2011化學藥物結構確證研究的技術要求與案例分析[共127頁]

1、化學藥物結構確證研究的技術要求與案例分析,王玉成 中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所,目錄,(一) 結構確證研究的一般原則和要求 (二) 對不同類別藥品結構確證的要求 (三) 對特殊化學結構藥品結構確證的要求 (四) 各項波譜和測試的技術要求(案例),1. 結構確證研究的主要對象 2. 結構確證研究的基本方法 3. 結構確證研究的主要內容 4. 結構確證研究的一般要求,(一) 結構確證研究的一般原則和要求,1. 結構確證研究的主要對象,經化學全合成或半合成、微生物發(fā)酵以及從動、植物中提取的原料藥,包括新藥、進口藥和已有國家標準的藥品.,按來源： 化學合成、半合成、天然產物中提取、發(fā)酵等; 按組分

2、： 單一組分、多組分混合物; 按分子量： 小分子化合物、大分子化合物; 按結構特點： 成鹽化合物和非成鹽化合物、手性化合物和非手性化合物、含結晶水/溶劑和不含結晶水/溶劑等;,2.結構確證研究的基本方法, 化學方法：理化分析、元素分析、化學關聯等 物理方法：波譜方法、衍射技術 a. 射頻波、微波與物質的相互作用：核磁共振、電子順磁共振等 (ESP根據譜圖中吸收峰的位置、譜線的積分強度、譜線的寬度及超精細結構等信息可以鑒定自由基和過濾金屬離子等順磁粒子的結構狀態(tài)，檢測它們的濃度（可檢測到10-14摩/升）。) b. 紅外、可見、紫外光與物質的相互作用：紅外光譜、紫外光譜、拉曼光譜等 c. X射線

3、與物質的相互作用：X射線衍射等 d. 電子與物質的相互作用：質譜、電鏡等 e. 其他：熱分析、原子吸收、原子發(fā)射等,3.結構確證研究的主要內容, 骨架（平面）結構： 分子中各原子之間的連接順序和方式; 構型： 分子中各原子之間的空間相對位置; 結晶水/結晶溶劑： 與水、有機溶劑通過氫鍵等結合; 晶型： 分子（或原子）在晶體中的排列方式;,骨架（平面）結構 例：氟嗎西尼,骨架（平面）結構的研究方法:,a. 單晶X射線衍射; b. 常規(guī)方法，如元素分析（或高分辨質譜）、UV、IR、NMR（包括二維譜）、MS等組合; 應根據化合物骨架結構的特點及其復雜程度、有無對照品及參考文獻，合理選用測試項目。,

4、構 型： 幾何構型: 雙鍵、環(huán)狀化合物，常用順反（cistrans）或ZE表示 例：西尼地平 （）-3-（2-甲氧基乙基）-5-3-苯基-2（E）-丙烯基-2,6-二甲基-4-（3-硝基苯基）-1,4-二氫- 3,5-吡啶二甲酸酯,例：拉米夫定 (2R-順式)-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫雜環(huán)戊-5-基)-1H-嘧啶-2-酮,幾何構型的研究：,理化性質差別明顯 a. 理化常數，例如熔點等; b. 氫譜、碳譜; c. 紅外光譜、紫外光譜等;,光學異構：由于分子的不對稱性引起，常用D- L或R-S表示。 例：那格列奈 （）N-（反-4-異丙基環(huán)基甲?；?D-苯丙氨酸,例：前列腺素E1

5、（1R，2R，3R）-3-羥基-2-（E）-（3S）-3-羥基-1-辛烯基-5-氧代環(huán)戊烷庚酸,光學異構的研究：,a. 比旋度測定 b. 手性柱色譜（HPLC、GC） c. 核磁共振（NMR） d. 單晶X射線衍射（SXRD） e. 旋光光譜（ORD）(1. 決定化合物之絕對立體構造。 2. 決定蛋白質2級與3級構造。 ) f. 圓二色譜（CD）,g. 其他方法 對照品法根據對照品的構型推定 化學關聯法利用合成工藝分析 例如， 左旋西替利嗪的構型確證： 手性柱色譜定位（與對照品對比)、 比旋度數據、光學純度分析,晶型的研究:,晶型 是化合物一個重要特性;對于多晶型藥物,因晶格結構不同,某些理化

6、性質(如熔點、溶解度、穩(wěn)定性)可能不同;而且在不同條件下,同一化合物的各晶型之間可能會發(fā)生相互轉化。對于難溶性固體口服制劑,其原料藥晶型可能影響藥物的溶解度、穩(wěn)定性、藥代動力學性質進而可能影響藥效。所以對于已有文獻報道的多晶型化合物應明確其晶型,晶型的一致性;對于創(chuàng)新藥也應注意積累相關研究資料觀察有無多晶型現象。,晶型的研究:,a. 粉末X-射線衍射法 b. 紅外光譜法、拉曼光譜法 c. 熔點法 d. 熱分析 e. 光學顯微鏡法,無對照品和文獻報道： 考察不同結晶條件下（溶劑、溫度、結晶速率等）制備樣品的熔點、紅外光譜、粉末X射線衍射等; 有對照品: 對比自制藥物與已上市藥物的熔點、紅外光譜圖

7、、粉末X射線衍射圖譜等; 有文獻報道: 對文獻資料進行分析，選取能夠準確反映產品晶型的測試項目;,結晶水/結晶溶劑的研究:,藥物分子通過氫鍵等和水、有機溶劑結合形成水合物/溶劑化物,含有不同數量結晶水/結晶溶劑的化合物可能具有不同的物理性質,進而可能影響藥物的生物利用度,因此對于原料藥應明確其所含的結晶水/溶劑的情況。,結晶水/結晶溶劑的研究:,a.元素分析 b.熱分析 c.干燥失重、水分檢查 d.單晶X-射線衍射,創(chuàng)新藥： 在干燥失重、水分測定研究的基礎上，通過熱分析、元素分析等確證樣品分子中結晶水/結晶溶劑的數量; 已上市的藥品： 采取合適的分析方法對樣品進行分析，以確證其結晶水/結晶溶劑

8、的情況與已上市產品一致;,小結：,在審評過程中專家評價的關注點一般包括:結構確證方案設計的合理性,是否對化合物所有要素進行了考慮;研究內容設置的全面性,所有的結構特征是否已被確證;分析方法選擇的正確性,所用方法能否針對性地解決結構問題。 研發(fā)者在進行結構確證研究時,測試項目的選擇要依據化合物結構特點、需要解決的結構問題、各種方法所能解決的結構問題等綜合考慮。, 對測試樣品和對照樣品的要求：,測試樣品: a. 精制方法 測試樣品要采用和原料藥制備工藝中相同的精制方法、工藝條件進行精制；對于進行晶型分析、結晶水/結晶溶劑分析時尤其需要注意，因為不同的精制方法和工藝條件可能產生不同的晶型、結晶水/溶

9、劑。 b. 純度要求 大于99.0%，雜質含量應小于0.5%； 對于手性藥物，應增加對對映體、非對映體純度要求，一般 不低于99.5%。,注意點： 仿制藥物：相關物質大于或等于0.1%，要進行結構確證（注意響應因子） 創(chuàng)新藥物：除了與仿制藥物一樣之外，盡可能多的羅列所有可能雜質，要與中間體關聯，特別注意手性問題！,對照品: a. 合法來源證明 購得的標準品(已有國家標準的藥品) 市售原料藥 市售制劑中提取得到的原料藥 從正規(guī)試劑公司購得的試劑等 （有的申報資料中，未選擇上市原料藥或其他合法對照品，而是采用自己單位精制的產品，這種“自身”對照的數據和圖譜對于結構確證沒有任何幫助。 ）,b. 精制

10、方法： 對于用于晶型、結晶水等信息確證的對照品，不應采用處理后原料藥或制劑中提取物作為對照品，因為原料藥和制劑在不同溶媒處理后，會對樣品真實的晶型和結晶水產生影響，造成誤判。 c. 純度檢查： 對照品的純度檢查：申報資料中應提供對照品的純度檢查結果。一般來說，對照品純度應不低于精制品純度，以保證對照品對藥物結構確證的支持力度。,4. 結構確證研究的一般要求,對圖譜、數據的要求,附圖應為原圖的復印件或照片; 圖譜及圖譜上的標記、數據應清晰，并有完整的檢測日期、各項參數、測試條件、儀器型號及樣品編號等記錄。 各項檢測數據應按規(guī)定列表說明，注明其順序。有對照品的應將測試品和對照品同一波譜的數據在一個

11、表中對比列出。如有可作參照的文獻數據，也可列在同一表中。質譜應附離子裂解圖。,(二) 對不同類別藥品結構確證的要求,未知結構的化合物：推論結構 已知結構的化合物：驗證結構, 未在國內外上市銷售的原料藥,按全新化學單體要求：推論結構 a.完成必要的各項測試; b.應提供充分的試驗圖譜和數據; c. 按新化合物要求進行圖譜解析和綜合解析; 如有參考文獻資料，可提供作參考。, 已在國外上市銷售但尚未在國內銷售的原料藥或已有國家標準的原料藥,按已知化學結構的藥物：驗證結構 可以使用對照品 可以參考文獻,a. 有合格對照品的化合物： 提供測試樣品和對照品在完全相同條件和同一儀器上測得的各項圖譜和數據，完

12、成所需的各項目測試，若二者完全相同，并對重要的波譜訊號和測試數據進行了正確解析，即可得出二者化學結構一致的結論。,b. 有詳細文獻數據的化合物： 可對結構確證研究的內容、方法提供線索，并為解析提供參考，但是不能作為結構確證研究的充分證據，仍需要進行較為詳盡的圖譜解析和綜合解析。,c. 無對照品和文獻數據的化合物： 除了目標化合物的結構外，缺乏其他支持性資料，因此原則上應按全新化學單體要求進行全面的研究，提供充分的試驗圖譜和數據，可結合其它研究工作（例如合成工藝路線的確定）以進一步推論化合物的結構。,(三) 對特殊化學結構藥品結構確證的要求,1. 立體異構體藥物,立體異構體： 光學異構體 a.

13、對映異構體 b. 非對映異構體 幾何異構體（順、反異構體）,手性藥物-絕對構型和相對構型 a. 單一對映體-絕對構型 比旋度測定 手性柱色譜 (手性HPLC和GC) 核磁共振 單晶X-衍射 圓二色譜 旋光光譜,b. 消旋體-有多個手性中心時要求確定相對構型; c. 立體異構混合物-確定異構體的組成和比例;,“手性藥物申報資料及審評要點” (藥審中心), 應注意確證產品的立體構型?？筛鶕中灾行牡亩嗌佟⑽墨I數據是否充足、對照品的有無來選擇合適的確證的方法，必要時可采用單晶X射線衍射進行確證。 比旋度是必須的檢測項目之一，已知的起始原料的構型和化學合成方法的立體選擇性也可作為依據之一。,2. 具有

14、多晶型的藥物,晶型: 是指結晶物質晶格內分子的排列形式。 多晶型物質晶格內部分子間力的差異可能引起藥物各種理化性質的變化， 主要對熔點、溶解度及溶出速率、穩(wěn)定性、有效性的影響。,重點： 以適宜的方法獲得藥物晶型的數據。 常用方法： 粉末X-衍射法 紅外吸收光譜法 熔點 熱分析 光學顯微鏡, 創(chuàng)新藥物 a. 不同結晶條件下（溶劑、溫度、結晶速率等）晶型的一致性； b. 不同晶型是否影響藥物活性和毒性等;, 結構已知的仿制藥品 a. 力求與被仿制品保持一致； 特別是被仿制藥為晶型選擇性藥物，且各晶型的理化性質及生物藥劑學性質有明顯差異的仿制藥品，要重點確定與被仿制品種晶型的完全一致性（熔點、紅外吸

15、收光譜、粉末X射線衍射圖等)。 b. 重點關注難溶性固體口服制劑晶型的研究；,3. 合成多肽類藥物,氨基酸分析（證明多肽的組成是否正確）； 質譜測定（提供相對分子質量及序列的信息）； 序列分析以及肽圖測繪等； 紫外：對具有生色團結構的小肽有一定的測試意義； 紅外：適用于小肽（含三個氨基酸的肽）、擬肽等； 核磁共振：可對小肽的結構提供部分信息； 其他方法： HPLC、比旋度測定等。,藥物結構中有半胱氨酸，應明確其狀態(tài)（氧化態(tài)或還原態(tài)）； 藥物結構中存在二硫鍵，應明確二硫鍵的正確連接點； 結合合成工藝對中間體的研究，對終產品的結構進行確證。,4. 多糖類藥物,多糖結構的描述包括: 多糖的分子量范圍

16、； 多糖的單糖組分； 單糖的連接點類型； 單糖和糖苷鍵的構型； 重復單位;,確證方法： 單糖的分離、鑒定：紙色譜法、TLC、HPLC、氣-質聯用技術等； 多糖的相對分子量及分子量分布測定：凝膠色譜法； 糖苷鍵的連接方式及糖苷鍵的位置：紅外、核磁共振、化學反應后產物的分析等；,5. 多組分藥物,明確各組分的組成比例，對影響藥效和毒性的主要成分進行結構確證。 可使用經典的提取方法或其它分離技術，如制備色譜（TLC，HPLC），分離得到主要藥效成分單體，按單體項目要求進行化學結構確證。 在組分多，含量少，難于得到單體時，可使用聯機分析技術，如氣一質聯用（GCMS），液質聯用（LCMS），氣付利葉紅外

17、聯用（GCFTIR），質質聯用（MSMS），輔助組分結構的驗證及定量分析。,6. 不含金屬元素的有機鹽類或復合物,應同時提供成鹽前后的兩套波譜和試驗數據。 對于某些波譜測定有困難或不易說明其結構的鹽或復合物，可測定藥物酸根或堿基的波譜，并結合其他試驗項目進行確證。,7. 金屬鹽類和絡合物,除通常要求的各項測試外，還應提供確證分子中金屬元素的種類、存在形式和含量的有關圖譜和分析數據。 不適于或不能測試金屬鹽本身的項目，可以用成鹽前的酸分子或配位體的相應測試結果進行佐證。,8. 半合成化合物,分子母核的結構為已知并可以確證其原分子母核結構在合成過程中未發(fā)生改變的，可適當簡化對母核部分結構的確證工作

18、。重點對新引入基團進行結構確證，可以結合原料結構和合成路線進行論證和說明。 如涉及構型確證，若母核手性中心構型沒有改變時，重點在于側鏈和取代基中新引入手性中心的構型確定。,綜合解析舉例,FABMS,22 mu,M+H,M+Na,1,2,3,6,4,5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,1,2,3,6,4,5,7,8,9,10,11,12,13,14,CH,CH2,OCH3,1,2,3,6,4,5,7,8,9,10,11,12,13,14,1,2a,2b,3,4,5,9,10,11,13,14,7,8,6,1,2a,2b,3,4,5,9,10,11,13,14,7,8,6,1,2a

19、,3,8,6,4,5,2b,9,7,11,10,14,13,1,2,3,6,4,5,7,8,9,10,11,12,13,14,15,1,2a,2b,3,4,5,9,10,11,13,14,7,8,6,申報資料的格式和內容,一. 新藥的化學結構式、分子式及分子量 二. 供確認化學結構用供試品的純度及檢查純度的方法 三. 確證化學結構的方法 理化常數 元素分析 四. 各項波譜和測試的技術要求 紫外吸收光譜 紅外吸收光譜 核磁共振氫譜 核磁共振碳譜 質譜 差熱分析 X-射線衍射譜 綜合解析 五. 參考文獻,一. 新藥的化學結構式、分子式及分子量,二. 供確認化學結構用供試品的純度及檢查純度的方法,三

20、. 確證化學結構的方法,2 元素分析,主要應用： 確定元素組成、分子式; 除氧元素外，其余各種元素一般均能準確測定其含量。 可以反映結晶水/結晶溶劑、成鹽化合物的酸根和堿基等。 C、H、N元素可采用自動元素分析儀測定，其他元素可采用適宜的物理或化學方法測定。,技術要求： a. 應詳細說明使用儀器、測定方法及條件。特別是對測試樣品的預處理方法、條件。 b. 同一樣品測定兩次，兩次實驗數據同時列出，不取平均值。 c. 應給出計算理論值所依據的分子式，包括結晶水（或結晶溶劑) 。列表比較實測值與理論值（一般要求誤差不超過0.3），初步判定供試品與目標化合物的分子組成是否一致。 d. 附測試報告單的復

21、印件。,儀器型號與測定條件 儀器：Carlo-Erba 1106元素分析儀(意大利) 測定條件：1050催化燃燒 載氣：N2 氧瓶法測定 測定結果與解析 測定結果：樣品測定結果與對照品測定結果見附表1。 結果解析：樣品與對照品的實測值同理論計算值基本相符，C、H、N、的誤差均在千分之五以內，同含5個結晶水的鹽酸大觀霉素分子式C14H24ClN2O72HCl5H2O符合。 表1 樣品（020708）與對照品（DJS）的元素分析數據,(四)各項波譜和測試的技術要求,1. 紅外吸收光譜(IR), 基本原理： 分子中化學鍵振動能級的躍遷。 主要應用： a.鑒定化合物的結構 有對照品、標準圖譜 b.推測

22、化合物的結構 確定特征官能團、區(qū)分晶型等,技術要求： a. 按藥典規(guī)定方法校正和檢定儀器； b. 正確選擇測試方法和條件 固體樣品首選溴化鉀壓片法； 離子交換-氯化鉀壓片； 晶型變化-糊法； c. 準確、合理、充分的圖譜解析; d. 按要求格式列表和撰寫資料;,儀器型號與測試 儀器：Nicolet Impact-400型紅外分光光度計 儀器測試：用聚苯乙烯膜 儀器的測定條件 測定條件：樣品測定用溴化鉀壓片法 測定圖譜：圖1、2 附圖3： 聚苯乙烯膜紅外吸收光譜。, 資料撰寫格式 儀器 測試條件 儀器校正和檢定 數據表 解析,2. 紫外吸收光譜(UV),基本原理：電子躍遷 主要應用：推測共軛體系

23、的骨架結構（發(fā)色團、助色團） 紫外光譜定性 吸收系數定量,技術要求 a. 按藥典規(guī)定方法校正和檢定儀器； b. 通常要求三種溶劑：中性、0.1N HCl 、0.1N NaOH； c. 要求定量，準確計算摩爾吸收系數； d. 歸屬主要吸收譜帶； e. 數據列表說明；, 資料撰寫格式 儀器 測試條件 儀器校正和檢定 數據表 解析,3.核磁共振氫譜(1H-NMR),基本原理： 利用原子核的核自旋現象，通過一定振動頻率的電磁波照射時，原子核吸收電磁波從低能態(tài)向高能態(tài)躍遷，即核磁共振。 主要應用 可提供供試品中氫原子數目、周圍化學 環(huán)境、相互間關系、空間排列等信息。,技術要求 a. 應使用200MHz以

24、上高分辨NMR儀。 b. 對各項測試條件應有明確、詳盡的說明，如儀器型號、規(guī)格、溶劑、內標。 c. 對分子中全部H原子均要有明確的解析和歸屬。 d. 對復雜結構化合物，應考慮采用合適的其它技術加以佐證。, 資料撰寫格式 儀器 溶劑、內標 給出原子編號的分子結構式 數據表 (如有對照品或文獻數據可以對比列入表中) 解析,4.核磁共振碳譜(13C-NMR),基本原理： 利用原子核的核自旋現象，通過一定 振動頻率的電磁波照射時，原子核吸收電 磁波從低能態(tài)向高能態(tài)躍遷，即核磁共振。 主要應用: 可提供供試品中碳原子的數目、所處的 不同化學環(huán)境信息。,技術要求 a. 對各項測試條件應有明確、詳盡的說明，

25、如儀器型號、規(guī)格、溶劑、內標。 b. 在圖譜復雜時，應使用質子噪聲去偶或偏共振去偶技術，使圖譜簡化。 c. 對分子中全部C原子均要有明確的解析和歸屬。 d. 對復雜結構化合物，可與類似結構化合物的化學位移進行計算比較，確定合理結構。, 資料撰寫格式 儀器 溶劑 給出碳原子編號的分子結構式 數據表 (如有對照品或文獻數據可以對比列入表中) 解析,5. 其他核磁共振譜,DEPT譜:可區(qū)分碳原子的類型; 1H1Hcosy: 可以顯示相隔23鍵相互之間存在偶合的質子對信息; C- Hcosy (HMQC ,異核多量子相關譜): 可以了解分子中C-H聯結情況;,HSQC (異核單量子相關譜):用于測定1

26、H-13C相關信息，可以直接明確C、H之間的連接關系; HMBC (異核多重鍵相關譜):可以顯示1H、13C 之間遠程偶合的信息，即相隔二鍵和三鍵的1H、13C之間相關信號;解析化合物中存在的結構單元，推測化合物中各官能團、結構單元之間的連接關系; 19F、31P等:可提供相應元素的種類及數目、在分子中所處的化學環(huán)境等信息;,常用的二維核磁共振測試包括H-Hcosy（H-H Correlated spectroscopy）、HMBC（1H-detected multiple-bond heteronuclear multiple-quantum coherence）、HMQC（1H-detec

27、ted heteronuclear multiple-quantum coherence）等，對于結構復雜或用一般NMR方法難以進行結構確證的化合物，進行二維譜測試可更有效地確證藥物的結構。,碳譜注意點：,1. 碳信號數目比實際的少，原因可能為信號重疊，或有些季碳信號弱，或隱藏在溶劑信號內； 2. 碳信號數目比實際的多，原因可能是某些化合物存在構象異構。,分子式：C44H69NO12.H2O,結構式為C44H69NO12，在其13C全去偶譜中應顯示44個峰，但實際顯示多達83個峰，這是因為在溶劑中有兩種構像,一種為優(yōu)勢一種為劣勢，（文獻報道在氯仿中比例為3:1）,6. 質譜(MS),基本原理：

28、 將氣體分子經電子流轟擊,使分子中的電子成為帶正電荷的分子離子,而后裂解成一系列的碎片離子,再通過磁場使不同質荷比的正離子分離并記錄其相對強度,畫出質譜圖。,主要應用： 提供分子離子峰、碎片峰、豐度等信息，可以確定分子量、分子式以及推測部分結構單元。 對含有同位素元素(如Cl、Br等)的藥物,利用同位素簇的豐度比，可推斷藥物中部分元素的種類、數量，乃至分子式、裂解方式等。,技術要求: a. 應盡量設法獲得化合物分子離子峰。當用EI法不能出現分子離子峰時，可試用其它電離源，如CI，FAB，FI，FD，ESI等。 b. 所獲數據按規(guī)定列表，并對重要的碎片離子峰的產生進行解釋，提供離子裂解圖。 c. 高分辨質譜不能反映藥品的純度和結晶水，結晶溶劑，殘留溶劑的情況。, 資料撰寫格式 儀器 測試條件 數據表 裂解圖 解析,7. 熱分析,基本原理： 采用程序控溫下，精確記錄待測物質理化性質與溫度的關系，研究其受熱過程中晶型轉變、熔融、升華等物理變化和脫水、熱分解、氧化、還原等化學變化。,主要應用： 差示掃描量熱法（DSC): 測定熔點、結晶水/結晶溶劑、考察晶型等。 熱重法（TGA): 測定結晶水、吸附水和結晶溶劑、分解溫度等。,技術要求： a.