分子遺傳學基因治療

1、基因治療 Gene therapy,一）、基因治療的發(fā)展簡史、概念及背景 （二）、基因治療的基因?qū)胂到y(tǒng) （三）、基因治療的途徑 （四）、基因治療的靶細胞研究 （五）、基因治療在單基因遺傳病、腫瘤和心血管疾病治療上的應(yīng)用 （六）、基因治療面臨的問題和挑戰(zhàn) （七）、基因治療的發(fā)展方向,一）、基因治療的發(fā)展簡史、概念及背景,基因治療的發(fā)展簡史,基因治療的概念,經(jīng)典：針對遺傳病某一基因缺陷，將外源基因?qū)塍w內(nèi)予以矯正； 現(xiàn)在：凡是在基因水平上進行操作而達到治療疾病的所有療法,上世紀九十年代初，一位因ADA(腺苷酸脫氨酶)基因缺陷導致嚴重免疫缺損的四歲女孩，由美國國立衛(wèi)生研究院用ADA基因治療，取得療

2、效?！盎蛑委煛毖芯繜釓拇瞬叭澜纾鸲эA，為保障人類健康展現(xiàn)了美好的前景,截止到2012年1月，基因治療試驗的全球分布,截止到2012年1月，基因治療試驗的國家分布,基因治療的疾病類型,基因治療試驗的臨床階段,1989- 2012年1月，每年全球被批準的臨床數(shù)目,基因治療選用的載體分類,世界第一個基因治療藥物在中國誕生,人民網(wǎng)深圳2003年10月22日15：30急電 正在這里召開的深圳市政府新聞發(fā)布會向世界公布了一項振奮人心的消息：“世界首個基因治療藥物在中國誕生”。 深圳市賽百諾基因技術(shù)有限公司研制開發(fā)的抗癌新藥“重組人p53腺病毒注射液”（商品名“今又生”），10月16日獲得國家儀器

3、藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的新藥證書。這標志著我國在基因治療藥物研制和產(chǎn)業(yè)化方面已達世界領(lǐng)先水平，在國際競爭中搶占了先機。 賽百諾公司負責人說，這種新藥是擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的廣譜腫瘤基因治療藥品，可望明年一月正式上市,根據(jù)靶細胞的類型分類： 1、生殖細胞（germ cell)基因治療： 2、體細胞（somatic cell)基因治療 根據(jù)基因轉(zhuǎn)移的途徑分類： 1、in vivo(活體直接轉(zhuǎn)移或稱一步法） 2、ex vivo(回體轉(zhuǎn)移或稱二步法,基因治療的種類,1、基因置換 基因置換就是用正常的基因原位置換病變細胞內(nèi)的致病基因，使細胞內(nèi)的突變致病基因完全恢復正常狀態(tài)，這種基因治療方法最為理想。但這種方法是

4、建立在同源重組技術(shù)基礎(chǔ)上的，而目前同源重組雖然在技術(shù)上可行，但重組的效率很低，遠沒達到基因治療要求的水平，在臨床試驗上就更無法實現(xiàn)了,基因治療的策略,2、基因修復 基因修復是指將致病基因的突變堿基序列定點糾正，可用來治療點突變導致的疾病。但由于糾錯效率低的原因，實踐中有相當?shù)碾y度,3、基因增補 將目的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，其表達產(chǎn)物能補償缺陷細胞的功能，可用于隱性遺傳病的治療,4、基因失活 利用反義技術(shù)特異性封閉、抑制有害基因表達，可用于一些顯性遺傳病或腫瘤的基因治療,Andrew Z. Fire、Craig C. Mello,1998年Andrew Z. Fire、Craig C. Mello等

5、發(fā)現(xiàn)將很少量的雙鏈RNA注入秀麗線蟲體內(nèi)，即可高效、特異地阻斷/抑制與雙鏈RNA同源的基因表達，其阻斷/抑制率比純化后的反義RNA技術(shù)高若干個數(shù)量級。雙鏈RNA導入細胞后引起與該段RNA同源的mRNA發(fā)生特異性降解，進而使相應(yīng)基因抑制的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象稱RNA干擾,雙鏈RNA特異性核酸內(nèi)切酶（dsRNA-specific endonuclease，Dicer）切割，形成21-23nt的雙鏈短干擾RNA（short-interference RNA，siRNA）， siRNA鏈為5端磷酸化，3端有二個堿基以非配對方式懸垂,siRNA與由蛋白及酶類組成的RNA誘導沉默復合體（RNA-Induce

6、d Silencing Complex，RISC）結(jié)合后，由于RISC具有解旋酶活性， siRNA中的正義鏈和反義鏈解旋、解鏈。隨后正義鏈被降解，而與RISC結(jié)合的反義鏈則按照堿基互補配對原則與靶mRNA中的同源序列結(jié)合，并由RISC發(fā)揮核酸內(nèi)切酶作用，在距siRNA3斷11或12個堿基處切割靶mRNA,倍增放大作用：siRNA一方面可引導RISC特異性切割靶mRNA；另一方面， siRNA還可作為引物與靶mRNA結(jié)合，在RNA依賴性RNA多聚酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）的作用下合成新的ds-RNA，再次經(jīng)Dicer酶切割，形成新的siRNA，并作用

7、于靶mRNA,RNA干擾,微小RNA（microRNA,微小RNA（microRNA）大量存在人類基因組中的非編碼RNA，能特異識別成熟mRNA的3非翻譯區(qū)，抑制mRNA的翻譯。 微小RNA（microRNA）1993 年Lee等在對秀麗線蟲進行突變體的遺傳分析中首次發(fā)現(xiàn)的不能編碼蛋白質(zhì)，但能時序調(diào)控其胚胎后期發(fā)育基因表達的miRNA:Lin一4,2000年Reinhart等在線蟲中發(fā)現(xiàn)了另一 種重要的具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用的miRNA:let一7，后來發(fā)現(xiàn)了大量類似RNA，2001年起統(tǒng)一稱為miRNA,miRNA通常來源于一個大小約為 1000bp的 長鏈RNA初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(Pri一miRNA

8、)，Pri一miRNA分子在細胞核中經(jīng)過雙鏈RNA特異性核酸酶Rnaselll一Drosha的作用形成70-100nt的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA分子(pre一miRNA)。pre一miRNA在轉(zhuǎn)運蛋白一5(Exportin一5)的作用下轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)中，被另一個雙鏈RNA特異性核酸酶Rnaselll一Dicer識別，進一步被切割成長約22nt的小分子RNA，即成熟的miRNA。成熟miRNA在RNA誘導的沉默復合物引導下，當與mRNA完美互補時，miRNA便指導mRNA特異性切割;當兩者沒有足夠的互補性時，miRNA則抑制mRNA轉(zhuǎn)錄后翻譯,隨著人類后基因組計劃的進一步開展，占類基因組90%以上的非編

9、碼序列越來越引起科學家的關(guān)注，據(jù)計算推測，人類基因組可能存在1000多個miRNA基因， 單個miRNA可調(diào)控200多個靶基因，約1/3的蛋白編碼基因受miRNA調(diào)控,miRNA是調(diào)節(jié)真核生物基因表達的天然反義寡核昔酸鏈。研究表明，miRNA參與了生命過程中一系列的重要過程，包括發(fā)育進程、造血過程、器官形成、細胞增殖和凋亡等，與許多疾病的發(fā)生、診斷、治療和預(yù)后密切相關(guān)，miRNA也因而成為當前研究的新熱點,5、免疫調(diào)節(jié) 將抗原、抗體或細胞因子基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，改變其免疫狀態(tài)，達到預(yù)防和治療疾病的目的。如可將白細胞介素-2 （IL-2）導入腫瘤病人體內(nèi)，提高病人（IL-2）的水平，激活體內(nèi)免疫系

10、統(tǒng)的活性,許多腫瘤都能表達一些腫瘤特異的抗原，將這些在正常機體內(nèi)并不表達的腫瘤特異抗原的編碼基因轉(zhuǎn)入腫瘤內(nèi)，制備成腫瘤DNA瘤苗，再導入患者體內(nèi)，通過其在機體內(nèi)的表達可以激發(fā)機體對編碼抗原的免疫反應(yīng)。如黑色素瘤相關(guān)抗原MAGE、在多種腫瘤中表達的癌胚抗原CEA、病毒基因產(chǎn)物HPV-E6、E7等,6、其他方法 增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。如向腫瘤細胞導入單純皰疹病毒胸苷激酶基因，然后給予病人無毒性核苷類似物GCV（甘昔洛韋，ganciclovir）的藥物前體，由于只有含單純皰疹病毒胸苷激酶基因的細胞才能將GCV轉(zhuǎn)化成有毒的藥物，因而腫瘤細胞被殺死，而對正常細胞影響不大,由于基因治療的人體試驗

11、引發(fā)了爭論，為了規(guī)范這一新生事物，使其更好地為人類健康服務(wù)，但同時又在人類倫理學的接受范圍內(nèi)，1975年美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）召集和組織了重組DNA顧問委員會（Recombinant DNA Advisory Committee,RAC）,制定了一系列有關(guān)重組DNA研究的法規(guī)，接著RAC又任命了一個人體基因治療的分委員會（Human Gene Therapy Subcommittee）,并于1985年頒布了一個權(quán)威性的文件，稱為“人體細胞基因治療方案的設(shè)計和提請批準的注意要點”，該文件要點如下,基因治療的守則,1、什么病可以采用基因治療？即被治療的疾病是否嚴重到必須要用這種全新和從未嘗試

12、過的療法？試圖增加一個人的能力而不是治療疾病，將立即被否決,2、該病目前是否有其他治療方法？要求基因治療必須用于目前尚無滿意療法的疾病，在其他所有因素均等同的情況下，基因治療應(yīng)較其他療法更有效,3、根據(jù)已有的實驗室和臨床研究，基因治療對于患者及其子女和接觸者的安全性如何估計？即基因治療的安全性必須有保證,4、根據(jù)已有的實驗室和臨床研究，基因治療的療效預(yù)計將如何？即基因治療的有效性在進行人體試驗前要有足夠的動物試驗證據(jù),5、如果滿意地回答了上述4個問題，那么如何公正地選擇受試者？ 6、如果上述5個問題都有滿意的答案，那么醫(yī)生將如何把基因治療的各種情況恰當正確地告知患者，以及他們將如何表達同意和不

13、同意？即要保證患者的知情同意權(quán),7、在滿意地回答了上述所有問題后，將采取什么步驟來保護接受基因治療患者的隱私權(quán)？ 臨床申請的基因治療方案經(jīng)過審議，如果不符合這些條件，則禁止實施,二）、基因治療的基因?qū)胂到y(tǒng),基因?qū)胂到y(tǒng)（gene delivery system）是基因治療的核心技術(shù)，可分為病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng),1.病毒載體系統(tǒng) 用于基因治療的病毒載體應(yīng)具備以下基本條件： 1).攜帶外源基因并能包裝成病毒顆粒；2).介導外源基因的轉(zhuǎn)移和表達；3).對機體不致病,大多數(shù)野生型病毒對機體都具有致病性。因此需要對其進行改造后才能用于人體。原則上，各種類型的病毒都能被改造成病毒載體。但是由于病

14、毒的多樣性及與機體復雜的依存關(guān)系，人們至今對許多病毒的生活周期、分子生物學、與疾病發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系等的認識還很不全面,從而限制了許多病毒發(fā)展成為具有實用性的載體。近20年來，只有少數(shù)幾種病毒如反轉(zhuǎn)錄病毒（包括HIV病毒）、腺病毒、腺病毒伴隨病毒、皰疹病毒（包括單純皰疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）等被成功地改造成為基因轉(zhuǎn)移載體并開展了不同程度的應(yīng)用,病毒載體產(chǎn)生的原理 病毒載體的產(chǎn)生建立在對病毒的生活周期和分子生物學認識的基礎(chǔ)之上。研究病毒載體首先要對病毒的基因組結(jié)構(gòu)和功能有充分的了解，最好能獲得病毒基因組全序列信息。病毒基因組可分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)。編碼區(qū)基因產(chǎn)生病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白；根據(jù)

15、其對病毒感染性復制的影響，又可分為必需基因和非必需基因。非編碼區(qū)中含有病毒進行復制和包裝等功能所必需的順式作用元件,各種野生型病毒顆粒都具有一定的包裝容量，即對所包裝的病毒基因組的長度有一定的限制。一般來說，病毒包裝容量不超過自身基因組大小的105110?；蛑亟M技術(shù)的發(fā)展使病毒載體的產(chǎn)生成為可能。最簡單的做法是，將適當長度的外源DNA插入病毒基因組的非必需區(qū)，包裝成重組病毒顆粒,然而，這樣的重組病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體有許多缺點。首先，許多野生型病毒通過在細胞中產(chǎn)毒性復制而導致細胞裂解死亡；或帶有病毒癌基因而使細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。因此必須經(jīng)過改造使其成為復制缺陷性病毒并且刪除致癌基因后才能用于基因治療

16、,其次，插入外源DNA的長度受到很大限制，尤其對于基因組本身較小的病毒如腺病毒相關(guān)病毒（AAV，4.7kb）、反轉(zhuǎn)錄病毒（810kb）、腺病毒（36kb），如果不去除病毒基因，可供外源DNA插入的容量就十分小。因此，必須刪除更多的病毒基因以騰出位置插入較大的外源DNA。 為了增加病毒載體插入外源DNA的容量，除了可以刪除病毒的非必需基因外，還可以進一步刪去部分或全部必需基因，這些必需基因的功能由輔助病毒或包裝細胞系反式提供,LTR,gag,pol,env,LTR,長末端 重復序列,調(diào)節(jié)和 啟動轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生病毒 核心蛋白,產(chǎn)生 逆轉(zhuǎn)錄酶,產(chǎn)生病毒 外膜蛋白,包裝信號,以反轉(zhuǎn)錄病毒為例： DNA前病

17、毒的結(jié)構(gòu)特征,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建,常用的是莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMLV)構(gòu)建的各類逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,LTR,gag,pol,env,LTR,長末端 重復序列,調(diào)節(jié)和 啟動轉(zhuǎn)錄,包裝信號,目的基因,標記基因,LTR,gag,pol,env,LTR,Gag蛋白,PoL蛋白,Env蛋白,包裝細胞系,LTR,LTR,靶細胞,目的基因,標記基因,LTR,LTR,目的基因,標記基因,1,2,3,4,5,假病毒顆粒的產(chǎn)生并感染靶細胞,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,重組逆轉(zhuǎn)錄病毒 (核酸部分是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,輔病毒,1）物理方法,1）電穿孔法（electroporotion）將細胞置于高壓脈沖電場中，通過電壓使細胞產(chǎn)生

18、可逆性的穿孔。周圍基質(zhì)中的DNA可滲進細胞，進而表達。 瞬間 細胞 細胞膜核膜通透性增加 高壓脈沖 DNA滲入細胞,2）顯微注射法（microinjection,利用顯微操作把目的基因直接注入靶細胞或細胞核,不需要進行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露基因DNA注入動物肌肉或某些器官組織內(nèi)。 動物實驗表明：接受注射外源DNA的小鼠能夠按其基因編碼合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，并能維持數(shù)月之久。 1.將促進心臟血管生長的基因直接注入實驗鼠的心臟，可使其心臟壁內(nèi)毛細血管增加30%40%； 2.將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細胞，能分泌糖尿病所缺少的胰島素； 3.肌內(nèi)注射凝血因子基因，可產(chǎn)生血友病所需的凝血因子等等,

19、基因直接注射法的優(yōu)點,1.制備具有調(diào)控部件的質(zhì)粒DNA重組體的技術(shù)較容易； 2.排除病毒載體可能潛在的致癌性或其他副作用； 3.導入的基因不需整合即可表達，避免了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導入整合后，一旦發(fā)生副作用不易中止或逆轉(zhuǎn)的缺點； 4.基因直接注射法可反復使用，而病毒載體則可能誘導體內(nèi)免疫應(yīng)答，致使反復治療效果下降,例：轉(zhuǎn)基因動物的制備,重組基因 DNA 微注射 （體外） 小鼠受精卵 回植 假妊娠 仔 鼠 動物模型：轉(zhuǎn)基因鼠 (每個鼠細胞中都含有外源基因，按孟德爾方式遺傳,clone sheep Dolly 體細胞 提取 核 重組細胞 回植 Dolly 卵細胞 去核 細胞,3）微粒子轟擊法,利用亞微

20、粒的鎢和金能吸附DNA，并將其包裹起來形成微粒，通過物理途徑獲得高速度，微粒瞬間既可進入靶細胞，達到轉(zhuǎn)移目的基因的目的，而不損傷靶細胞。 該方法可使目的基因在皮膚、肝、胰、胃及乳腺等細胞中表達,2）化學法,磷酸鈣沉淀法： 目的基因與磷酸鈣等物質(zhì)混合，形成沉淀的DNA微細顆粒，易通過細胞膜進入細胞內(nèi)，并整合到受體細胞基因組中，在適當條件下得以表達,磷酸鈣+DNA 混合微細顆粒 沉淀反應(yīng)2030min 細胞在沉淀物中暴露 524h 方法簡單，但轉(zhuǎn)化效率低,3 脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉。 基本原理:利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可以自動形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細胞一

21、起孵育，即可通過細胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)，并進行表達,人工脂質(zhì)體膜具有如下特點： 與體細胞相容，無毒性和免疫原性 可生物降解，不會在體內(nèi)堆積 可制成球狀(0.0350 m)，包容大小不同的生物活性分子 可帶有不同的電荷 具有不同的膜脂流動性、穩(wěn)定性、及溫度敏感性，能適應(yīng)不同的生理要求,64,脂粒與細胞膜之間四種可能的相互作用形式 1、膜間傳遞 2、吸附 3、細胞吞噬 4、融合,2）受體介導轉(zhuǎn)移技術(shù),將DNA與細胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，可使DNA具有靶向性。這種偶聯(lián)通常通過多聚陽離子（如多聚賴氨酸）來實現(xiàn)。多聚陽離子與配體共價連接后，又通過電荷相互作用與帶負電荷的DN

22、A結(jié)合，將DNA包圍，只留下配體暴露于表面。這樣形成的復合物可被帶有特異性受體的靶細胞吞飲，從而將外源DNA導入靶細胞,受體介導轉(zhuǎn)移技術(shù)示意圖,三)、基因治療的途徑,根據(jù)基因轉(zhuǎn)移的途徑分類： 1、ex vivo(回體轉(zhuǎn)移或稱二步法）將人體細胞從體內(nèi)取出, 基因改造, 再移植到人體中。 2、in vivo(活體直接轉(zhuǎn)移或稱一步法）直接將基因轉(zhuǎn)移到人體中, 如DNA注射,口服, 噴霧等。 有如普通治療藥物, 商業(yè)化發(fā)展方向所在,基因治療的ex vivo 途徑,家族性高膽固醇血癥是由于肝細胞表面低密度脂蛋白（LDL）受體缺乏所致。取出一小部分肝臟，打碎體外培養(yǎng)，用反轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的LDL受體基因轉(zhuǎn)染培

23、養(yǎng)細胞，將整合有LDL受體基因的肝細胞通過門靜脈輸回肝臟,基因治療就向打針和吃藥一樣,基因治療的in vivo 途徑,在大多數(shù)基因治療臨床試驗中，來自患者血液或骨髓的細胞在實驗室中培養(yǎng)。這些細胞被暴露在帶有目的基因的病毒中。病毒進入細胞后，目的基因就成為宿主細胞DNA的一部分。這些細胞在實驗室培養(yǎng)后，通過靜脈注射重新回到患者體內(nèi)。這類基因治療被稱為ex vivo，就是體外的意思。基因是被運送到患者細胞中，但這些細胞存在于患者體外。 在其他研究中，載體被用于將目標基因運送到患者體內(nèi)的細胞中。這種基因治療被稱為“體內(nèi)，in vivo,四）、基因治療的靶細胞研究,基因治療的靶細胞/器官,1. 基因缺

24、陷的細胞: 如受體缺陷細胞, 腫瘤細胞等原位細胞. 2. 廣泛的細胞類型: 造血干細胞 皮膚成纖維細胞 血液淋巴細胞 肌細胞 肝細胞 骨髓基質(zhì)細胞,根據(jù)靶細胞的類型分類： 1、生殖細胞（germ cell)基因治療 2、體細胞（somatic cell)基因治療,1)生殖細胞基因治療：生殖細胞基因治療(germ cell gene therapy)是將正常基因轉(zhuǎn)移到患者的生殖細胞（精細胞、卵細胞、早期胚胎中）使其發(fā)育成正常個體。 由于有著床前診斷技術(shù)，生殖細胞基因治療已無必要,2)體細胞基因治療：體細胞基因治療(somatic cell gene therapy)是指將正?；蜣D(zhuǎn)移到體細胞，或

25、整合到染色體上，或獨立于染色體外，使之表達基因產(chǎn)物，以達到治療目的。這種方法的理想措施是將外源正?；?qū)氚畜w細胞內(nèi)染色體特定基因座位，用健康的基因確切地替換異常的基因，使其發(fā)揮治療作用，同時還須減少隨機插入引起新的基因突變的可能性。對特定座位基因轉(zhuǎn)移，目前還有很大困難,五）、基因治療在單基因遺傳病、腫瘤和心血管疾病治療上的應(yīng)用,遺傳病的治療,遺傳病的治療分為三個層次：（1）生理水平的治療對癥治療 苯丙酮尿癥限制膳食中苯丙氨酸含量 白 化 病戴帽子和墨鏡,2）蛋白質(zhì)水平治療 向病人體內(nèi)補充缺失的蛋白質(zhì)。 如：血友病補充凝血因子。 有時，補充必要的酶也很起作用。纖維性囊泡化病（CF）是美國白色人

26、種中較為常見的遺傳病。病兒從肺、胰腺等處分泌粘液，阻礙呼吸、消化等功能。5歲前可能因呼吸阻礙致死,CF病兒 吸入基因工程法制備的 DNA 酶粉， 癥狀大為改善,3）基因治療 遺傳病的根治應(yīng)該是基因治療，但是基因治療的難度很高。 1990 年第一例基因治療臨床試驗使腺苷酸脫氨酶（ADA）基因進入骨髓細胞，再送回病人體內(nèi)，治療嚴重綜合免疫缺失癥（SCID）獲得初步效果,基因治療的策略,1.替代缺失的基因 （CFTR for CF） 2.正?；蛲庠椿虻漠惓１磉_ (insulin) 3.靶細胞中表達毒素（TK gene） 4.封閉靶細胞中有害基因的表達（antisense） 5.核酶（ribozym

27、e,實施基因治療的必要步驟如下： 找到致病基因 克隆得到大量與致病基因相 應(yīng)的正?；?采取適當方法把正常基因放回 到病人身體內(nèi)去 進入體內(nèi)的正?；驊?yīng)正常表達,腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥,ADA缺乏癥是一種罕見的遺傳病，患者沒有正常的ADA基因，他們的缺陷基因不能產(chǎn)生功能性ADA酶。ADA缺乏的孩子一出生就有嚴重的免疫缺陷，十分容易受感染，有生命的危險。雖然ADA缺乏癥能用PEG-ADA治療，但這種藥物十分昂貴（一年要花60000美元），而且必須通過靜脈注射來維持生命,嚴重聯(lián)合免疫缺失癥（SCID）患兒從出生時起就必須生活在隔離室中,ADA缺乏癥被選為第一個基因治療試驗有以下幾點原因： 這種

28、疾病是由單個基因的缺陷導致的，基因治療成功的可能性高；基因調(diào)控很簡單，總是開啟的狀態(tài)，不像許多其他基因，調(diào)控很復雜 ；ADA的數(shù)量無需精確調(diào)控。即使很少量的酶也能受益，即使數(shù)量很多也能忍受,腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥,1990年9月14日，安德森將經(jīng)過改造的含有健康基因的白細胞輸入因腺苷脫氨酶缺乏造成先天性免疫功能不全，只能生活在無菌的隔離帳里的4歲女孩的左臂靜脈血管，以后的10個月內(nèi)她又接受了7次同樣的治療。1991年1月，另一名患同樣病的女孩也接受了同樣的治療。兩患兒經(jīng)治療后，免疫功能日趨健全，走出了隔離帳，過上了正常人生活，并進入普通小學上學,基因治療遺傳病,繼安德林之后，法國巴黎奈克兒

29、童醫(yī)院的費舍爾博士與卡波博士也對兩例SCID患兒成功地進行了基因治療,基因治療遺傳病,2）、血友病B：是基因治療的模式病種之一。常規(guī)治療以輸血和血制品為主，既會引起嚴重輸血反應(yīng)，還容易感染病毒，此外還因凝血因子在血液中半衰期短，需要經(jīng)常性輸入，不僅不方便而且治療費用昂貴。基因治療為血友病B的治療開辟了一條新的途徑,血友病B是基因治療的理想病種，其發(fā)病的生化和遺傳機制已被闡明，而且hFIX是分泌型蛋白，能在多種組織中被表達、加工和分泌，基因治療的靶組織選擇范圍廣。另外，血友病B的基因治療對靶細胞表達量的要求不高，只要達到正常人hFIX血漿濃度的10%（約500ng/mL）左右，就能治愈患者凝血功

30、能的缺陷，同時血友病B有基因剔除的動物模型，有成熟的hFIX表達量和凝血活性的測定方法，便于進行基因治療的療效評價,目前，血友病B的基因治療取得了一定的進展，但在大動物和人體試驗的結(jié)果還不夠理想，需進一步提高hFIX的表達水平以提高治療的有效性和安全性,2、腫瘤基因治療,腫瘤基因治療是通過將外源基因?qū)肽康募毎⒂行П磉_從而達到治療腫瘤的目的。按目的基因的功能分為以下幾種,1）、抑癌基因的導入和癌基因的反義核酸導入療法 腫瘤形成的分子機制涉及到癌基因的激活和抑癌基因的失活。 近年來相繼克隆了Rb、p53、NF1、DCC、ERBA、APC、MTS等抑癌基因。 Rb基因缺陷會導致視網(wǎng)膜母細胞瘤、小

31、細胞肺癌和膀胱癌等腫瘤，將正常的Rb基因?qū)胍暰W(wǎng)膜母細胞瘤中，該細胞將失去致瘤能力,在超過50%的腫瘤中都發(fā)現(xiàn)有p53基因的突變。將野生型p53基因轉(zhuǎn)染腫瘤細胞，腫瘤細胞會發(fā)生凋亡，在動物體內(nèi)致瘤能力下降。Clayman等采用腺病毒攜帶p53基因治療頭頸部腫瘤取得了較好的療效,在癌基因的反義基因治療中，目前已經(jīng)選取的靶基因很廣泛，癌基因包括c-src、c-fos、H-ras、K-ras、c-myc等；自分泌的生長因子及其受體基因包括IGF-1、 IGF-1受體、EGF、TGF-等。Amini等首先將表達src反義基因的質(zhì)粒導入v-src過度表達的轉(zhuǎn)化細胞，結(jié)果該細胞的致瘤性下降。Laird將帶

32、有TGF-反義基因的反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染肝癌細胞株，細胞在裸鼠體內(nèi)的致瘤性下降；Lian將IGF-1反義基因?qū)隒6大鼠膠質(zhì)瘤細胞，該細胞致瘤性下降,2）、免疫基因療法 由于在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中存在機體免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的免疫耐受狀態(tài)，而這種狀態(tài)可能源于腫瘤細胞本身的免疫原性不強（如MHC表達量不足），也可能源于抗原遞呈細胞不能提供足夠的共刺激信號（如B7）或者機體免疫因子分泌不足等。因此可以通過以下方法糾正機體腫瘤的免疫耐受狀態(tài),1）、MHC抗原 MHC抗原與免疫識別和免疫應(yīng)答有關(guān)，只有T細胞識別了抗原呈遞細胞上的MHC抗原后，才能識別外來抗原并產(chǎn)生免疫應(yīng)答。由于腫瘤細胞存在功能性MHC I類抗

33、原和/或共刺激信號表達較少，因而可能逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。可以將一些與免疫識別有關(guān)的基因（如HLA、B7等）轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的腫瘤細胞，經(jīng)照射后再植入患者體內(nèi)；或?qū)⒈磉_HLA、B7的病毒載體或質(zhì)粒DNA與脂質(zhì)體復合物直接注射到瘤體內(nèi)，以增強腫瘤細胞對機體免疫系統(tǒng)的免疫原性，激活機體的抗腫瘤免疫活性,2）、制備腫瘤DNA瘤苗 許多腫瘤都能表達一些腫瘤特異的抗原，將這些在正常機體內(nèi)不表達的腫瘤特異抗原的編碼基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，通過其在機體內(nèi)的表達從而可以激發(fā)機體對編碼抗原的免疫反應(yīng)。如黑色素瘤相關(guān)抗原MAGE、酪氨酸酶、癌基因融合基因產(chǎn)物P210bcl-abl和病毒基因產(chǎn)物HPV-E6、E7及癌胚抗原C

34、EA等，這些腫瘤特異性抗原編碼基因可用于制備腫瘤DNA瘤苗。腫瘤DNA瘤苗的轉(zhuǎn)移途徑包括重組病毒感染、直接注射等,3）、細胞因子基因轉(zhuǎn)移抗腫瘤免疫效應(yīng)細胞 將細胞因子基因（如IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12、INF-、TNF-、G-CSF、GM-CSF等）導入抗腫瘤的免疫效應(yīng)細胞（如TIL(tumor infiltrating lymphocyte,腫瘤浸潤淋巴細胞)、LAK（lymphokine activated killer cell，淋巴因子活化的殺傷細胞）及CTL（cytotoxotity T lymphcyte，細胞毒T淋巴細胞）中，以提高機體免疫系統(tǒng)對

35、腫瘤細胞的識別和反應(yīng)能力，這實際上是免疫治療和基因治療技術(shù)的組合，一定程度上克服了細胞因子注射療法需反復多次、副作用大等缺點，療效也有所提高。腫瘤免疫細胞因子基因治療因其簡單、有效、安全，已成為腫瘤免疫基因治療研究的最常用方法,4）細胞因子基因轉(zhuǎn)移腫瘤細胞 腫瘤細胞經(jīng)過細胞因子轉(zhuǎn)移后，其MHC抗原分子表達增強，成為免疫原性更強的瘤苗，使多種免疫細胞在腫瘤局部浸潤，增強機體對腫瘤的免疫功能,5） “自殺基因”療法 將“自殺基因”（suicide gene)導入腫瘤細胞，其能將無毒性前體藥物在腫瘤細胞內(nèi)代謝為毒性產(chǎn)物，進而選擇性的殺傷腫瘤細胞。能夠編碼產(chǎn)生將非活性或無毒性前體藥物轉(zhuǎn)化成活性活毒性藥

36、物的酶的基因，稱“自殺基因”,自殺基因的作用機制,TK/GCV 單純皰疹病毒（herps simplex virus, HSV）型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因編碼胸苷激酶，特異性地將無毒的核苷類似物丙氧鳥苷（ganciclovir, GCV）轉(zhuǎn)變成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，導致細胞死亡,CD/5-FC 大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（cytosine deaminase, CD）基因，在細胞內(nèi)將無毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）轉(zhuǎn)變成毒性產(chǎn)物5-氟尿嘧啶（5-FU,1.自殺基因系統(tǒng),旁觀者效應(yīng):“自殺基因”治療不僅使轉(zhuǎn)導了“自殺基因”的腫瘤細胞在用藥后被殺

37、死，而且與其相鄰的未轉(zhuǎn)導“自殺基因”的腫瘤細胞也被殺死,2. 旁觀者效應(yīng),3、心血管疾病基因治療,心血管基因治療: VEGF165（血管內(nèi)皮生長因子）對于血管的生成具有重要作用, 而一些心腦血管疾病由于血管堵塞,狹窄導致, 可以采用該策略進行血管再生, 旁路再通, 使病人免受開刀搭橋之苦. 美國已經(jīng)有多項方案進入臨床試驗, 臨床試驗結(jié)果顯示:新血管生長、心肌血流灌注和室壁功能改善，大多數(shù)病人的心絞痛減輕,六）基因治療面臨的問題和挑戰(zhàn),基因治療的發(fā)展經(jīng)歷了“樂觀與熱情失望與懷疑理性與挑戰(zhàn)”的過程，這是符合事物發(fā)展規(guī)律的。目前，基因治療領(lǐng)域存在的主要問題是有效性和安全性,主要表現(xiàn)為：(1)基因?qū)?/p>

38、系統(tǒng)缺乏靶向性，效率也較低。如以腺病毒為載體的p53基因轉(zhuǎn)移治療惡性腫瘤的方案中，只能直接將腺病 毒注射到腫瘤局部。若靜脈注射，病毒顆粒將很快被清除，真正能夠到達腫瘤組織的很少，難以達到治療效果，且增加了副作用。前面提到的第一例逆轉(zhuǎn)錄病毒介導ADA 基因轉(zhuǎn)移成功治療SCID 的病例，因為導入效率較低，前后經(jīng)歷了11 次體外轉(zhuǎn)導和回輸,2)目前針對遺傳性疾病的基因治療方案大多采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其插入或整合到染色體的位置是隨機的，有引起插入突變及細胞惡性轉(zhuǎn)化的潛在危險。而理想的基因治療方案應(yīng)該是在原位補充、置換或修復致病基因，或者將治療基因插入到宿主細胞染色體上不致病的安全位置,3)理想的基因治

39、療應(yīng)能根據(jù)病變的性質(zhì)和嚴重程度不同，調(diào)控治療基因在適當?shù)慕M織器官內(nèi)和以適當?shù)乃交蚍绞奖磉_。但目前還達不到這一目標，其主要原因是：現(xiàn)有的基因?qū)胼d體容量有限，不能包容全基因或完整的調(diào)控順序，同時人們對導入的基因在 體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機理的認識有限,1999年9月份，18歲美國青年Jesse Gelsinger因一種在醫(yī)學上稱為鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶不足癥的罕見遺傳性疾病而在美國賓夕法尼亞州大學人類基因治療中心接受基因治療時不幸死亡，成為被報道的首例死于基因治療中的患者,基因治療出現(xiàn)的問題,2002年，法國患有重癥聯(lián)合免疫缺陷病11名兒童基因治療獲得成功。但是，沒過多久，檢查出1名兒童患上某種類似白血病，有關(guān)專家認為這是由基因治療引起的。這立刻引起各國的廣泛關(guān)注,基因治療出現(xiàn)的問題,治療基因插入逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體，再進入患者細胞中與DNA結(jié)合。這些病毒載體雖經(jīng)過處理可防止感染，但無法控制病毒載體在DNA上的插入位置。擔心病毒載體會破壞重要基因，導致“插入型突變”。如果破壞的是負