(論文格式)纖維素降解菌的篩選及其發(fā)酵產(chǎn)酶條件研究

1、纖維素降解菌的篩選及其發(fā)酵產(chǎn)酶條件研究李瑩姝閻淑珍（南京師范大學生命科學學院，南京 210046）摘要：纖維素酶是一種分解纖維素的高活性生物催化劑，具有廣泛的應用價值。為了獲得高活性的纖維素降解細菌，對從南京師范大學北區(qū)枯葉堆及其附近土壤采集的樣品進行富集和剛果紅纖維素平板初篩，得到6株產(chǎn)纖維素分解酶的菌株，其中5株為細菌（B1、B3、B4、B8、B10），1株可能為真菌(B10)。經(jīng)過水解圈復篩，得到兩株產(chǎn)酶活性較高的細菌菌株B3、B10，經(jīng)過細菌形態(tài)觀察及生理生化鑒定，初步鑒定B3為革蘭氏陽性桿菌（可能為巨大芽孢桿菌）、B10為革蘭氏陽性桿菌。經(jīng)過搖瓶發(fā)酵，測定其CMCase、FPA酶活力

2、，結果表明B3和B10兩菌株分別在培養(yǎng)第三天后所產(chǎn)CMC酶的活力達到最高，分別為55.09 U/mL和44.99 U/mL，并且兩株菌均在培養(yǎng)基PH為8時酶活力最高。B3菌株基本沒有FPA酶活力，B10菌株在培養(yǎng)三天后FPA酶活力達到最高104.14 U/mL,?？蛇M一步通過紫外誘變育種等方法提高產(chǎn)酶量及酶活性，進行進一步研究。關鍵詞：纖維素酶，微生物，篩選鑒定，酶活纖維素是自然界分布最廣、最豐富、最廉價的可再生性有機資源和多糖物質，隨著地球上不可再生資源日益耗竭，如何有效轉化和利用這一豐富資源，成為各國關注的重要領域1。發(fā)展和利用生物技術分解轉化天然纖維素原料，得到可利用的糖，再進一步轉化為

3、燃料乙醇、燃氣等能源物質或者菌體蛋白等食品，成為當前國際研究的熱點。2采用微生物技術解決這一問題是當前研究最多方法。目前研究較多的是霉菌, 尤以綠色木霉、里氏木霉和康氏木霉為典型3,對細菌研究較少。分離篩選能夠高產(chǎn)纖維素酶, 有效降解纖維素的微生物菌種是應用纖維素材料的首要前提，高產(chǎn)降解纖維素細菌的獲得、得到比較穩(wěn)定的菌劑及應用于工農(nóng)業(yè)上, 對解決當今世界所面臨的糧食短缺、飼料資源緊張、能源危機和環(huán)境污染等問題具有深遠的意義4。土壤中的微生物，大約70%90%是細菌。細菌適宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長，絕大多數(shù)分布在距地表約3-8cm的土壤層。因此，土壤取樣時，一般要鏟去表層土。另外，土

4、樣的采集要選擇富含纖維素的環(huán)境，這是因為在纖維素含量豐富的環(huán)境，通常會聚集較多的分解纖維素的微生物。本實驗從腐爛枯葉附近的土壤中分離篩選能降解纖維素的細菌，通過富集，剛果紅初篩，水解圈大小復篩，測定菌株的CMC酶活力和FPA酶活力，從而得到產(chǎn)纖維素酶活力較高的兩株菌，通過形態(tài)觀察、生理生化試驗初步鑒定菌種。1材料和方法1.1菌種來源采集：綜合各種因素，本小組圖樣采集于南京師范大學仙林校區(qū)生地圖書館后的土壤。在不同的3個地點采樣。土樣1：腐爛葉下；土樣2:竹葉下；土樣3：背陽面枯葉堆。1.2 試劑與儀器DNS試劑（3，5-二硝基水楊酸），檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH 68），碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液

5、（pH 9），0.51%羧甲基纖維素鈉溶液（CMC），1mg/mL葡萄糖標準液。恒溫培養(yǎng)箱、恒溫烘箱，恒溫水浴鍋，控溫搖床、全自動滅菌鍋、電磁爐、微波爐、離心機、精密分析天平，托盤天平，721分光光度計，20mL具塞刻度試管，20ml試管， pH計（酸度計），容量瓶，移液管（0.5mL，2mL），小口瓶、燒杯、量筒等。1.3 培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基：纖維素粉2.5g，NaNO3 0.5g，Na2HPO47 H2O 0.25g,KH2PO4 0.45g ,MgSO47 H2O 0.25g ,KCl0.25g ,酵母粉0.25g ，溶解定容至500ml；剛果紅纖維素培養(yǎng)基：纖維素粉1.88g，MgSO4

6、7H2O 0.25g，K2HPO40.5g ，剛果紅0.2g，瓊脂14.0g，明膠2g，蒸餾水1000mL；剛果紅纖維素鈉培養(yǎng)基：CMC-Na 10g，酵母膏1g，瓊脂15g，明膠2g，K2HPO4 0.5g，MgSO47 H2O 0.25g，剛果紅0.05g，蒸餾水1000mL；酶活培養(yǎng)基(g/L): CMC-Na 5.0 g, 蛋白胨2.5 g, 酵母膏0.5 g, MgSO40.3 g, KH2PO42.0 g, NaCl 1.0 g,(NH4)2SO41.4 g, CaCl22H2O 0.3 g, FeSO47H2O 0.005 g,MnSO40.0016 g, ZnC120.0017

7、 g,定容至1000mL , 自然pH；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，瓊脂17.0g，水1000mL，pH7.07.2。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂 15g，自來水稀釋至1000 ml。1.4菌種的分離與純化1.4.1樣品處理目的菌富集：稱取土樣20g，在無菌條件下加入已滅菌的裝有50ml培養(yǎng)基和6顆玻璃珠的250ml錐形瓶中，將瓶口塞好扎緊(8層紗布1層牛皮紙)，將瓶置于搖床上，在30下振蕩培養(yǎng)3d。梯度稀釋：用量程為1000L的移液管從富集培養(yǎng)土壤液中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無菌水的試

8、管中充分混勻。然后換槍頭從此試管中吸取1ml加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10-110-6不同稀釋度的土壤溶液。1.4.2菌種初篩初將稀釋倍數(shù)分別為10-5、10-6的樣品溶液，在無菌條件下每個溶液取0.1ml分別涂布到剛果紅纖維素培養(yǎng)基（剛果紅纖維素鈉培養(yǎng)基作對照）上，用涂0.1ml蒸餾水的兩種培養(yǎng)基平皿做空白對照，28培養(yǎng)4d，選擇四周有透明水解圈的菌株進行分離純化。1.4.3分離純化把菌種初篩得到的菌落分別在剛果紅纖維素培養(yǎng)基上劃線分離，為進一步純化菌株共進行了兩次此劃線分離。并排除初篩時處在透明圈內但不產(chǎn)生纖維素酶的假陽性菌，得到純培養(yǎng)。1.4.4菌種復篩將純

9、化后的菌株點接種到纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基點四個點，28培養(yǎng)4d。用毫米刻度尺精確測量水解圈直徑（H）和菌落直徑（D），每個菌株選三個最接近圓形的菌落進行測量，沒個菌落測三條直徑，求得的H/C比值的平均值即可粗略代表各菌株的酶活大小，選取H/C比值最大的菌株進行進一步精確地酶活測定。1.5菌種鑒定在復篩選出的菌種中選出兩個H/C比值最大的菌種，即B3和B10，進行生理生化鑒定。將菌株擴大培養(yǎng)，轉接到NB培養(yǎng)基上，置于28恒溫培養(yǎng)24h活化菌種。形態(tài)學的生理生化形狀實驗參考周德慶微生物學實驗手冊進行初步鑒定。51.6酶活測定1.6.1粗酶液的制備將篩選得到的純菌株接種到50 mL 搖瓶培

10、養(yǎng)基中, 于30C、160 r/min 搖瓶培養(yǎng)16 d。每天取出發(fā)酵液, 5000 r/min、4 C 離心20min, 取上清液即是細胞胞外酶液, 用于不同培養(yǎng)時間酶活力的測定。1.6.2 DNS法測定酶活力葡萄糖標準曲線：準確稱取100mg恒重的葡萄糖，用蒸餾水溶解定容于100ml容量瓶中，配制成1mg/ml標準葡萄糖溶液，作為標準葡萄糖母液備用。按照表1完成各試劑的添加及反應，取出冰水中冷卻至室溫后定容至10ml，分別在540nm下比色，記錄吸光值，繪制葡萄糖標準曲線。表1 不同濃度的葡萄糖溶液管號12345678標準葡萄糖溶液(ml)0.00.20.40.60.81.01.21.4蒸

11、餾水(ml)2.01.81.61.41.21.00.80.6DNS (ml)1.51.51.51.51.51.51.51.5搖勻后沸水浴7min，取出冷卻蒸餾水(ml)16.516.516.516.516.516.516.516.5菌株CMC酶活力的測定: 在10ml試管中加入0.5ml酶液，對照組（A組）管加1.5ml DNS試劑，實驗組（B、C、D組）不加；4組管一起50保溫2min，同時分別加1.5ml不同PH含CMC-Na的緩沖溶液（PH 6.0、7.0 、8.0、9.0），50水浴酶解30min,實驗組加1.5ml DNS試劑終止反應，沸水浴7min，冷卻定容至10ml。以對照組試管

12、溶液為空白對照，在波長540nm處測定吸光度并記錄結果。根據(jù)上述平行實驗組的平均值，在標準曲線上查出對應的葡萄糖含量，計算酶活力6。濾紙酶活力（FPA）的測定：在10ml試管中加入0.5mL酶液和1.5mL檸檬酸緩沖液，向對照組（A組）試管中加入1.5mlDNS試劑以鈍化酶活性，作為空白對照，實驗組（B、C、D組）先不加。將實驗組和對照組試管同時在50水浴中預熱5min，然后各加入50mg濾紙條（新華定量濾紙，1cm6cm，多張疊起來剪，卷成蓬松的卷，使可以淹沒），50 C保溫30min，取出后立即向對照組組試管中迅速加入1.5mL DNS試劑以終止酶反應。將4組試管充分搖勻后在沸水浴中加熱8

13、min，取出冷卻后用蒸餾水定容至10mL。以對照組組試管溶液為空白對照，在波長540nm處測定吸光度并記錄結果。根據(jù)上述平行實驗組的平均OD值，在標準曲線上查出對應的葡萄糖含量，計算酶活力。酶活力定義：在50條件下，1ml酶液每分鐘水解底物生成1ug葡萄糖的酶量，稱為一個酶活力單位，以U/mL表示。酶活力計算公式如下：1個酶活力單位 X=(1000Cn)/T)式中：X:樣品的酶活力（U/mL）；C：測試液中葡萄糖含量（mg/mL）；n：稀釋倍數(shù)；T：水解時間（min）。2結果和分析2.1初篩及菌種純化結果圖1 產(chǎn)纖維素酶細菌的初篩部分結果 初篩培養(yǎng)基上部分菌落周圍產(chǎn)生明顯的透明圈，該菌落即為產(chǎn)

14、纖維素分解酶微生物。通過初篩選出10株可能產(chǎn)纖維素酶的微生物。但有部分水解圈內有兩個或多個菌落，無法分辨是哪個菌落產(chǎn)生的透明水解圈，可能存在不產(chǎn)酶的假陽性菌，需經(jīng)進一步劃線分離純化確定。初篩實驗中，涂布在剛果紅纖維素培養(yǎng)基上經(jīng)過培養(yǎng)出現(xiàn)明顯的透明圈，初篩效果較好；但涂布在剛果紅纖維素鈉培養(yǎng)基上并未產(chǎn)生明顯的透明圈，篩選效果不好。經(jīng)過兩次分離純化，排除假陽性菌得到了6株產(chǎn)纖維素分解酶的菌株即B1 ,B3 ,B4 ,B8 ,B10 ,B10。其中B10菌可能為共生真菌，菌落中央為紅粉色，周圍一圈為白色，培養(yǎng)一周后菌落呈霉狀。表2 初篩及分離純化結果土樣編號初篩涂板稀釋度菌株編號2-5B013-5B

15、032-6B042-5B083-5B103-5B102.2復篩及鑒定結果表3 菌落H/C比值測量結果菌種編號透明圈直徑平均值（H，mm）菌落直徑平均值（C，mm）H/CB118.174.264.27B326.914.645.79B419.784.414.48B817.003.375.05B1026.392.5710.28B1012.442.185.71 表3所示為復篩的測量結果，從表中可以看出，在相同培養(yǎng)條件下經(jīng)過相同的時間，H/C比值從平均4.38到10.57不等，最大的兩株菌為B10和B03號菌株，H/C比值分別高達10.57和5.85，可作為進一步測定精確酶活力的菌株。 經(jīng)過對B3和B1

16、0的菌種初步鑒定，B3菌株是革蘭氏陽性菌，桿狀，有芽孢，可能為巨大芽孢桿菌。B10號菌是革蘭氏陽性桿菌。2.3酶活測定2.3.1葡萄糖標準曲線 按照表1操作，用分光光度法獲得以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標所得的標準曲線回歸方程：y=15.04X-0.039，R2=0.996。濃度X與吸光值Y之間呈良好的線性關系。2.3.2菌株CMC酶和FPA酶活力測定 用不同發(fā)酵時間粗酶液、不同PH值緩沖液配制的底物溶液，測定B3和B10兩個菌株的菌株CMC酶活力。用不同發(fā)酵時間粗酶液測定兩株菌FPA酶活力，結果見圖2、圖3、圖4。3 討論 纖維素酶的來源非常廣泛，真菌、放線菌及細菌在一定條件下均可產(chǎn)生

17、。本實驗從枯葉堆下的土壤中篩選出六株可產(chǎn)生纖維素分解酶的菌株，其中有兩株產(chǎn)酶活性較高，分別為一株革蘭氏陽性芽孢桿菌B3（可能為巨大芽孢桿菌）和一株革蘭氏陽性桿菌B10，兩菌株分別在培養(yǎng)第三天后所產(chǎn)CMC酶的活力達到最高，分別為55.09 U/mL和44.99 U/mL，并且兩株菌均在培養(yǎng)基PH為8時酶活力最高。B3菌株基本沒有FPA酶活力，B10菌株在培養(yǎng)三天后FPA酶活力達到最高104.14 U/mL。呂靜琳等8所篩選的纖維素分解菌LT-3產(chǎn)濾紙酶活最大可達33.37 U/ mL,孫軍德等9所篩選的纖維素分解菌在第3天濾紙酶活力達到最大值為20.14U/ml,對比可知菌株B10產(chǎn)濾紙酶能力較

18、強。濾紙酶活力可以代表菌株對于纖維素的綜合降解能力。B10菌株具有很高的FPase活性，這表明該菌具有較完整的酶系，其產(chǎn)生的纖維素酶系具有較強的綜合降解能力。 實驗結果顯示兩菌株產(chǎn)纖維素酶活力在經(jīng)過段時間達到峰值后會降低到很低，推測纖維素酶的產(chǎn)生與細菌的生長密切相關，后期酶活的降低可能與培養(yǎng)基消耗、菌體密度過高導致的細菌生長減緩有關。 纖維素酶是一種復合酶，包括葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和葡萄糖苷酶。測定濾紙酶活大的優(yōu)點是可以篩選到產(chǎn)生酶系較全，分泌各個酶組分比例較為協(xié)調的菌株。因為濾紙包括結晶型和非結晶型纖維素，只有三種纖維素酶均有產(chǎn)生的菌株才有可能將其較好的降解。因此濾紙酶活力可以代表菌株

19、對于纖維素的綜合降解能力。B10菌株具有較高的FPase活性，這表明該菌具有較完整的酶系，其產(chǎn)生的纖維素酶系具有較強的綜合降解能力，可進一步通過誘變或基因工程等手段提高其纖維素酶活力，具有相當廣闊的理論價值和工業(yè)應用前景。自然狀態(tài)下，纖維素的徹底降解是在微生物體系中多種微生物長時間相互作用的結果，這一過程僅靠一種微生物是無法實現(xiàn)的。這是由于分解纖維素的酶是由多種組分組成的酶體系。因此，在進行纖維素大分子降解的研究過程中要考慮到微生物的產(chǎn)酶體系之間的協(xié)同效應10。目前，微生物降解纖維素法還不能夠普遍應用，一個很大的原因就是很多人都想找到一種高效的酶或微生物能充分利用纖維素，而忽略微生物的產(chǎn)酶體系之間的協(xié)同效應，很少部分人做利用微生物的產(chǎn)酶體系之間的協(xié)同效應降解纖維素的試驗，結果也因為限制因素較多而不樂觀，因此，要實現(xiàn)生物法降解纖維素的產(chǎn)業(yè)化，還需繼續(xù)探索。若能進一步研究纖維素酶的協(xié)同作用, 應用混合發(fā)酵把天然纖維素, 如農(nóng)作物秸稈、竹子纖維、城市廢料、木材等中的纖維素, 轉化為燃料、醫(yī)藥、食品及高科技紡織等行業(yè)的可利用資源, 這對當今高度重視的環(huán)境和生態(tài)問題將會有很大的研究前景和意義4,7。參考文獻：1 朱建良，邱曄，陳曉曄，等.1株產(chǎn)纖維素酶真菌的鑒定及其酶學性質初探J.安徽農(nóng)業(yè)科學，2008,36（21）：90