有機(jī)波譜分析課件一.緒論P(yáng)PT課件.ppt

1、波譜分析,2011年秋季應(yīng)化選修課,緒 論,隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新的儀器分析方法不斷出現(xiàn)，應(yīng)用也越來越廣泛。近二十年來，紫外或紫外-可見光譜，紅外光譜，核磁共振波譜以及質(zhì)譜等構(gòu)成現(xiàn)代儀器分析的重要內(nèi)容。 這些方法與經(jīng)典的分析方法相比不僅具有快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，還具有樣品用量少，不破壞樣品等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為化學(xué)工作者測定有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)及定性、定量不可缺少的重要手段之一。 人們通常將UV（UV-vis），IR，NMR和MS稱為“波譜分析”，也有稱為有機(jī)儀器分析。,一波譜分析的發(fā)展 由于近代物理學(xué)，電子學(xué)和計(jì)算機(jī)的發(fā)展，產(chǎn)生了許多新的儀器分析方法，如變換紅外光譜法，脈沖變換核磁共振，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

2、等大型精密儀器并已應(yīng)用于科研和生產(chǎn)中。 儀器實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化、數(shù)字化、計(jì)算機(jī)化。 電子計(jì)算機(jī)提高了儀器分析的靈敏度、準(zhǔn)確度和分辨率，并可進(jìn)行連續(xù)自動(dòng)分析、自動(dòng)檢索等。 各種分析方法互相滲透，聯(lián)用。如：具有高度分離能力的氣相色譜、液相色譜與具有強(qiáng)的鑒別能力的質(zhì)譜，紅外光譜聯(lián)用，可以達(dá)到快速剖析樣品，分析的目的。,二波譜分析的內(nèi)容： 波譜分析主要包括：UV，IR，NMR和MS。由于近年來有機(jī)化學(xué)的快速發(fā)展，要求先進(jìn)的分析方法跟蹤反應(yīng)過程，確定化合物結(jié)構(gòu)以及定性、定量分析，因而自然地形成了波譜分析的分析方法。 三波譜分析的特點(diǎn)： 快速：獲得正確的情報(bào)比經(jīng)典化學(xué)分析方法快得多。 樣品用量少：一般只需幾微克

3、到幾十毫克（一般5-20mg）。 準(zhǔn)確、重復(fù)性好。,有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)鑒定 與有機(jī)波譜學(xué),結(jié)構(gòu)鑒定:,紫外可見光譜 (UV-VIS); 紅外（拉曼）光譜 (IR，Raman); 質(zhì)譜 (MS); 核磁共振譜 (NMR); X線衍射; 折射率; 電誘導(dǎo)率; 熔點(diǎn); ,UV -VIS ; IR(Raman); MS; NMR,有機(jī)波譜學(xué)：,波譜分析法被廣泛地應(yīng)用于各科研生產(chǎn)中，本?；瘜W(xué)化工學(xué)院實(shí)驗(yàn)室具有： HP6890/5973 GC/MS 產(chǎn)于美國PE公司 GC-14B 產(chǎn)于日本島津公司 HPLC 產(chǎn)于美國Waters公司 FT-IR 產(chǎn)于美國PE, 伯樂公司 UN-Vis 產(chǎn)于日本島津公司,諾貝爾

4、化學(xué)獎(jiǎng)享有世界最高榮譽(yù)，設(shè)有物理、化學(xué)、生物或醫(yī)學(xué)、文學(xué)和和平五項(xiàng)獎(jiǎng)。1901年，瑞典皇家科學(xué)學(xué)院成立，根據(jù)諾貝爾遺愿，諾貝爾獎(jiǎng)金委員會(huì)首次頒獎(jiǎng)。截止到2003年，諾貝爾獎(jiǎng)的頒發(fā)已有一百多年的歷史了。期間共頒發(fā)化學(xué)獎(jiǎng)94次，8年因第一、二次世界大戰(zhàn)末頒獎(jiǎng)。,波譜分析與諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng),從最近幾十年來諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)?lì)C獎(jiǎng)的情況來看，化學(xué)科學(xué)逐漸出現(xiàn)了和生命科學(xué)相融合的趨勢(shì)。在20世紀(jì)的最后25年里，諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)有三分之一左右給予化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域研究的成果。其中大部分獲得項(xiàng)目往往直接或間接地在波譜分析方面獲得了突破.如：2002年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)由在質(zhì)譜和核磁共振這兩個(gè)重要領(lǐng)域的科學(xué)家們分享。獲獎(jiǎng)?wù)撸|(zhì)譜

5、領(lǐng)域的JohnBFenn 和KoIchi Tanaka(田中耕一)，核磁共振領(lǐng)域的Kort Wuthrich，對(duì)生物化學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展作出了貢獻(xiàn)。 把波譜分析測試手段和設(shè)計(jì)合成方法應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域中的物質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)的分析、新物質(zhì)的設(shè)計(jì)與合成以及生命活動(dòng)的反應(yīng)機(jī)理的研究，將化學(xué)科學(xué)理論、技術(shù)和生命科學(xué)技術(shù)、應(yīng)用逐步融合，將是未來一個(gè)非常重要的趨勢(shì)和這兩個(gè)學(xué)科發(fā)展的必然導(dǎo)向。,質(zhì)譜是根據(jù)質(zhì)量迅速鑒定一個(gè)物質(zhì)。這一技術(shù)很久以來被化學(xué)家們用來分析小分子和中等大小的分子，這個(gè)方法非常靈敏，以至于每種含量極微的分子都有可能被檢測到。毒品和藥物的檢測、食品控制和環(huán)境分析等都是目前常規(guī)使用質(zhì)譜技術(shù)的領(lǐng)域。

6、,質(zhì)譜鑒定分子的方法,質(zhì)譜技術(shù)早在十九世紀(jì)末就出現(xiàn)了，最早用于小分子分析是由 Joseph J. Thompson 在1912年報(bào)道的。二十世紀(jì)有許多諾貝爾獎(jiǎng)直接依賴于質(zhì)譜分析。例如，Harold Urey 發(fā)現(xiàn)氘(獲得1934年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng))，富勒烯，“足球碳”的發(fā)現(xiàn)使Robert Carl, Sir Harold Kroto和 Richard Smalley 獲得1996年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。,將質(zhì)譜用于大分子分析這一目標(biāo)同樣長期吸引著科學(xué)家們。二十世紀(jì)70年代，在氣相中將大分子轉(zhuǎn)化為離子獲得了許多成功，這種技術(shù)稱為“解吸”技術(shù)，形成了在過去二十年里這一領(lǐng)域革命的基礎(chǔ)。大分子相對(duì)于其它分子來說或

7、許是大的，但是在這里我們還是認(rèn)為它具有小的不可思議的結(jié)構(gòu)。例如血紅蛋白分子，它的質(zhì)量是10-19克，如何去稱這么小的重量。秘訣就是使單個(gè)的蛋白質(zhì)分子與其它分子分離，擴(kuò)散成一簇自由飛行、帶電的蛋白質(zhì)離子。接下來測量這些離子的質(zhì)量并因此而鑒定這個(gè)蛋白質(zhì)的常用方法是讓它們?cè)谝粋€(gè)真空室內(nèi)加速并測量它們的飛行時(shí)間。它們按順序到達(dá)目的地，這一順序是由它們的電荷和它們的質(zhì)量決定的，最快到達(dá)的是那些最輕的，帶有最高電荷的離子。,目前，有兩種原理可以使蛋白質(zhì)在不破環(huán)結(jié)構(gòu)和構(gòu)型的狀態(tài)下轉(zhuǎn)移到氣相，正是這些方法背后的發(fā)現(xiàn)將要共同獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)金的一半。 其中一個(gè)由John BFenn發(fā)明的方法中，樣品由很強(qiáng)的電場

8、導(dǎo)致噴霧并產(chǎn)生小的，帶電荷的自由飛行的離子。 另一種方法是用一束強(qiáng)激光脈沖使樣品離子化。如果處在合適的條件下(如能量，樣品的結(jié)構(gòu)和化學(xué)環(huán)境)，分子吸收部分激光脈沖能量并成為自由離子被釋放。第一個(gè)表明這種“軟激光解吸”現(xiàn)象可能被用于分析蛋白質(zhì)這樣的大分子的是KoIchi Tanaka。,在1988年，John BFenn發(fā)表了兩篇有關(guān)大分子的電噴霧現(xiàn)象的論文，對(duì)質(zhì)譜技術(shù)具有突破性意義。在第一篇論文里，對(duì)未知質(zhì)量的聚乙二醇的分析表明這一方法可以使大分子帶高電荷。第二篇文章報(bào)道了用這一方法分析中等大小的完整蛋白質(zhì)。離子的產(chǎn)生是通過電場使樣品噴霧形成帶電液滴，隨著水分子逐漸從液滴蒸發(fā)，僅留下“光禿禿”

9、自由飛行的蛋白質(zhì)分子。這一方法被稱為電噴霧離子化(ESI)。 當(dāng)分子帶有很強(qiáng)的電荷時(shí)，質(zhì)量電荷比變得很小，這樣該物質(zhì)就可以用普通的質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。另一個(gè)好處是同一個(gè)分子會(huì)產(chǎn)生一系列峰，因?yàn)槊恳粋€(gè)峰都帶有不同數(shù)目的電荷。雖然這一復(fù)雜的譜圖在最初使研究者深感迷惑，但它給出的信息使鑒定更容易了。,John BFenn的貢獻(xiàn)：(通過噴霧飛行),與此同時(shí)，在日本京都島津儀器公司，一個(gè)年輕的日本工程師報(bào)道了一種完全不同的技術(shù)進(jìn)行了這一研究。即在1987年的一個(gè)討論會(huì)及1988年發(fā)表的論文中，表述了蛋白質(zhì)分子應(yīng)該可以通過軟激光解吸(SLD)的方法被離子化。一束激光脈沖打在樣品上，與噴霧的方法不同樣品是處在固

10、相或粘液相中，當(dāng)樣品從激光脈沖中吸收能量，被爆破成很小的單位，分子一個(gè)接一個(gè)被釋放，以帶低電荷的完整的分子離子形式飛行，這些離子被一個(gè)電場加速并用上面提到的記錄它們的飛行時(shí)間的方式檢測。Tanaka第一個(gè)報(bào)道了激光技術(shù)對(duì)生物大分子分析應(yīng)用的可能性。這一原理是今天多種有力的激光解吸方法的基礎(chǔ)，特別是簡稱為MALDI(基質(zhì)輔助激光解吸離子化)，SELDI(表面增強(qiáng)激光解吸離子化)，DLOS(直接芯片離子化)的技術(shù)。,Tanaka的貢獻(xiàn)：(通過爆破飛行),質(zhì)譜能夠回答諸如“是什么”和“有多少種”蛋白質(zhì)這樣的問題，而核磁共振則回答這種蛋白質(zhì)“是什么樣子”的問題。 對(duì)任何一種顯微鏡而言，即使是最大的蛋白

11、質(zhì)都顯得太小而不能獲得足夠的分辨率。因此，要想能夠獲得一個(gè)蛋白質(zhì)真正的圖像，必須采用其他手段。核磁共振就是這樣一種方法。通過對(duì)核磁共振譜圖中的譜峰進(jìn)行解釋，人們可以得到所研究的分子的三維結(jié)構(gòu)。核磁共振所用的樣品是處于溶液狀態(tài)，類似于蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境。,核磁共振在生物大分子中的應(yīng)用,早在1945年，物理學(xué)家 Felix 和Edward Purcell 就發(fā)現(xiàn)把有些原子核放在強(qiáng)磁場下，由于所謂核自旋的作用，它們能夠吸收特定波長的電磁波，即發(fā)生共振。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)使他們贏得了1952年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。 隨后，人們發(fā)現(xiàn)核共振的頻率不僅依賴于磁場的強(qiáng)度和原子類別，還依賴于原子所處的環(huán)境。而且，不同核的核

12、自旋能夠相互影響，從而產(chǎn)生精細(xì)結(jié)構(gòu)，即在核磁共振譜圖中產(chǎn)生更多的譜峰。最初，核磁共振的應(yīng)用受到其低靈敏度的限制，因而需要濃度極高的樣品。 但是在1966年，瑞士化學(xué)家Richard Ernst(1991年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主)認(rèn)為，如果用非常短而強(qiáng)的射頻脈沖來照射樣品，以取代緩慢改變照射頻率的方法，將會(huì)極大地提高靈敏度。在上世紀(jì)70年代，他還在發(fā)展核磁共振方法學(xué)上作出了貢獻(xiàn)，如尋找怎樣確定分子中相鄰核(例如由化學(xué)鍵相連的原子)的方法。,通過對(duì)核磁共振譜圖中的信號(hào)進(jìn)行解釋，人們能夠獲得分子結(jié)構(gòu)的信息。這種方法被成功地應(yīng)用于小分子。但對(duì)大分子而言，要想將不同原子核的共振信號(hào)區(qū)分開來是非常困難的。一張大

13、分子的核磁共振譜圖有數(shù)千個(gè)譜峰，看起來就象一片片的草坪，根本不能確定哪個(gè)峰屬于哪個(gè)原子。最終解決這個(gè)問題的科學(xué)家是瑞士的化學(xué)家Kurt Wuthrich。,在20世紀(jì)80年代初，Kurt Wuthrich發(fā)展了一套怎樣將核磁共振方法延伸到生物大分子領(lǐng)域的思路。他發(fā)明了一套系統(tǒng)方法：將每一個(gè)核磁共振信號(hào)與大分子中的氫核(質(zhì)子)一一對(duì)應(yīng)起來。這種方法叫做“序列指認(rèn)”，目前已經(jīng)成為所有核磁共振結(jié)構(gòu)研究的基石。他還指出了怎樣能夠在大量質(zhì)子中確定每一對(duì)質(zhì)子間的距離。利用這些信息，通過基于距離幾何的一種數(shù)學(xué)方法，就能夠計(jì)算分子的三維結(jié)構(gòu)。1985年，利用Kurt Wuthrich 的方法確定了第一個(gè)蛋白質(zhì)

14、的結(jié)構(gòu)。到目前為止，在上萬個(gè)已知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，有大約1520的結(jié)構(gòu)是由核磁共振方法確定的。其他的結(jié)構(gòu)則主要是由X-射線晶體學(xué)方法確定的，只有很少幾個(gè)是由其它方法如電子衍射或中子衍射確定的。,Kurt Wuthrich使核磁共振應(yīng)用于蛋白質(zhì)成為可能,在許多方面，核磁共振都能對(duì)X射線晶體學(xué)結(jié)構(gòu)測定進(jìn)行補(bǔ)充。如果對(duì)同一種蛋白質(zhì)用兩種方法進(jìn)行研究，一種在溶液狀態(tài)，一種在結(jié)晶狀態(tài)，通常可以得到相同的結(jié)果，只是在一些受環(huán)境影響的表面區(qū)域二者有不同。 在溶液中進(jìn)行研究就意味著可以模擬生理?xiàng)l件。核磁共振的一項(xiàng)特殊能力就是可以研究分子中無結(jié)構(gòu)的和非?；顒?dòng)的部分，因而可以闡明分子的運(yùn)動(dòng)性、動(dòng)力學(xué)以及這些特性在蛋

15、白質(zhì)鏈中各部分的差異。對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行穩(wěn)定同位素標(biāo)記也有助于確定分子結(jié)構(gòu)。用核磁共振確定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一個(gè)例子就是：與一系列危險(xiǎn)疾病(如瘋牛病)的發(fā)展相關(guān)的阮病毒蛋白(Stanley Prusiner 因此獲得1997年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng))。和他的同事們利用核磁共振對(duì)該蛋白的研究結(jié)果表明，正常形態(tài)的阮病毒蛋白由兩部分構(gòu)成。在水溶液中，其中大約一半的蛋白鏈形成一個(gè)有序的、相當(dāng)剛性的三維結(jié)構(gòu)，而另一半則沒有任何結(jié)構(gòu)而且非?；顒?dòng)。核磁共振還能用來研究其它生物大分子如 DNA和 RNA 的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)。,在制藥工業(yè)中，核磁共振還被用來確定潛在靶蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。新設(shè)計(jì)的藥物分子要能夠與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)相配合，

16、就象鑰匙和鎖那樣。也許核磁共振在工業(yè)中最重要的用途是用來尋找能夠與指定生物大分子相互作用的潛在小分子藥物。如果小分子能夠與大分子作用，那么大分子的核磁共振譜圖通常就會(huì)發(fā)生變化。用這種方法可以在新藥研發(fā)的早期對(duì)大量的候選藥物分子進(jìn)行“篩選”。,第一章 分子光譜概述,光譜分析法 因光的作用引起被照物體內(nèi)分子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)發(fā)變化，并產(chǎn)生特征能態(tài)的躍遷進(jìn)行分析的方法。,光譜分析的分類 吸收光譜法（IR, UV, AAS） 發(fā)射光譜法（FS, ICP-AES） 散射光譜法（Raman）,1、原子吸收光譜與原子發(fā)射光譜法,原子吸收光譜法 (AAS)是利用氣態(tài)原子可以吸收一定波長的光輻射，使原子中外層的電子從基態(tài)

17、躍遷到激發(fā)態(tài)的現(xiàn)象而建立的。,原子發(fā)射光譜法是根據(jù)處于激發(fā)態(tài)的待測元素原子回到基態(tài)時(shí)發(fā)射的特征譜線對(duì)待測元素進(jìn)行分析的方法，包括三個(gè)主要的過程，即： 1） 由光源提供能量使樣品蒸發(fā)、形成氣態(tài)原子、并進(jìn)一步使氣態(tài)原子激發(fā)而產(chǎn)生光輻射； 2） 將光源發(fā)出的復(fù)合光經(jīng)單色器分解成按波長順序排列的譜線，形成光譜； 3）用檢測器檢測光譜中譜線的波長和強(qiáng)度。原子發(fā)射光譜可對(duì)樣品進(jìn)行定性分析和定量測定。吸收光譜儀則不能。,原子發(fā)射光譜根據(jù)激發(fā)機(jī)理不同，主要有3種類型： 原子的核外光學(xué)電子在受熱能和電能激發(fā)而發(fā)射的光譜，通常所稱的原子發(fā)射光譜法是指以電弧、電火花和電火焰（如ICP等）為激發(fā)光源來得到原子光譜的分

18、析方法。以化學(xué)火焰為激發(fā)光源來得到原子發(fā)射光譜的，專稱為火焰光度法。 原子核外光學(xué)電子受到光能激發(fā)而發(fā)射的光譜，稱為原子熒光（見原子熒光光譜分析）。 原子受到X射線光子或其他微觀粒子激發(fā)使內(nèi)層電子電離而出現(xiàn)空穴，較外層的電子躍遷到空穴，同時(shí)產(chǎn)生次級(jí)X射線即X射線熒光(見X射線熒光光譜分析)。,2、分子光譜,分子能級(jí)之間躍遷形成的發(fā)射光譜和吸收光譜。 分子光譜非常豐富，可分為純轉(zhuǎn)動(dòng)光譜、振動(dòng) - 轉(zhuǎn)動(dòng)光譜帶和電子光譜帶。 分子的純轉(zhuǎn)動(dòng)光譜由分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)之間的躍遷產(chǎn)生，分布在遠(yuǎn)紅外波段，通常主要觀測吸收光譜； 振動(dòng) - 轉(zhuǎn)動(dòng)光譜帶由不同振動(dòng)能級(jí)上的各轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)之間躍遷產(chǎn)生，是一些密集的譜線 ，分布在近紅外波段，通常也主要觀測吸收光譜； 電子光譜帶由不同電子態(tài)上不同振動(dòng)和不同轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)之間的躍遷產(chǎn)生，可分成許多帶，分布在可見或紫外波段，可觀測發(fā)射光