Skp2和PTEN在人腦星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)及臨床意義

1、Skp2和PTEN在人腦星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)及臨床意義生墾塞旦經(jīng)瘟盤查8年1月第11卷第1期ChineseJournalofPracticalNervousDiseasesJan.2008,Vo1.1INo.1Skp2和PTEN在人腦星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)及臨床意義鄭杰宋來(lái)君孫紅衛(wèi)杜偉黨博鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科鄭州450052?9?【摘要】目的探討Skp2和PTEN在人腦星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)及與病理分級(jí)的關(guān)系.方法免疫組化S-P法檢測(cè)7O例I級(jí)腦星形細(xì)胞瘤和8例正常腦組織標(biāo)本中Skp2和PTEN的表達(dá).結(jié)果(1)Skp2,PTEN在人腦星形細(xì)胞瘤組中陽(yáng)性表達(dá)率分別為47.1%和50.0%,而在正

2、常腦組織組中陽(yáng)性表達(dá)率分別為0%和100%.從星形細(xì)胞瘤I,II級(jí)組,III級(jí)組到IV級(jí)組,Skp2的陽(yáng)性表達(dá)率呈增高趨勢(shì),分別為9.1,45.5%,80.8%,而PTEN的陽(yáng)性表達(dá)率呈降低趨勢(shì),分別為90.9%,50.0%,15.4.(2)Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)證實(shí)病理分級(jí)和Skp2標(biāo)記指數(shù)呈正相關(guān),和PTEN標(biāo)記指數(shù)呈負(fù)相關(guān).人腦星形細(xì)胞瘤中Skp2和PTEN的表達(dá)呈負(fù)相關(guān).結(jié)論Skp2和PTEN蛋白的表達(dá)情況可作為人腦星形細(xì)胞瘤的診斷和惡性程度評(píng)估的參考資料,可能成為人腦星形細(xì)胞瘤治療的新靶點(diǎn).【關(guān)鍵詞】星形細(xì)胞瘤;Skp2;PTEN;免疫組織化學(xué)【中圖分類號(hào)】R730.264【文

3、獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】16735110(2008)01000903ExpressionandclinicalsignificanceofSkp2andPTENinastrocytomaZhengJie,SongLaijun,SunHongwei,eta1.DepartmentofNeurosurgery.theFirstAliatedHospitaltoZhengzhouUniversity.Zhengzhou450052AbstractObjectiveToinvestigatetheexpressionofSkp2andPTENintheastrocytoma,therelationsh

4、ipbetweenthetowandpathologicalclassification.MethodsTheexpressionsofSkp2andPTENweredetectedbyusingimmunohistochemicalSPstainingin70casesofastrocytoma(gradeItoIV)and8casesofnormalbraintissues.Results(1)ThepositiverateoftheexpressionofSkp2andPTENinastrocytomawere47.1and50.0.andthoseinnormalbraintissue

5、swere0and100respectively.FromastrocytomaofgradeI,II,gradeIIItogradeIV,thepositiveexpressionofSkp2raisedgradually,thepositiverateswere9.1%,45.5and80.8.respectively.AndPTENpositiveexpressiondecreasedgradually,thepositiverateswere90.9,50.0and15.4%,respectively.(2)UsingSpearmanrankcorrelationtest,itcoul

6、dbeconfirmedthatpathologicclassificationwaspositivelycorrelatedwithSkp2expressionindexandnegativelycorrelatedwithPTENexpressionindex.Skp2expressionwasnegativelycorrelatedwithPTENexpressioninastrocytoma.ConclusionTheexpressionofSkp2andPTENcanberegardedasdiagnosticandassessmentreferencesofastrocytomaa

7、ndprovideanewtargetgeneforeffectiveremedytoastrocytoma.KeywordsAstrocytoma;Skp2;PTEN;Immunohistochemistry2O世紀(jì)9O年代,已認(rèn)識(shí)到腫瘤是一種細(xì)胞周期調(diào)控異常性疾病,幾乎所有的癌基因,抑癌基因的功能效應(yīng)均與細(xì)胞生命活動(dòng)異常有關(guān),腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與細(xì)胞周期分子調(diào)控異常密切相關(guān).因此,又可以認(rèn)為腫瘤是細(xì)胞周期性疾病.S期激酶相關(guān)蛋白2(Skp2)是對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控具有重要作用的蛋白之一,是泛素蛋白連接酶E3中的一種.在細(xì)胞周期中主要通過(guò)參與細(xì)胞調(diào)控因子的泛素依賴性蛋白水解途徑,參與細(xì)胞周期的調(diào)控.

8、PTEN是目前發(fā)現(xiàn)的唯一具有磷酸酶活性的抑癌基因,可阻止細(xì)胞分裂.本研究利用免疫組化技術(shù),旨在了解人腦星形細(xì)胞瘤中Skp2和PTEN蛋白的表達(dá),探討其在人腦星形細(xì)胞瘤發(fā)生,發(fā)展中的作用及相關(guān)關(guān)系,為臨床診斷,治療提供理論依據(jù),揭示其異常表達(dá)與腫瘤惡性程度的關(guān)系.1材料和方法1.1材料1.1.1標(biāo)本來(lái)源及資料:本實(shí)驗(yàn)設(shè)實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組.實(shí)驗(yàn)組全部7O例人腦星形細(xì)胞瘤標(biāo)本取自本院神經(jīng)外科200701200709手術(shù)切除標(biāo)本,男36例,女34例;年齡157O歲,平均35.5歲.病程最長(zhǎng)8年,最短2.0月,平均為1.4年.按Kernohan四級(jí)分類法又分工,級(jí)組22例,級(jí)組22例,級(jí)組26例,術(shù)前均

9、未行放射治療和化療,所有切片術(shù)后均經(jīng)HE染色病理學(xué)常規(guī)檢查,均經(jīng)本院兩位資深病理專家認(rèn)定.對(duì)照組8例正常腦組織標(biāo)本,均來(lái)自同期收治的急性顱腦損傷患者因顱內(nèi)減壓而切除的腦組織,并經(jīng)病理檢驗(yàn)證實(shí)為正常腦組織.1.1.2免疫組化試劑:鼠抗人Skp2單克隆抗體,兔抗人PTEN多克隆抗體及SP免疫組化試劑盒均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供.1.2方法1.2.1免疫組化:免疫組化染色方法嚴(yán)格按試劑盒操作步驟進(jìn)行.PBS代替一抗作空白對(duì)照,Skp2選取已知陽(yáng)性乳腺癌切片作為陽(yáng)性對(duì)照,PTEN選取已知陽(yáng)性前列腺癌切片作為陽(yáng)性對(duì)照.1.2.2結(jié)果判定:Skp2陽(yáng)性反應(yīng)部位以細(xì)胞核為主,?1O?中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾

10、病雜志2008年1月第11卷第1期ChineseJournalofPraetiealNervousDi!as!Ja.!.:同時(shí)有胞漿著色的細(xì)胞.以細(xì)胞核出現(xiàn)明顯棕黃一棕褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞,而胞漿出現(xiàn)棕黃色為非特異性染色.PTEN陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞漿中,染色為棕黃色細(xì)顆粒狀,細(xì)胞核和細(xì)胞膜幾乎不著色.隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野(400倍)計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),至少計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞.參照Fromowitz方法,在高倍鏡下對(duì)細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)如下評(píng)分:(1)無(wú)著色為0,淡黃色為1,棕黃色為2,棕褐色為3;(2)陽(yáng)性范圍:G5為0,525為1,269/55O為2,519/575為3,>759/5為4.兩項(xiàng)結(jié)果

11、相加記為標(biāo)記指數(shù)(LI),并通過(guò)LI判斷表達(dá)強(qiáng)度和表達(dá)陽(yáng)性率.<2為陰性(一),23為弱陽(yáng)性(+),45為中度陽(yáng)性(+),67為強(qiáng)陽(yáng)性(+).弱陽(yáng)性例數(shù),中度陽(yáng)性例數(shù)和強(qiáng)陽(yáng)性例數(shù)之和作為陽(yáng)性總數(shù).1.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用檢驗(yàn),四格表確切概率法及Spearman等級(jí)相關(guān)分析,SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理.P<0.05為有顯著性差異.2結(jié)果2.1Skp2和PTEN蛋白在正常腦組織和人腦星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)正常對(duì)照組中Skp2蛋白均為陰性表達(dá).Skp2在正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為0.0和47.1,兩者相比差異有顯著性(PG0.05).正常對(duì)照組中PTEN蛋白均為陽(yáng)性表達(dá).PT

12、EN在正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為100.0和50.09/6,兩者相比差異有顯著性(PG0.05).見(jiàn)表1.表1Skp2和PTEN蛋白在正常對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)注:P=0.018;P一0.0012.2Skp2和PTEN蛋白在不同病理級(jí)別人腦星形細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)Skp2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率在人腦星形細(xì)胞瘤I,級(jí)組中為9.1,IlI級(jí)組中為45.5,IV級(jí)組中為8O.8.Skp2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率隨病理級(jí)別增高呈增高趨勢(shì),各組間相比差異均有顯著性(PG0.05).Skp2標(biāo)記指數(shù)與病理分級(jí)的關(guān)系采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析,結(jié)果兩者呈正相關(guān)(一0.582,P<0.05).PTEN蛋白

13、表達(dá)陽(yáng)性率在人腦星形細(xì)胞瘤I,級(jí)組中為90.9,III級(jí)組中為50.0,IV級(jí)組中為15.4.PTEN蛋白表達(dá)陽(yáng)性率隨病理級(jí)別增高呈降低趨勢(shì),各組間相比差異均有顯著性(PG0.05).PTEN標(biāo)記指數(shù)與病理分級(jí)的關(guān)系采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析,結(jié)果兩者呈負(fù)相關(guān)(r一一0.618,PG0.05).見(jiàn)表2.2.3人腦星形細(xì)胞瘤中Skp2與PTEN蛋白表達(dá)問(wèn)的關(guān)系在33例Skp2表達(dá)陽(yáng)性的人腦星形細(xì)胞瘤標(biāo)本中PTEN陽(yáng)性表達(dá)8例,而在Skp2陰性表達(dá)的37例中PTEN陰性表達(dá)1O例,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs一一0.478,PG0.05).表2Skp2和PTEN蛋白在各組星形細(xì)胞瘤中的

14、表達(dá)組別Skp2PTEN一+陽(yáng)性一+陽(yáng)性I,級(jí)組級(jí)組級(jí)組.P22222621O2124.6070.0002O11d27.1890.000注:行分割,a與b相比,P=0.007;b與C相比,P=0.011;a與b相比,P=0.003;b與C相比,P一0.0103討論Skp2的主要功能是作為SCF復(fù)合體的底物識(shí)別亞基,特異性識(shí)別磷酸化的底物,并介導(dǎo)其泛素化降解.Skp2介導(dǎo)多種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的泛素化降解,其異常表達(dá)必然引起細(xì)胞周期的異常,而細(xì)胞周期的異常是腫瘤中的常見(jiàn)現(xiàn)象.Skp2在轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中有過(guò)表達(dá),Skp2在腫瘤發(fā)生中屬于正性調(diào)節(jié)因子.本研究發(fā)現(xiàn)Skp2在正常腦組織組中陰性表達(dá),而在人腦星

15、形細(xì)胞瘤各級(jí)組中的陽(yáng)性率表達(dá)隨惡性程度的升高而增加(PG0.05),表達(dá)的標(biāo)記指數(shù)與病理分級(jí)呈正相關(guān)(一0.582,P<0.05),表明Skp2是細(xì)胞周期調(diào)控的正性調(diào)節(jié)因子,具有原癌基因的功能,參與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄及其在腫瘤中過(guò)表達(dá)等作用.P27kipl作為一種候選抑癌基因,在腦腫瘤中,DavideS用免疫組化和Westernblot檢測(cè)人腦星形膠質(zhì)瘤,也證實(shí)Skp2與P27kipl呈負(fù)相關(guān)1.Skp2作為泛素蛋白酶體途徑的底物識(shí)別序列,因能泛素化降解P27kip1,使腫瘤細(xì)胞G1一S期調(diào)控發(fā)生紊亂,與腫瘤的某些生物學(xué)性狀,831,1542nO49147125趵中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志2008年1月

16、第l1卷第1期ChineseJournalofPracticalNervousDiseasesJan.2008,Vo1.11No.1?11?預(yù)后及治療應(yīng)用關(guān)系密切.PTEN是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因,它不僅有抑癌基因的特性,還有磷酸酶的活性,在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)路徑調(diào)控中起關(guān)鍵作用.通過(guò)對(duì)此通路的調(diào)控,可抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展,介導(dǎo)細(xì)胞凋亡.本研究發(fā)現(xiàn)PTEN在正常腦組織中均陽(yáng)性表達(dá),而在人腦星形細(xì)胞瘤各級(jí)組中的陽(yáng)性率表達(dá)隨惡性程度的升高而降低(P<0.05),表達(dá)的標(biāo)記指數(shù)與病理分級(jí)的關(guān)系呈負(fù)相關(guān)(:一0.618,P<0.05).表明PTEN的失活或介導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡等特性在人腦星形細(xì)胞瘤發(fā)生中起

17、關(guān)鍵作用.本研究發(fā)現(xiàn)Skp2與PTEN在人腦星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(:一0.487,P<0.05).腫瘤抑制蛋白PTEN是一個(gè)多功能磷酸酶,它通過(guò)磷脂酰肌醇3一激酶(PI3一激酶)通路抑制細(xì)胞的生長(zhǎng),控制細(xì)胞周期G1/S的轉(zhuǎn)換等,其中P27是關(guān)鍵下游靶2.最近,Mamillapalli等3研究發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞PTEN缺失引起P27蛋白水平下調(diào),伴隨Skp2蛋白表達(dá)的增加.相反,在人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤,PTEN蛋白過(guò)表達(dá)導(dǎo)致P27聚集,伴隨Skp2表達(dá)的減少;單純Skp2的過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)PTEN誘導(dǎo)的P27的聚集,恢復(fù)cyclin/CDK2激酶的活性,克服PTEN誘導(dǎo)的G1期細(xì)胞周期阻滯;重組

18、Skp2蛋白能使加入PI3一激酶抑制劑的細(xì)胞提取物中的P27泛素化.在人前列腺癌組織研究中也發(fā)現(xiàn)Skp2蛋白表達(dá)與P27及PTEN蛋白表達(dá)分別呈負(fù)相關(guān)4.這些結(jié)果及本研究結(jié)果表明在腦星形細(xì)胞瘤中PTEN低表達(dá)或缺失,可能導(dǎo)致Skp2高表達(dá),從而降低P27的表達(dá),提示Skp2蛋白過(guò)表達(dá)可能是發(fā)生和發(fā)展的一個(gè)重要原因.這也提示Skp2可能是PTEN/PI3-激酶通路調(diào)節(jié)P27蛋白表達(dá)的一個(gè)重要成分.綜上所述,Skp2和PTEN蛋白參與人腦星形細(xì)胞瘤發(fā)生,發(fā)展過(guò)程細(xì)胞周期的調(diào)控,而且互為影響.本實(shí)驗(yàn)表明上述兩個(gè)基因可作為人腦星形細(xì)胞瘤的診斷和惡性程度評(píng)估的參考指標(biāo),可能成為腦星形細(xì)胞瘤治療的新靶點(diǎn),

19、可以開(kāi)發(fā)以此分子為靶點(diǎn)的藥物.參考文獻(xiàn)1HaradaK,Supriatno,KawaguchiS,eta1.HighexpressionofS-phasekinase-associatedprotein2(Skp2)isastrongprognosticmarkerinoralsquarmouscellcarcinomapatientstreatedbyUrincombinationwithradiationJ.AnticancerRes,2005,25(3c):247124752GottschalkAR,BasilaD,WongM,eta1.P27Kip1isrequiredforPTENi

20、nducedG1growtharrestJ.CancerRes,2001,61(5):21052l113MamillapalliR,GavrilovaN,MihaylovaVT,eta1.PTENregulatestheubiquitindependentdegradationoftheCDKinhibitorP27(KIP1)throughtheubiquitinE3ligasescF(Skp2)J.CurrBio1,2001,l1(4):26326743YangG,AyalaG,DeMatzoA,eta1.ElevatedSkp2proteinexpressioninhumanprosta

21、tecancer:associationwithlossofthecyclindependentkinaseinhibitorp27andPTENandwithreducedrecurrence-freesurvivalJ.ClinCancerRes,2002,8(11);34193426(收稿2007-10-26)人mGluR1基因mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立刀筱芳伍雪英李寧徐亞歐何進(jìn)宇龔玉來(lái)高晉健1)西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院成都6100412)成都三六三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科成都610041【摘要】目的建立代謝型谷氨酸受體1(mGluR1)基因mRNA表達(dá)水平的TaqManreabtimePCR檢測(cè)方法.方法以actin為內(nèi)參基因,根據(jù)GenBank中人mGluR1及actin基因序列,分別設(shè)計(jì)了兩套特異性引物和TaqMan探針,接著對(duì)反應(yīng)的退火溫度,引物濃度