固相膜免疫技術(shù)ppt課件

1、第十二章固 相 膜 免 疫 測 定,臨床免疫學(xué)和檢驗(yàn),Department of Immunology and Microbiology Yang Hui-jun November 8, 2010,Changsha,China,Solid Phase Memberane-based Immunoassay,一、固相免疫測定,B與F分離,Ab* Ab* Ag + Ag + Ab* Ab Ab,第一節(jié) 概述,二、固相膜的特點(diǎn),多孔性 毛細(xì)管作用 非共價(jià)鍵高度吸附抗體或抗原 高度敏感性 易于漂洗 操作簡便,三、常用的固相膜,玻璃纖維素(fiberglass)膜 尼龍(nylon)膜 聚偏氟乙稀( p

2、olyvinylidene fluoride ，PVDF)膜 硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜,四、固相膜的技術(shù)要求,孔徑：0.20.6m或510m 流速：以ml/cm2/min表示 蛋白質(zhì)結(jié)合力：吸附力很強(qiáng)，以g/cm2表示 均一性,固相NC膜,五、固相微孔膜測定種類,1.斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)(dot immunogold filtration assay, DIGFA) 2.免疫層析試驗(yàn)（immunochromatography assay, ICA） 3.斑點(diǎn)ELISA (dot enzyme linked immunosorbent assay, Dot-ELISA)

3、4.酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(enzyme linked immunospot assay, ELISPOT) 5.免疫印跡法(Immunoblotting Test, IBT) 6.放射免疫沉淀試驗(yàn)(radioimmunoprecipitation assay, RIPA,六、膜固相免疫測定的特點(diǎn),第二節(jié) 免 疫 金 標(biāo) 記 技 術(shù) (Immunogold Labelling Techique,臨床免疫學(xué)和檢驗(yàn),一、概述,1.概念 以膠體金作為標(biāo)記物的免疫檢測技術(shù) 2.類型 免疫金組織化學(xué)技術(shù) 金免疫技術(shù) 金免疫測定技術(shù),二、膠體金基本知識(shí),1.膠體金的制備 (1)在一定濃度的金溶液內(nèi)加入定量的還原

4、劑使金離子變成金原子，形成金顆粒懸液，即膠體金（colloidalgold）,也稱金溶膠（goldsol）。 (2) HAuCl4是主要原料，常用的還原劑有檸檬酸鈉等。良好的膠體金應(yīng)清亮透明，在潔凈的玻璃器皿中可較長時(shí)間保存，加入NaN3防腐,2.四種粒徑膠體金的制備及特性,膠體金粒徑 膠體金特性 （nm） 呈色 max,16 橙色 518nm 24.5 橙紅 522nm 41 紅色 525nm 71.5 紫色 535nm 通過改變檸檬酸鈉的用量可制得不同大小的膠體金顆粒,方 法 金顆粒直徑 白 磷 法 512nm 抗壞血酸法 813nm 枸櫞酸鈉法 1695nm 檸檬酸鈉法 16147nm

5、乙醇-超聲波法 610nm 硼酸鈉法 25nm 鞣酸-枸櫞酸鈉法 15nm,還原劑不同，膠體金顆粒大小及特性不同,膠體金（Colloidal Gold）1560 nm,優(yōu)質(zhì),劣質(zhì),三、免疫金的特性和制備,膠體金可以和蛋白質(zhì)等各種大分子物質(zhì)結(jié)合，在免疫組化技術(shù)中，習(xí)慣上將膠體金結(jié)合蛋白質(zhì)的復(fù)合物稱為金探針。用于免疫測定時(shí)，膠體金多與免疫活性物質(zhì)（Ag或Ab）結(jié)合，這類結(jié)合物常稱為免疫金,膠體金結(jié)合物（Conjugate,四、免疫金（銀）染色（Immunogoldsilver Staining，IGSS,金標(biāo)抗體,待測抗原,金標(biāo)抗體-抗原,銀染液,銀（金標(biāo)抗體-抗原,銀離子的還原劑：對苯二酚 膠體

6、金及銀原子起催化作用,免疫金（銀）染色應(yīng)用,多用于組織化學(xué)檢測 敏感度低于其它標(biāo)記免疫技術(shù)，但經(jīng)銀加強(qiáng)染色后敏感度與熒光免疫技術(shù)和酶免疫技術(shù)相當(dāng) 近年來發(fā)展了不少IGSS方法以替代熒光免疫技術(shù)，可以在普通顯微鏡下進(jìn)行檢測,五、金免疫測定,斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)（Dot Immunogold Filtration Assay ,DIGFA） 金免疫層析試驗(yàn)（gold immunochromatography assay，GICA,1.斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)（DIGFA,原理 硝酸纖維素膜為載體，利用微孔濾膜的吸附性及可濾過性，使抗原抗體反應(yīng)和洗滌在一特殊的滲濾裝置上以液體滲濾過膜的方式迅速完成,DIGF

7、A原理圖,操作示意圖,裝置分解圖,蓋,微孔膜,吸水墊料,底,技術(shù)類型,雙抗體夾心法 包被抗體 待檢抗原 金標(biāo)抗體 間接法 包被抗原 待檢抗體 金標(biāo)抗抗體 競爭法 包被抗原 待檢抗原 金標(biāo)抗體,斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)（DIGFA,技術(shù)要點(diǎn),試劑盒組成 免疫金標(biāo)記物 滲濾裝置（充滿吸水墊料的塑料小盒,盒蓋中央的小孔下面放置一片NC膜,膜上預(yù)包被Ag或Ab斑點(diǎn)） 洗滌液,斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)（DIGFA,2.膠體金免疫層析試驗(yàn),原理 以硝酸纖維素膜為載體，利用微孔膜的毛細(xì)管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端橫向滲移，猶如橫向?qū)游鲆话?，層析過程中在適當(dāng)部位進(jìn)行抗原抗體反應(yīng),膠體金免疫層析試驗(yàn),技術(shù)類型

8、雙抗體夾心法 競爭法 間接法,雙抗體夾心法測抗原,膠體金免疫層析試驗(yàn),ICA間接法測抗體,膠體金免疫層析試驗(yàn),IFA與ICA的比較,GIFA技術(shù)的發(fā)展（間接法測抗體,ICA技術(shù)的發(fā)展,1990年 ABBOTT公司 膠體硒標(biāo)記ICA Unipath公司 CLEARVIEW 立明衣原體 彩色膠乳標(biāo)記ICA ROCHE Cardiac Reader TnT 定量 0.13 ng/ml 合成TnT質(zhì)控點(diǎn),S,C,T C2 C1,測 定 線,對 照 線,半定量測定,金免疫測定方法特點(diǎn),試驗(yàn)所用試劑全部為干試劑，多個(gè)試劑被組合在一個(gè)約6mm70mm的塑料板條上，成為一單一試劑條。 1.吸水材料 2.免疫金

9、復(fù)合物干片（下），硝酸纖維素膜 （上）T：硝酸纖維素膜條包被特異抗體， R：參照區(qū)，包被有抗小鼠IgG,金免疫測定方法評價(jià),簡便、快速、單份測定，立等結(jié)果，除試劑外無需任何儀器，且試劑穩(wěn)定，適合于急診檢驗(yàn)，但不能定量。(point of care test,POCT,金免疫測定應(yīng)用,1.臨床應(yīng)用：定性分析，主要檢測正常體液中不存在的生物活性物質(zhì)，以及正常情況下體液中含量很低而在某些疾病中升高的生物活性物質(zhì)。 （1）傳染病：病毒相應(yīng)抗原、抗體；性病病原體；細(xì)菌；寄生蟲。 （2）激素：生殖標(biāo)志物，如診斷早早孕HCG、檢測排卵的促黃體生成素、促卵泡激素（FSH）等,金免疫測定應(yīng)用,3）心血管?。杭毙?/p>

10、心肌梗死的標(biāo)志物：肌酸激酶的同工酶CK-MB，肌紅蛋白，肌鈣蛋白-T及脂肪酸結(jié)合蛋白質(zhì)（PABP）等；與心血管疾病有重要關(guān)系的D-二聚體（D-dimer） （4）腫瘤：腫瘤標(biāo)志物如前列腺特異抗原（PSA），AFP，CEA，CA125及CA15-3，以及對腸道腫瘤篩查有重要意義的大便潛血免疫檢測（FOB）等 （5）自身免疫?。嚎闺p鏈DNA抗體和診斷甲狀腺自身免疫病的甲狀腺過氧化物酶（TPO）抗體,金免疫測定應(yīng)用,6）毒品檢測：尿液中的可卡因、大麻、嗎啡、海洛因、苯丙胺等。國外報(bào)道有可同時(shí)測7種毒品的GICA。 （7） 其它檢測：C-反應(yīng)蛋白，半定量檢測血清-脂蛋白。 2. 非臨床應(yīng)用： 可用于食

11、品檢測，環(huán)境污染，生物沾染，還可用于生物戰(zhàn)劑的快速檢測，獸醫(yī)學(xué)及法醫(yī)學(xué)等方面檢測,金免疫測定的重點(diǎn)和展望,臨床應(yīng)用的重點(diǎn)應(yīng)放在 （1）急需快速診斷以便進(jìn)行治療的急重癥，如協(xié)助確診急性心肌梗死的急性心梗標(biāo)志物。 （2） 有普查意義的檢查和流行病學(xué)調(diào)查：如各種傳染?。ú《拘愿窝?，艾滋病，性病及其它各種流行病）流行病調(diào)查； （3）某些腫瘤（如前列腺癌，結(jié)腸癌，肝癌，乳腺癌）的普查及預(yù)防檢查； （4）圍產(chǎn)期的健康普查等。 （5）作為快速的初篩普查手段，對陽性和可疑的結(jié)果再進(jìn)一步做更細(xì)的可靠的檢查,金免疫測定今后的發(fā)展,1)全面提高質(zhì)量。突出質(zhì)量控制的保證。 (2)提高檢測的靈敏度。目前檢測的靈敏度都低

12、于相應(yīng)的定量免疫分析，應(yīng)盡量縮小差距。除使用各種優(yōu)質(zhì)的原料，如膜條，高純度高親和力的配體（特別是配伍好的優(yōu)質(zhì)單抗），優(yōu)質(zhì)高比度的標(biāo)記配體以及先進(jìn)的工藝外，還應(yīng)引進(jìn)信號(hào)放大系統(tǒng)，例如生物素-鏈親和素系統(tǒng)，應(yīng)用鏈親和素與生物素結(jié)合的四價(jià)性及極高的親和常數(shù)，可明顯提高靈敏度,金免疫測定今后的發(fā)展,3)實(shí)現(xiàn)半定量和定量化。 (4)檢測多種分析物。同一個(gè)膜上可同時(shí)測定幾種有相關(guān)意義的分析物，如乙型肝炎不同的抗原及抗體。 (5)建立檢測全血的方法。主要針對急重癥快速診斷之用，以減少分離血清的時(shí)間。德國寶靈曼生產(chǎn)的人肌鈣蛋白GICA便采用全血檢測方法。檢測全血的方法對自檢，患者床旁檢查和邊遠(yuǎn)地區(qū)的普查都有實(shí)

13、際應(yīng)用意義,第三節(jié),其他膜免疫測定技術(shù),一、斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn) Dot-ELISA,二、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn) ELISPOT,20世紀(jì)80年代，國外的科研工作者根據(jù)ELISA技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌B細(xì)胞和細(xì)胞因子分泌T細(xì)胞的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(enzyme linked immunospot , ELISPOT,ELISPOT 檢測原理,細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后， 被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。 BCIP/NBT 底物孵育后， PVDF 孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點(diǎn)表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，

14、通過 ELISPOT 酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對斑點(diǎn)的分析后得出結(jié)果,ELISAPOT,ELISPOT結(jié)果判斷,三、免疫印跡法 Western blot,將凝膠電泳與固相免疫測定結(jié)合起來，將經(jīng)電泳分區(qū)的蛋白質(zhì)精確且近似定量地轉(zhuǎn)移到固相載體上如硝酸纖維素膜(NC膜)，并保持其原有的生物活性，再經(jīng)熒光免疫、酶免疫、放射免疫技術(shù)等進(jìn)行測定，可得以定位、定性和定量結(jié)果。實(shí)質(zhì)上分3步驟，即：蛋白質(zhì)組分分離、各組分轉(zhuǎn)印及免疫檢測,免疫印跡法,操作步驟,1.蛋白質(zhì)分離 采用聚丙稀酰胺凝膠電泳(polyacryamide gel electrophoresis, PAGE)進(jìn)行分離。 2.蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印 從凝膠上將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC膜 等固相載體的過程即為