)； 檢測波長：618 nm； 柱溫：35； 進(jìn)樣量：20L； 流速：1.0 mL/min。,35,研究了不同配比的乙腈和乙酸銨緩沖液的流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)當(dāng)增加乙腈或水的比例，會(huì)改變MG和LMG的保留時(shí)間，甚至?xí)霈F(xiàn)LMG比MG提前出峰。 但由于每次配制的流動(dòng)相存在差異，因此使得MG和LMG的保留時(shí)間在每批次分析中存在一定的差異，但在同一批次的分析過程中，MG和LMG的保留時(shí)間基本保持穩(wěn)定，能夠達(dá)到達(dá)基線分離，峰形尖銳、對稱。,36,4.結(jié) 果,37,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖,0.10g/mL標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖,38,樣品空白色譜圖,樣品空白色譜圖,39,樣品加標(biāo)色譜圖,4.0g/kg加標(biāo)樣品色譜圖,40,標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程與相關(guān)系數(shù),41,最低檢測限（MDL）,MDL計(jì)算公式：MDL=3CN/R 式中：MDL為最低檢測限 C為最低加標(biāo)樣品， N為實(shí)測噪聲， R為檢測器（DAD）響應(yīng)值，采用峰面積。 2.0g/kg加標(biāo)樣品，測得MG和LMG的R/N分別為6.2、8.5 按上式計(jì)算得本方法MDL：MG為1.0g/kg、LMG為0.7g/kg。,42,MG回收率與精密度（n=6）,43,LMG回收率與精密度（n=6）,44,雙人比對考核,兩名檢測人員參加加標(biāo)考核