人VIGILIN蛋白的基因分段表達(dá)

1、人VIGILIN蛋白的基因分段表達(dá)人高密度脂蛋白結(jié)合蛋白（HDLBP）-VIGILIN蛋白是一種含有14個(gè)相關(guān)、但不完全相同的串聯(lián)的KH結(jié)構(gòu)域的多功能蛋白質(zhì)，VIGILIN蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布1.VIGILIN蛋白家族廣泛存在于真核生物中，如果蠅中的DDP1、酵母中的Scp160、脊椎動(dòng)物中的VIGILIN蛋白。不同生物種類中的VIGILIN蛋白結(jié)構(gòu)和功能具有高度的保守性2,3.人VIGILIN基因位于2q37,其包含29個(gè)外顯子，主要編碼相對(duì)分子質(zhì)量為150×103的VIGILIN蛋白。目前有研究報(bào)道VIGILIN蛋白有多種生物學(xué)功能，包括參與脂代謝4、有絲分裂時(shí)異染色

2、質(zhì)的分離、維持異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性5,幫助tRNA在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核間的轉(zhuǎn)運(yùn)、維持mRNA的穩(wěn)定性6,參與印記基因IGF2/H19的調(diào)控7,與肝癌、乳腺癌等的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)8,9.本研究根據(jù)人VIGILIN蛋白不同的結(jié)構(gòu)域?qū)IGILIN全長分成5個(gè)片段，并且將5個(gè)片段分別亞克隆到pGEX 5X3原核表達(dá)載體中，采用pGEX原核表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，產(chǎn)生大量GST融合蛋白，為進(jìn)一步研究VIGILIN與其他蛋白的相互作用打下基礎(chǔ)。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料2×Taq Plus Master Mix購自上海近岸科技有限公司，Pyrobest DNA Polymerase購自大連寶

3、生物公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒購自O(shè)mega公司，DNA凝膠回收試劑盒購自QIAGEN公司，限制性內(nèi)切酶及DNA連接酶購自Formentas公司，IPTG、瓊脂糖購自Invitrgen公司，引物合成及質(zhì)粒測(cè)序鑒定由Invitrogen公司完成。含VIGILIN全長cDNA序列的pDsred2-N1/VIGILIN重組質(zhì)粒由我室構(gòu)建，原核表達(dá)載體pGEX 5X3由劉建余博士饋贈(zèng)，大腸桿菌BL21、DH5α為本室保存。1.2 VIGILIN分段及引物設(shè)計(jì)根據(jù)人VIGILIN蛋白不同的結(jié)構(gòu)域?qū)IGILIN全長cDNA（GenBankNM_005336.4）分成5個(gè)片段，分別為N端、KH1

4、-7、KH8-12、KH13-14、C端，并用primer軟件設(shè)計(jì)包括全長在內(nèi)的6對(duì)引物，分別在引物兩端加上合適的酶切位點(diǎn)及酶切位點(diǎn)相應(yīng)的保護(hù)堿基，送至Invitrogen公司合成。為了糾正與GST融合表達(dá)后可能出現(xiàn)的讀碼框移位，設(shè)計(jì)及合成引物時(shí)在VIGILIN全長cDNA起始密碼上游引入2個(gè)堿基，在N端、KH13-14、C端端上游引入2個(gè)堿基，在KH1-7、KH8-12上游引入1個(gè)堿基，以使GST和VIGILIN都能在正確的讀碼框內(nèi)融合表達(dá)。分段擴(kuò)增VIGILIN片段的引物序列、位置、酶切位點(diǎn)等見附表。1.3 VIGILIN全長及分段cDNA PCR擴(kuò)增以pDsred2-N1/VIGILIN

5、重組質(zhì)粒為模板擴(kuò)增VIGILIN全長cDNA及分段cDNA.VIGILIN全長PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：10×Pyrobest buffer 5μL,dNTP Mix（各2.5mmol/L）4μL,上游引物（10pmol/L）1μL,下游引物（10pmol/L）1μL,模板0.5μL（約50ng），Pyrobest酶（5U/μL）0.5μL混勻，水36.5μL,反應(yīng)總體積為48.5μL10.VIGILIN全長擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94，5min,變性94，45s,退火58，30s,延伸72，3min,30個(gè)循環(huán)后4保存。VIGILIN

6、N端、KH1-7、KH8-12、KH13-14、C端PCR擴(kuò)增體系為：2×Taq Plus Master Mix25μL,上游引物（10pmo l/L）1μL,下游引物（10pmol/L）1μL,模板0.5μL（約50ng），水22.5μL,反應(yīng)總體積為50μL.VIGILIN分段擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94，1min 30s,變性94，30s,退火溫度見附表，30s,延伸72，1min,30個(gè)循環(huán)后72延伸5min后4保存。各段均以相應(yīng)體系和相應(yīng)條件分別擴(kuò)增4管，共200μL.分別取各段擴(kuò)增產(chǎn)物5μL,15g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定后

7、各段剩余PCR產(chǎn)物均用15g/L瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的片段。1.4 VIGILIN全長及分段cDNA原核表達(dá)載體構(gòu)建分別雙酶切VIGILIN各片段及pGEX 5X3質(zhì)粒。各片段所用限制性內(nèi)切酶分別為Sma/Xho（VIGILIN全長），BamH/EcoR（N端），EcoR/Xho（KH1-7），EcoR/Xho（KH8-12）,BamH/Xho（KH13-14），BamH/EcoR（C端）。pGEX 5X3質(zhì)粒用相同的限制性內(nèi)切酶雙酶切。將酶切后的各片段用15g/L瓊脂糖凝膠電泳后回收。分別將純化的目的片段與純化的相應(yīng)的pGEX 5X3載體連接，VIGILIN分段的連接體系為：10&ti

8、mes;T4DNA ligase buffer 2μL,T4DNA ligase（5U/μL）0.2μL,pGEX5X3載體20ng,目的片斷60200ng,總體積20μL.22連接1h.VIGILIN全長因引入了Sma,所以按平末端的方法連接，體系為:0×T4DNA ligasebuffer 2μL,50%PEG 4000Solution 2μL,T4DNA ligase（5U/μL）1μL,總體積20μL.22連接2h.其中載體DNA與插入片段DNA的摩爾比為1（310）。取各連接產(chǎn)物5μL,轉(zhuǎn)化DH5α感

9、受態(tài)細(xì)胞，然后鋪于LB（100μg/mL氨芐青霉素）平板上，待菌液干后翻板，37過夜，次日挑單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，擴(kuò)增后按質(zhì)粒小量提取試劑盒說明書提取重組質(zhì)粒，分別按附表中各片段的限制性內(nèi)切酶雙酶切各重組質(zhì)粒篩選出陽性克隆。將陽性克隆菌各取300μL送至公司測(cè)序，測(cè)序均用pGEX通用引物。測(cè)序后將測(cè)得的序列與VIGILINcDNA全長序列用DNAman軟件比對(duì)。將鑒定好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21大腸桿菌中鑒定：經(jīng)酶切VIGILIN6個(gè)PCR產(chǎn)物及pGEX 5X3載體、連接相應(yīng)的PCR產(chǎn)物及載體、轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物到大腸桿菌中后，各隨機(jī)挑取單個(gè)菌落進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，

10、然后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后，用10g/L瓊脂糖凝膠電泳。1.5 GST融合蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化（以GST-VIIGLIN N為例）以不同條件分別對(duì)GST-VIGILIN N融合蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，用SDS-PAGE電泳檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況。GST-VIGILIN N融合蛋白按培養(yǎng)溫度（16、25）,IPTG濃度（0.1、0.5、1.0mmol/L），誘導(dǎo)時(shí)間（3h、6h）的不同條件分別進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)3h、6h后各分別取出3mL培養(yǎng)物，10 000r/min,離心1min后棄上清，沉淀在-20冰箱中反復(fù)凍融2次后分別向沉淀中加入300μL細(xì)菌裂解液，冰上以150W,超聲4s、停12s的條

11、件超聲10次后，4、12 000r/min離心10min.分離上清和沉淀，向沉淀中加入300μL 1×SDS上樣緩沖液，上清各取80μL加入20μL 5×SDS上樣緩沖液混勻，100煮5min,各取20μL用100g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，確定最適表達(dá)條件。GST-VIGILIN全長融合蛋白按培養(yǎng)溫度（16、25）,IPTG濃度（0.1、0.5、1.0mmol/L），誘導(dǎo)時(shí)間（3h,6h,12h）誘導(dǎo)，其余方法同前，進(jìn)行優(yōu)化11.1.6 GST-VIGILIN全長及分段重組克隆融合蛋白表達(dá)按上述優(yōu)化條件誘導(dǎo)表達(dá)GST-VIGILIN融合蛋白，

12、誘導(dǎo)后行SDS-PAGE電泳并用抗GST的抗體做Western blot檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)。取保種的經(jīng)鑒定后構(gòu)建成功的各pGEX 5X3-VIGILIN重組菌劃板，次日挑單克隆于10mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37振搖過夜，取100μL菌液加入10mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37、220r/min,快搖2h,至對(duì)數(shù)期（吸光度600約為0.6）.VIGILIN分段加入IPTG至終濃度為0.1mmol/L,25，150r/min誘導(dǎo)表達(dá)3h11.VIGILIN全長加入IPTG至終濃度為0.1mmol/L,16，150r/min誘導(dǎo)表達(dá)12h.取各段誘導(dǎo)后菌液1mL,4，10 000r

13、/min離心1min棄上清，收集菌體，各加入100μL 1×SDS上樣緩沖液，沸水煮10min后瞬時(shí)離心，上清用于SDS-PAGE電泳及Western blot檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)。2結(jié)果2.1 VIGILIN各片段的PCR擴(kuò)增以pDsred2-N1/VIGILIN重組質(zhì)粒為模板擴(kuò)增VIGILINcDNA1的理論大小分別為：N端，455bp;KH1-7,1 480bp;KH8-12,1 231bp;KH13-14,412bp;C端，242bp.如圖1所示，各片段經(jīng)電泳后呈現(xiàn)為清晰的單一條帶，大小與理論值大致一致。2.2 pGEX 5X3-VIGILIN各段重組質(zhì)粒的鑒定各酶切后

14、的重組質(zhì)粒分別可見約5 000bp的質(zhì)粒，3 800bp左右的VIGILIN全長、450bp左右的N端、1 500bp左右的KH1-7、1 200bp左右的KH8-12、400bp左右的KH13-14、250bp左右的C端。見圖2.大小與理論值大致一致，測(cè)序結(jié)果比對(duì)后證實(shí)與目的片段完全一致。2.3 GST-VIGILIN融合蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化如圖3所示：GST-VIGILIN N分段融合蛋白在IPTG濃度為0.1mmol/L,溫度為25,誘導(dǎo)時(shí)間為3h和IPTG濃度為0.1mmol/L,溫度為16,誘導(dǎo)時(shí)間為6h時(shí)分布在裂解液上清較多，兩者上清中蛋白量相差不大，為了節(jié)約時(shí)間，最終選擇以IPTG

15、濃度為0.1mmol/L,溫度為25,誘導(dǎo)時(shí)間為3h作為分段融合蛋白的表達(dá)條件。GST-VIGILIN全長融合蛋白在IPTG濃度為0.1mmol/L,溫度為16,誘導(dǎo)時(shí)間為12h時(shí)分布在裂解液上清較多（結(jié)果未顯示），由此確定GST-VIGILIN分段融合蛋白在IPTG終濃度為0.1mmol/L,溫度為25誘導(dǎo)3h,GST-VIGILIN全長融合蛋白在IPTG終濃度為0.1mmol/L,溫度為16誘導(dǎo)12h為較理想的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)條件。在此條件下進(jìn)行GST-VIGILIN融合蛋白表達(dá)。2.4 VIGILIN全長cDNA及其分段片段的GST融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE電泳結(jié)果見圖4A,可見GS

16、T-VIGILIN各段融合的蛋白均有表達(dá)，GST-VIGILIN全長相對(duì)分子質(zhì)量約為170×103,GST-VIGILIN N端相對(duì)分子質(zhì)量約為40×103,GST-VIGILIN KH1-7相對(duì)分子質(zhì)量約70×103,GST-VIGILIN KH8-12相對(duì)分子質(zhì)量約為60×103,KH13-14相對(duì)分子質(zhì)量約為40×103,C端相對(duì)分子質(zhì)量約為30×103.所有片段大小與估計(jì)值大致相符。Western blot結(jié)果見圖4B,GST-VIGILINKH1-7在略小于70×103處有條帶，GST-VIGILIN

17、KH8-12在略小于主帶的地方同樣有一條帶。3討論研究顯示VIGILIN蛋白參與了不同基因、mRNA、tRNA、蛋白多層次的調(diào)控。目前已發(fā)現(xiàn)的有VIGILIN與脂蛋白脂肪酶（LPL）復(fù)合體結(jié)合參與脂蛋白脂肪酶在血管內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)控血漿甘油三酯的代謝13;VIGILIN與信號(hào)肽肽酶signalpeptide peptidase（SPP）形成復(fù)合體參與膜蛋白的翻譯和錯(cuò)誤折疊的消除14;VIGILIN與mRNA結(jié)合維持mRNA的穩(wěn)定性，與tRNA及翻譯延長因子結(jié)合保證翻譯的效率15;VIGILIN與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39H1結(jié)合，維持異染色質(zhì)的穩(wěn)定性16;我室前期研究發(fā)現(xiàn)VIGILIN與轉(zhuǎn)錄

18、因子CTCF相互作用參與CTCF依賴的IGF2/H19印記基因的調(diào)控7;CTCF介導(dǎo)VIGILIN在衛(wèi)星序列2結(jié)合的減少從而引起HP1a的結(jié)合減少等17.但VIGILIN與這些蛋白質(zhì)、RNA以及基因相互作用的機(jī)制尚不完全清楚。為了進(jìn)一步研究VIGILIN蛋白與其他因子相互作用的機(jī)制，本研究根據(jù)VIGILIN蛋白不同的結(jié)構(gòu)域首次成功分段克隆了GST-VIGILIN融合蛋白原核表達(dá)載體，并且利用原核表達(dá)系統(tǒng)首次成功誘導(dǎo)出GST-VIGILIN融合蛋白。值得注意的是，在Western blot結(jié)果中融合蛋白GST-VIGILINKH1-7及GST-VIGILIN KH8-12分別在略小于主帶的地方有一條帶，說明融合蛋白GST-VIGILINKH1-7及GST-VIGILIN KH8-12在原核表達(dá)系統(tǒng)中可翻譯出兩種分子大小不同