農(nóng)藥生物測定一至三章

1、農(nóng)藥生物測定緒論一、農(nóng)藥生物測定的含義 廣義的生物測定為：來自物理、化學(xué)、生理或心理的刺激，對生物整體（living organism）和活體組織（tissue）產(chǎn)生效力大小的度量（如：機械刺激、電刺激、各種射線的照射等）。 即：生物測定是研究作用物、靶標(biāo)生物和反應(yīng)強度三者關(guān)系的一項專門技術(shù)。 狹義的生物測定為：以生物的整體或離體的組織、細(xì)胞，對某些化合物的反應(yīng)，作為評價這些化合物生物活性的量度，運用特定的實驗設(shè)計，以生物統(tǒng)計為工具，測定供試對象在一定條件下效應(yīng)，即為生物測定。農(nóng)藥生物測定 ：運用特定的試驗設(shè)計，利用生物整體或離體的組織、細(xì)胞對農(nóng)藥（或某些化合物）的反應(yīng)并以生物統(tǒng)計為工具，分析

2、供試對象在一定條件下的效應(yīng)，來度量某種農(nóng)藥的生物活性。二、農(nóng)藥生物測定的簡史第一時期： 19世紀(jì)末1920至1923年間 事件：法國學(xué)者埃利希（R. C. Ehrlich）研究出測定白喉抗毒素含量的標(biāo)準(zhǔn)方法 特點：都是用單個動物體作直接的效力測定，將待測的藥劑與標(biāo)準(zhǔn)藥劑相比較來估計其相對藥效。 缺點：由于生物個體從受藥到中毒死亡需要一個過程，因而以生物中毒死亡為反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)測出的致死劑量總比實際反應(yīng)所需劑量大。第二時期：20世紀(jì)30年代至20世紀(jì)70年代 事件： 1937年歐文（J.O.Irvin）首先提出了系統(tǒng)的生物測定方法報告； 1947年芬尼（D.J.Finney）出版了系統(tǒng)的生物測定統(tǒng)計方

3、法； 1950年芬尼及古德溫（L.G.Goodwin）出版生物測定標(biāo)準(zhǔn)化一書； 1957年布斯維納（J.R.Busvine）出版殺蟲劑生物測定評述； 1959年張宗炳在其昆蟲毒理學(xué)一書中，以專章對殺蟲劑生物測定 及統(tǒng)計分析作了系統(tǒng)的論述； 1963年張澤薄等出版殺蟲劑及殺菌劑的生物測定； 特點：研究出以生物群體為反應(yīng)基礎(chǔ)的生物測定方法，提高了測定的準(zhǔn)確度。第三時期：20世紀(jì)70年代至今 特點：因具有各種特殊生理活性的化合物不斷出現(xiàn)，生測方法也在發(fā)展。 事例： 1.研究利用昆蟲神經(jīng)電生理法檢測化合物對昆蟲的拒食活性取得進(jìn)展。 2.殺菌劑也由以傳統(tǒng)的病原菌離體試驗方法為主，轉(zhuǎn)變?yōu)榧闹髦参锷系幕铙w試

4、驗為主。 3.20世紀(jì)80年代以來介于活體與離體之間的植物組織培養(yǎng)生物測定方法受到了廣泛的重視，如適用于細(xì)菌性病害篩選的塊根法；適用于大麥白粉病篩選的芽鞘表皮法等。三、生物測定的內(nèi)容 可以概括為活性篩選的常規(guī)測定、田間藥效試驗、殘留分析。也可以歸納為： 1.比較農(nóng)藥對昆蟲、病菌或植物的藥效或藥害； 2.比較農(nóng)藥不同方法、加工質(zhì)量、物理性狀對供試生物的藥效； 3.測定兩種或兩種以上農(nóng)藥混用的效力大小； 4.新研制化合物或農(nóng)藥對供試生物的藥效、藥害的篩選和評價； 5.研究供試生物內(nèi)在因素和環(huán)境因素對藥劑效力的關(guān)系； 6.鑒定生物體對農(nóng)藥的抗藥性； 7.測定農(nóng)藥在生物體內(nèi)外、土壤或環(huán)境中的殘留量。生

5、物測定的發(fā)展趨勢 植物細(xì)胞培養(yǎng)與生物測定相結(jié)合 從靶標(biāo)的角度制定生物測定方法 生物測定向自動化、微型化方向發(fā)展 四、農(nóng)藥生物測定的作用和地位 生物測定是開發(fā)新農(nóng)藥的重要手段一個新化合物從實驗室合成到正式投入生產(chǎn)必須經(jīng)過室內(nèi)毒力測定、溫室毒力測定和田間小區(qū)藥效試驗。因此生物測定是研制新農(nóng)藥、開展毒理學(xué)研究等方面的重要的先決條件。 生物測定還是農(nóng)藥使用的重要先決條件對表現(xiàn)活性高的化合物，除進(jìn)行大田藥效試驗外還要做殘留、對高等動物的毒性以及對有益生物和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)影響的生物測定研究，同時生產(chǎn)部門要對其劑型和加工技術(shù)進(jìn)行研究。可見生物測定也是合理科學(xué)使用農(nóng)藥、提高防效等方面的先決條件。另外發(fā)現(xiàn)新的試驗

6、方法等于發(fā)現(xiàn)新農(nóng)藥，新農(nóng)藥發(fā)現(xiàn)存在于生物測定過程的每個異?，F(xiàn)象之中。基于以上所述，有人曾把生物測定與化學(xué)合成比喻為前進(jìn)中的兩個車輪，兩者互相制約、互相促進(jìn)。五、生物測定的設(shè)計基本原則 1相對控制的實驗條件 外界環(huán)境條件的變化，如溫度、濕度、光照等對殺蟲劑的理化性狀和昆蟲的生理狀態(tài)都有直接或間接的影響。而殺蟲劑理化性能的變化，能影響其對昆蟲的毒效。 昆蟲的生理狀態(tài)，如發(fā)育階段、齡期、性別等的不同對殺蟲劑有不同的耐藥力。 因此在毒力測定中應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)目標(biāo)昆蟲和相對控制環(huán)境條件，盡可能將條件差異、人為因素及各種環(huán)境因素影響造成誤差消除或減少，提高試驗的精確度。 2必須設(shè)對照 在試驗期間往往有自然死亡情況

7、，因此藥劑處理組的死亡蟲數(shù)也包括自然死亡數(shù)，顯然這不完全是藥劑的作用效果，故應(yīng)設(shè)立對照加以校正，以消除自然因素所造成的死亡對藥劑效果的干擾。 對照有三種： 一種是不作任何處理的空白對照； 二是標(biāo)準(zhǔn)藥劑作對照，標(biāo)準(zhǔn)藥劑是選擇同類化合物防治某種病蟲害最有效的藥劑； 三是與藥劑處理所用的溶劑或乳化劑等助劑完全一樣，只是不含藥劑的對照。 3各種處理必須設(shè)重復(fù) 在生物種群與個體之間對藥劑的耐藥力不同，反應(yīng)有顯著的差異，取樣代表很重要，如果取樣少了，既有可能由于取樣不夠全面或不是隨機取樣而造成結(jié)果的片面性。 因此每個處理要求一定的數(shù)量，重復(fù)次數(shù)越多，試驗結(jié)果就越可靠。增加重復(fù)是減少誤差的一種方法，但也不能

8、或沒必要太多，應(yīng)根據(jù)試驗?zāi)康呐c要求以及不同的生物材料而定。重復(fù)次數(shù)一般為35次。從生物統(tǒng)計理論上講，增加重復(fù)次數(shù)減少每個重復(fù)的生物個體是減少試驗誤差的一種方法。 4運用生物統(tǒng)計分析試驗結(jié)果 生物統(tǒng)計是生物測定的基本條件，是判斷和評價試驗結(jié)果的重要工具。是在生物學(xué)指導(dǎo)下用概率論為基礎(chǔ)，描述偶然現(xiàn)象隱藏著必然規(guī)律的科學(xué)分析方法，它可以從錯綜復(fù)雜的實驗數(shù)據(jù)中揭露農(nóng)藥與生物之間的內(nèi)在聯(lián)系。 各種處理之間的差異的顯著程度，是不能憑主觀去認(rèn)定，必須通過客觀評定，用數(shù)理方法，精密而合理地計算出來。六、試驗結(jié)果的統(tǒng)計與分析一、毒力表示方法1、試蟲“死亡”的標(biāo)準(zhǔn) 試蟲經(jīng)處理一定時間后，其反應(yīng)有三種情況： 存活：

9、處理試蟲和對照試蟲同樣正常， 中毒：和對照組試蟲相比，處理試蟲明顯失常，如大量失水，不能正常爬行，翻倒，但對外界刺激仍有反應(yīng)； 死亡：試蟲完全停止活動，對外界刺激沒有任何反應(yīng)。2、校正死亡率 一般認(rèn)為，如果對照組的死亡率小于5，則死亡率和校正死亡率相差不大，可以不予校正；如果對照組死亡率大于5，則應(yīng)校正，如果對照組死亡率20以上，則在找出原因后，要重新進(jìn)行毒力測定。 有些要求嚴(yán)格的毒力測定，甚至在對照組死亡率達(dá)10以上時就應(yīng)重做。校正死亡率的計算多采用阿勃氏（Abbott，1925年）提出的公式：校正死亡率（）=（XY）/ X100X對照組生存率；Y處理組生存率；XY=真正由于藥劑處理的死亡率

10、。3.致死中量與致死中濃度 用來殺死群體中50%的個體所需要的劑量，用LD50表示，若用濃度表示就叫致死中濃度用LC50表示。4.有效中量與有效中濃度 指抑制50%病菌孢子萌發(fā)或菌絲生長所需要的劑量,用ED50來表示，若用濃度表示就叫有效中濃度,用EC50來表示。5.相對毒力指數(shù) 指幾種農(nóng)藥在不同時間、條件下分批進(jìn)行試驗、每次都用一標(biāo)準(zhǔn)藥劑來做對比，以該比值進(jìn)行毒力比較，這個比值就稱相對毒力指數(shù)，用TI表示。二、藥效的表示單位殺蟲劑 =處理區(qū)防治后存活的個體數(shù)量 =處理區(qū)防治前存活的個體數(shù)量 =對照區(qū)防治后存活的個體數(shù)量 =對照區(qū)防治前存活的個體數(shù)量殺菌劑發(fā)病率=病苗（株、葉、桿）數(shù) /檢查總

11、苗數(shù)（株、葉、桿）數(shù)100 病情指數(shù)=（病級葉數(shù)該病級）/檢查總?cè)~數(shù)最高級值100 病級值的劃分標(biāo)準(zhǔn)，可根據(jù)病害種類及癥狀、危害特點而靈活決定相對防治效果=對照區(qū)病情指數(shù)（%）-處理區(qū)病情指數(shù)（%）/對照區(qū)病情指數(shù)（%） 100% 除草劑三、結(jié)統(tǒng)計結(jié)果進(jìn)行分析1、劑量死亡率之間的關(guān)系 2、LD50與回歸式y(tǒng)=a+bx的求法 A、作圖法 以劑量對數(shù)值為橫坐標(biāo)(lgC)，校正死亡率機率值(P)為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)中相應(yīng)的位置上標(biāo)出各點，用目測法作一條平分各點的直線(應(yīng)使線兩例各點的垂直距離相加后相等)。此線即為毒力直線。 從機率值5處引出一條平行于橫軸的直線，在與毒力直線的交點處，引出一條平行于縱軸的

12、直線，與橫軸的相交處為LD50的對數(shù)值(圖1-1)，再查反對數(shù)即可得LD50。用該直線可求出毒力回歸式y(tǒng) = a+bx，取線上任意兩點的座標(biāo)（A:yl，xl，B：y2，x2），求b和a，將a和b代入y = a+bx,得回歸方程。 B、機率值分析法 該法必需將劑量轉(zhuǎn)換成對數(shù)(x lgC ，為自變量）；死亡率經(jīng)校正得校正死亡率，轉(zhuǎn)換為機率值（P = Y ，為依變量），經(jīng)過統(tǒng)計分析進(jìn)行計算。 （1）利用以下公式求出毒力回歸線：y = a+bxn為供試總蟲數(shù)，r為實際觀察的死亡蟲數(shù)，p為理論死亡率。按照y = a+bx，代入各x值求得各理論機率值y，由理論機率值y查機率表得理論死亡率。 （2）進(jìn)行卡方

13、檢驗：以上所得到的y = a+bx是否符合實際，須經(jīng)卡方（2）進(jìn)行適合性測定。只有2達(dá)顯著或極顯著差異時，說明y=a+bx符合實際，用它來求LD50值是可行的。 （3）求LD50值求出回歸方程并經(jīng)卡方檢測驗后，即可將機率值5代入回歸方程式，得LD50的對數(shù)值，再查反對數(shù)即可得LD50。 （4）致死中量的標(biāo)準(zhǔn)差 由于試驗設(shè)備，供試材料操作技術(shù)和環(huán)境條件的影響，有效中量必定有它的偏差，可用標(biāo)準(zhǔn)差（Sm）來表示。由機率值y查權(quán)重系數(shù)w表得出相應(yīng)的權(quán)重系數(shù)。致死中量實際應(yīng)為LD50Sm。標(biāo)準(zhǔn)差的計算公式為： (5)致死中量的置信限 致死中量(有效中量)的置信限是表明致死中量可靠范圍的限度，在統(tǒng)計上要求

14、，100次測驗中如果有95次能成功，就認(rèn)為達(dá)到最低可靠標(biāo)準(zhǔn)。也就是95%的可靠性，當(dāng)然也可以要求99的可靠性。計算公式為： 式中CL置信限，m致死中量，t機率值查t分布表 ，Sm致死中量的標(biāo)準(zhǔn)差。 第一章 殺菌劑生物測定技術(shù) 狹義的殺菌劑是指對真菌、細(xì)菌、病毒等病原菌有殺死或抑制作用的藥劑。 廣義的殺菌劑還包括對病原菌具有抑制作用的生防菌以及能誘導(dǎo)植物抗病性的化合物。 殺菌劑的作用方式 抑菌、殺菌、改變致病過程、提高抗病性 殺菌劑的使用方式 化學(xué)保護(hù)、化學(xué)治療、化學(xué)免疫一、殺菌劑生物測定技術(shù)概念 殺菌劑生物測定技術(shù)：是指將殺菌物質(zhì)作用于病原菌或感病植物體，根據(jù)生物活性大小或植物病害發(fā)展情況來判

15、斷藥劑效果的實驗方法。 殺菌劑對植物的藥害和對非靶標(biāo)生物的毒性實驗也屬于生物測定技術(shù)的范圍。二、殺菌劑生物測定技術(shù)方法 目前殺菌劑應(yīng)用最普遍的是離體( In vitro) 和活體( In vivo) 兩大生物測定技術(shù)。（一）、離體測定法 利用藥劑和病原菌直接接觸，來測定藥劑殺菌毒力的方法。即病原菌脫離寄主(感病植物等) 在人工培養(yǎng)基或無培養(yǎng)基的條件下，直接和藥劑接觸，觀察藥劑生物活性大小和類型。 離體條件下反映的僅是供試藥劑和病原菌的關(guān)系。所以觀察的指標(biāo)(菌絲生長速率、抑菌圈大小和孢子萌發(fā)率等) 是供試藥劑對病原菌直接毒力的表現(xiàn)。 殺菌劑的離體生物測定主要實驗方法 孢子萌發(fā)法；生長速率法；抑制

16、菌圈法（又稱為水平擴(kuò)散法） ；抑制菌絲產(chǎn)生孢子囊及釋放游動孢子試驗 ；殺菌劑的對峙培養(yǎng)法 ；生物殺菌劑的拮抗作用測定；殺菌劑混用后的聯(lián)合毒力測定 孢子萌發(fā)法 孢子萌發(fā)法是殺菌劑毒力測定中歷史最悠久、應(yīng)用最廣泛的方法。早在1807年就開始應(yīng)用。 孢子萌發(fā)法是：將不同藥劑或相同藥劑的不同濃度通過一定方法附著在玻片或其它平面上，當(dāng)藥液水分揮發(fā)后形成一層藥膜，在藥膜上滴加供試菌種的孢子懸浮液，或?qū)⑺巹┡c孢子懸浮液混合后，滴于載玻片上，保溫保濕培養(yǎng)一定時間后，使用顯微鏡檢查孢子的萌發(fā)情況。 玻片瓊脂表面萌發(fā)法 （洋菜薄層法） 懸滴法 生長速率法 將不同濃度的藥劑與融化的培養(yǎng)基混合，制成帶毒的培養(yǎng)基平面，

17、在平面上接種病原菌，通過菌落的生長速度來比較藥劑對供試病菌毒力的大小。 抑制菌圈法 抑制菌圈法最先用于研究抗菌素對細(xì)菌的作用，對研究殺細(xì)菌劑具有特殊的意義。目前也用于其它殺菌劑的研究。 在已接種的培養(yǎng)基上，施加少量的抗菌性物質(zhì)，使其接觸培養(yǎng)基和病原菌，經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)后，接觸部分的周圍由于抗菌物質(zhì)的擴(kuò)散而產(chǎn)生抑菌圈（或抑菌帶），其大小與藥劑濃度在一定范圍內(nèi)呈一定函數(shù)關(guān)系。以此來比較殺菌劑毒力大小或進(jìn)行生物測定。抑制菌圈法主要實驗方法 管碟法 濾紙片法 孔碟法 滴下法 洋菜柱法 抑制菌絲產(chǎn)生孢子囊及釋放游動孢子試驗 本試驗方法僅限于測定能產(chǎn)生孢子囊和孢子囊能釋放游動孢子的真菌，如疫霉菌，其原理

18、是在一定藥劑濃度的培養(yǎng)液中培養(yǎng)病菌，一定時間后檢查產(chǎn)生孢子囊和釋放游動孢子情況，來比較毒力大小。 殺菌劑的對峙培養(yǎng)法 在天然物農(nóng)藥研究過程中，常規(guī)的篩選方法難以對微量的分離物進(jìn)行抗菌活性跟蹤。為了建立簡便、快速的篩選方法，提出了查尋天然物抗菌活性物質(zhì)的“對峙培養(yǎng)法”?；铙w生物殺菌劑的拮抗作用測定 作用機理包括有：拮抗作用、競爭作用、重寄生、誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性等。 兩種殺菌劑混用后對生物的聯(lián)合作用有三種：相加作用，即農(nóng)藥混用后對有害生物的毒力等于混用農(nóng)藥各單劑單獨使用時毒力之和；增效作用，即農(nóng)藥混用時對有害生物的毒力大于各單劑單用時毒力的總和；拮抗作用，即農(nóng)藥混用時對有害生物的毒力低于各單劑單用時

19、毒力的總和。 1、交叉濾紙條法（平滑相接，表示相加作用；相接處凹出，表示增效作用；相接處凸入，表示拮抗作用） 2、共毒系數(shù)法（二）、殺菌劑活體生物測定 在室內(nèi)控制條件下，殺菌劑、病原菌和活體寄主共存體系中觀察藥劑生物活性大小和類型的方法。 它反映的是特定環(huán)境下病原菌、寄主和藥劑三者關(guān)系，病原菌活性受藥劑和寄主生物雙重影響，所觀察的指標(biāo)(病斑大小、發(fā)病率等) 是病原菌、寄主和藥劑的綜合表現(xiàn)。 活體測定法按測試材料主要有離體組織、器官接種試驗、種子殺菌劑藥效試驗、果實防腐劑生物測定等；按作用方式又可分為先接種后藥劑處理的治療作用測定和先藥劑處理后接種的保護(hù)作用測定。溫室的盆栽測定、大田的藥效測定以

20、及室內(nèi)的一些方法都是該類測定方法。 活體生物測定優(yōu)點：該法的測定結(jié)果與實際應(yīng)用較為接近。 活體生物測定缺點：活體生物測定相對耗力、耗物、周期長，程序復(fù)雜。 殺菌劑的活體生物測定主要實驗方法： 抗病毒劑的測定方法；蠶豆葉片法篩選水稻紋枯病殺菌劑 ；子葉篩選法（黃瓜子葉法）；蘿卜塊根篩選法（濾紙片接種法）；防治香蕉炭疽病菌的組織篩選法 抗病毒劑的測定方法測定方法：浸漬法 常用的接種方法：摩擦接種 病毒的定量培育 評判標(biāo)準(zhǔn)：病斑增值面積或病毒的增值率三、殺菌劑生物測定方法發(fā)展趨勢 1離體試驗向細(xì)胞水平發(fā)展 從宏觀或微觀的角度觀察藥劑對整個作用對象形態(tài)的影響。2活體試驗向植株組織水平發(fā)展 從生理學(xué)的角

21、度選用特異的分離的器官或細(xì)胞等觀察藥劑的作用。3離體與活體試驗相結(jié)合向分子水平發(fā)展 從生物化學(xué)的角度建立測定藥劑效力的方法。常用的洗滌劑 1、鉻酸洗滌液：是強氧化劑，去污能力很強。 2、酸和堿：器皿上粘有焦油、樹脂等物質(zhì)，用洗液不易去掉，可以用濃的硫酸或氫氧化鈉溶液（40）使它們?nèi)芙夂笙慈ァ?3、肥皂和其它洗滌劑 ：肥皂水加熱后去污能力更強。10%的磷酸鈉溶液去油脂的能力很強，比用肥皂水洗滌更加干凈。常用的培養(yǎng)基 培養(yǎng)基的種類很多，到1930年為止已經(jīng)報道了將近2500種，以后不斷增加，很難統(tǒng)計現(xiàn)有培養(yǎng)基的數(shù)目。這里只列舉一些實驗室中常用的培養(yǎng)基。 1、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：主要用于真菌的分

22、離和培養(yǎng) 2、肉汁胨培養(yǎng)基：主要用于細(xì)菌的分離和培養(yǎng) 3、植物組織和煎汁 ：適用于菌種的保存。 4、玉米粉瓊膠培養(yǎng)基 ：有些真菌能在這種培養(yǎng)基上產(chǎn)生孢子和子實體，有些卵菌能在上面產(chǎn)生有性世代。 5、麥芽膏瓊膠培養(yǎng)基：適宜于酵母菌和高等擔(dān)子菌的生長 6.燕麥片瓊膠培養(yǎng)基 :促使某些真菌形成孢子和子實體，也適用于保存腐霉屬（Pythium）和疫霉屬（Phytophthora）真菌的菌種 7、查彼（Czapek）培養(yǎng)液:組合培養(yǎng)基中常用 8、土壤浸漬液瓊膠培養(yǎng)基:培養(yǎng)許多土壤微生物 滅菌方法包括物理滅菌、化學(xué)滅菌、過濾滅菌 1、干熱滅菌 ：干熱滅菌主要是利用于熱空氣滅菌，常用的是將器皿放到烘箱內(nèi)加熱

23、的方法 2、濕熱滅菌 ：應(yīng)用最廣泛的是高壓蒸氣滅菌。 3、紫外線滅菌：可利用紫外燈來滅菌。紫外線殺菌最有效的波長為20002800，尤其以25002600 最常用。 4、化學(xué)滅菌 ：一般限于對一些加熱易損壞或發(fā)生變化的物品，如植物的枝、葉、莖、瓜果等多用化學(xué)滅菌。 5、過濾滅菌 是用細(xì)菌不能通過的濾器，將溶液過濾得到無菌的濾液。 農(nóng)藥田間藥效試驗田間藥效試驗設(shè)計原則 重復(fù)原則 （減少誤差的方法，一般4-5次） 局部控制原則 （力求諸如環(huán)境、日常管理、蟲口密度等條件一致。） 隨機排列原則（抽簽或摸紙團(tuán)法盡量不摻入人的主觀因素進(jìn)行處理的排列）以上每一種原則都必須設(shè)對照區(qū)與保護(hù)行田間實驗設(shè)計方法：1

24、、配對法設(shè)計：一種新藥與一種標(biāo)準(zhǔn)藥劑或空白對照做比較，設(shè)計簡單操作方便，但是會浪費對照用地。2、隨機區(qū)組設(shè)計（應(yīng)用最多的一種）對照加入處理一起進(jìn)行重復(fù)、隨機排列 重復(fù)次數(shù)12/（7-1）+13、拉丁方設(shè)計 每種藥劑或處理包括對照在內(nèi)，在每一橫行及直行必須出現(xiàn)一次。 橫行數(shù)=直行數(shù)=處理組田間調(diào)查取樣的方法大五點法 Z字法棋 盤式法 對角線法 分行法田間取樣大小 水稻、谷子、小麥密植作物：每點調(diào)查一米雙行作物上的蟲數(shù) 棉花、玉米寬行作物：每點調(diào)查20-40株，檢查全株或植株的一部分 果樹：以株為單位，按果樹不同部位調(diào)查 雜草：以單位面積為取樣點，一般0.5-1平方米第二章 殺蟲劑生物測定 一、殺

25、蟲劑生物測定的內(nèi)容： 1、新藥的殺蟲活性篩選 2、化合物構(gòu)效關(guān)系 3、殺蟲劑劑型及加工質(zhì)量與藥效關(guān)系 4、殺蟲劑混用及增效劑應(yīng)用 5、害蟲抗藥性研究 6、農(nóng)藥殘留檢測 7、對植物的藥害試驗 安全性指數(shù)K=藥劑防治病蟲害所需最低濃度/植物對藥劑能忍受的最高濃度 8、對高等動物的毒性試驗二、殺蟲劑生物測定的影響因素 外界因素： 環(huán)境因素：溫度、濕度、光照等對殺蟲劑的理化性狀和昆蟲的生理狀態(tài)都有影響。 藥劑等因素：溶劑、藥劑含量、藥劑處理部位等 。藥劑等因素 溶劑：不同溶劑對昆蟲表皮的穿透率不同，單位時間內(nèi)藥量也不同，在體內(nèi)的代謝速率也不同，最后到達(dá)靶標(biāo)部位的藥量也不同，結(jié)果就有明顯的差別。 藥劑含

26、量：殺蟲劑的藥劑含量直接影響測量結(jié)果，所以一般要求純度95%以上，或者原藥。 藥劑處理部位：藥劑處理部位不同實驗結(jié)果也不同。如點滴法常因點滴部位不同，得到的毒力不同，點滴部位遠(yuǎn)則毒力低，以點滴于足或腹部末端毒力最低。一般以點滴胸背面或腹背部為宜。 供試體自身因素 殺蟲劑理化性能的變化，能影響對昆蟲的毒效。昆蟲的生理狀態(tài)，如發(fā)育階段、性別、營養(yǎng)、世代等的不同對殺蟲劑有不同的耐藥力。三、目標(biāo)昆蟲 標(biāo)準(zhǔn)目標(biāo)昆蟲： 是指被普遍采用的、具有一定代表性和經(jīng)濟(jì)意義，以及抗藥力穩(wěn)定均勻的農(nóng)藥殺蟲毒力和毒效指示試蟲群體。 1、完全飼養(yǎng) 就是昆蟲的整個生活史都是在人為控制條件下完成的。例如斜紋夜蛾（完全變態(tài)的昆蟲

27、），從卵幼蟲蛹成蟲。 2、不完全飼養(yǎng) 就是在人工飼養(yǎng)條件下完成部分生活史例如蝗蟲（漸變態(tài)昆蟲），從若蟲成蟲。飼養(yǎng)可以在室外，也可以在室內(nèi)進(jìn)行。 （一）、飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)目標(biāo)昆蟲的先決條件A:目標(biāo)昆蟲應(yīng)容易飼養(yǎng)，繁殖力強，不互相殘殺，不受季節(jié)的限制，能保證周年充分供應(yīng)。B:供試目標(biāo)昆蟲要求有一定代表性和經(jīng)濟(jì)意義。C:目標(biāo)昆蟲群體的生活力和抗藥力要穩(wěn)定和均勻一致 。D:選用合適的蟲期、齡期、年齡的試蟲群體或混合群體作測試對象。試蟲選用原則 試蟲群體間的蟲期比例、蟲齡、年齡及蟲體大小接近一致，蟲齡不宜過大或過小，新羽化的或年齡過大的試蟲群體均不宜采用。 鱗翅目幼蟲作觸殺試驗時應(yīng)用3-4 齡，胃毒試驗4-5

28、齡，家蠅用3-7d 齡成蟲，蚜蟲以無翅成蚜，棉紅蜘蛛以活動型成蟲（體色為橘紅或鮮紅）為宜，不應(yīng)選用暗（褐）紅色的老熟成蟲。（二）、飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)目標(biāo)昆蟲的注意事項 1、種蟲 選生活史、繁殖力和抗病力較強的優(yōu)良種蟲。 2、營養(yǎng)條件 一般的營養(yǎng)條件是要求有適量的碳水化合物、蛋白質(zhì)和氨基酸、脂肪和脂肪酸和輔助營養(yǎng)要素 基本維生素、昆蟲的特殊維生素和礦物質(zhì)等。 3、環(huán)境條件： 溫度、濕度 、光照 四、目標(biāo)昆蟲的移取方法：1、一般移取法 2、趨光法 3、麻醉法：二氧化碳法、揮發(fā)蒸氣法 、冷凍法、乙醚低溫麻醉法 4、吸蟲法 5、自行遷移法殺蟲劑的生物測定技術(shù) 1、噴粉及噴霧法 優(yōu)點：簡單，測定結(jié)果接近于田間實際

29、情況； 缺點：不能避免藥劑從口中進(jìn)入，每頭試蟲接觸的藥劑量不能精確計算。 注意事項：藥液稍干或蟲體粘粉較穩(wěn)定后才可以移出目標(biāo)昆蟲。要防止試蟲逃跑。 2、點滴法（局部施藥法） 優(yōu)點：每頭蟲體點滴量一定，可以準(zhǔn)確地計算出每頭試蟲或每克蟲體重的用藥量；方法比較精確，試驗誤差?。豢梢员苊馕付咀饔玫母蓴_。 缺點：處理目標(biāo)昆蟲的數(shù)量不能太多，準(zhǔn)確性在很大程度上決定于昆蟲本身的生理狀態(tài)。點滴部位、點滴大小以及目標(biāo)昆蟲處理前的麻醉方式等都有影響，操作技術(shù)難掌握，尤其點滴蚜蟲時，點滴操作技術(shù)要熟練，否則對結(jié)果準(zhǔn)確性影響較大3、浸漬法 浸漬法是一種測定殺蟲藥劑觸殺毒力的室內(nèi)測試技術(shù)。因方法簡單快速，不需要特殊儀器

30、設(shè)備，常用于有效化合物的篩選試驗，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）推薦為蚜蟲抗藥性的標(biāo)準(zhǔn)測定方法。 優(yōu)點：快速、簡便，可以同時對大批試蟲做不同濃度的處理，適用于多種昆蟲。 缺點：不能精確求得每個昆蟲或每克蟲體重所獲藥量，浸漬時不能避免少量藥液進(jìn)入試蟲消化道和氣管，所以測得結(jié)果不是單純的觸殺毒力。4、藥膜法 優(yōu)點：藥膜法比較接近實際防治情況、方法簡單、操作方便、應(yīng)用范圍廣，幾乎一切爬行的昆蟲都適用，結(jié)果比較準(zhǔn)確。是目前常用的一種方法。 缺點：藥膜法還存在一定局限性，如昆蟲的足部表皮是殺蟲藥劑穿透的主要部位時，采用藥膜法測得的毒效就偏高，如家蠅，藥膜法的毒效高于點滴法。對于某些目標(biāo)昆蟲，足部表皮不是殺蟲

31、劑穿透的主要部位或不能穿透的，采用此法測得的結(jié)果就偏低。藥膜法測得的結(jié)果不能表示準(zhǔn)確的劑量，即不能表示每克昆蟲體重接受的藥量，只能用單位面積的藥量來表示。而單位面積的藥量并不等于藥劑進(jìn)入蟲體的劑量。藥膜法主要有以下幾種方法：1、 濾紙藥膜法 2、培養(yǎng)皿藥膜法 3、玻璃容器藥膜法 4、蠟紙藥膜法二、 殺蟲劑胃毒作用毒力測定 昆蟲在取食正常食物的同時將藥劑攝入消化道，經(jīng)腸壁細(xì)胞吸收進(jìn)入血液，隨血液循環(huán)到達(dá)作用部位而使昆蟲中毒。它利用昆蟲的貪食性，因此要盡量避免藥劑與昆蟲體壁接觸而產(chǎn)生其它毒殺作用。測定方法有 1、無限取食法：飼料混藥喂蟲法；培養(yǎng)基混藥法 ；土壤混藥法 2、定量取食法 ：液滴飼喂法；

32、 口腔注射法； 葉片夾毒法；機率值分析法（改進(jìn)葉片夾毒法） 四、 殺蟲劑熏蒸作用毒力測定 熏蒸時，毒劑主要以氣態(tài)從昆蟲的氣門進(jìn)入氣管，再分布到全身的氣管，然后到達(dá)神經(jīng)作用部位。 測定熏蒸劑毒力時，溫度對毒力的影響極大。 一方面溫度影響了藥劑的揮發(fā)和擴(kuò)散， 另一方面溫度影響了試蟲的新陳代謝，影響氣門開閉的程度和頻率，從而影響熏蒸劑進(jìn)入昆蟲體內(nèi)的量。 濕度對毒力也有一定影響。一般以溫度25，相對濕度70為宜。熏蒸作用主要的實驗方法：二重皿熏蒸法 ；干燥器熏蒸法；廣口瓶法藥紙熏蒸法；三角瓶法五 昆蟲拒食活性的測定 昆蟲拒食劑，簡單地講，就是可以干擾或抑制昆蟲取食行為的物質(zhì)。 近年來，拒食作用機理的研

33、究進(jìn)展很快。昆蟲的嗜食性基本上是由位于昆蟲的觸角、下顎須、下唇須上的感化器功能所決定的，感化器將食物的特性轉(zhuǎn)變成電信號傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而決定取食與否。拒食劑的作用可能正是干擾了這些感化器的正常功能。 目前，國內(nèi)外廣泛采用的測定拒食活性的主要方法有4種：葉碟法及改良葉碟法、體重法、排泄物質(zhì)法及電訊號法。 選擇拒食活性：將處理葉碟和2張對照葉碟交錯放入一個培養(yǎng)皿；在培養(yǎng)皿中央放進(jìn)一頭饑餓的試蟲。要求試蟲齡期一致、個體大小近似。 非選擇拒食活性：將處理葉碟放在一個培養(yǎng)皿內(nèi)，將對照葉碟放在另一培養(yǎng)皿內(nèi)。在培養(yǎng)皿中央放進(jìn)一頭饑餓24h的試蟲。六 殺螨劑對螨類的毒力測定 （一）浸玻片法 （二）葉片殘毒

34、法 第三章 除草劑生物測定 除草劑的生物測定技術(shù)是指利用植物（主要指有害植物）對除草劑的反應(yīng)，來測定除草劑的毒性及效果的基本方法。 除草劑常規(guī)生物測定特點 一般是利用生物活體作靶標(biāo)，通過觀察除草劑對靶標(biāo)生物的生長發(fā)育、形態(tài)特征、生理生化等方面的反應(yīng)來判斷除草劑的生物活性。除草劑生物測定的方法：按照評價指標(biāo)的不同分為：1、種子萌發(fā)鑒定法；2、植株生長量鑒定法；3、生理指標(biāo)鑒定按照供試生物材料不同分為:整株水平測定、組織或器官水平測定、細(xì)胞或細(xì)胞器水平測定、酶水平測定 1整株水平測定 是用整株植物來測定除草劑的活性。一般是在溫室用盆缽、培養(yǎng)皿或小杯如玻璃杯或一次性塑料杯培養(yǎng)供試的指示植物，根據(jù)不同

35、要求用供試除草劑處理，待藥害癥狀明顯后進(jìn)行觀察評價。評價的指標(biāo)包括出苗率、株高、地上部重量和地下部重量等，還可對植物受害癥狀進(jìn)行分級，再計算綜合藥害指數(shù)。 2組織或器官水平測定 組織或器官水平測定一般在實驗室進(jìn)行，常用的有種子。用種子測定時培養(yǎng)器皿可以采用培養(yǎng)皿或小杯，培養(yǎng)皿的培養(yǎng)介質(zhì)一般是水（但也可以是石英砂、土、瓊脂、濾紙），即在培養(yǎng)皿內(nèi)墊上濾紙，加入除草劑的水溶液進(jìn)行培養(yǎng)。測定的指標(biāo)可以是主根長或地上部鮮重或株高，具體采用哪種指標(biāo)應(yīng)根據(jù)預(yù)備實驗結(jié)果確定，實驗數(shù)據(jù)經(jīng)分析后選擇穩(wěn)定性和相關(guān)性較好，以及容易測定的指標(biāo)。 3 細(xì)胞或細(xì)胞器水平測定 細(xì)胞或細(xì)胞器水平測定一般是針對特定作用機制的除草

36、劑，常用的細(xì)胞器有葉綠體和線粒體。根據(jù)葉綠體和線粒體中一些特定的生理生化反應(yīng)測定生理指標(biāo)。 對許多光合作用抑制劑，可以測定希爾反應(yīng)活性，其希爾反應(yīng)活性的測定不直接測定放氧活性，而是測定鐵氰化鉀光還原能力，再折算成放氧活力。這種方法被證明能很好的測定除草劑活性。 在離體線粒體條件下，用瓦氏呼吸裝置測定氧的吸收和磷氧比，從而確定呼吸作用抑制劑活性。 除光合作用和呼吸作用的指標(biāo)外，還可以選用細(xì)胞器中特定物質(zhì)含量作為指標(biāo)。常用的指標(biāo)是葉綠素含量。 4酶水平測定 對那些已知作用靶標(biāo)的除草劑，生物測定可在酶水平上進(jìn)行。 如對草甘膦的生物活性，可以通過測定植物體內(nèi)莽草酸的累積量來測定。因為草甘膦作用于芳香族

37、氨基酸合成過程中的一種重要酶EPSP合成酶，導(dǎo)致莽草酸積累，因此測定植物體內(nèi)莽草酸的累積量可以得知草甘膦活性的大小。 磺酰脲類除草劑抑制乙酰乳酸合成酶活性，因此可以用乙酰乳酸合成酶活性的變化測定植物對磺酰脲類除草劑的敏感程度。 上述的整株水平測定主要測定植株生長量，組織或器官水平測定主要是種子萌發(fā)鑒定，而細(xì)胞或細(xì)胞器水平測定及酶水平測定則主要是生理指標(biāo)鑒定。除草劑生物測定技術(shù)的應(yīng)用 對大量化合物逐級過篩，選擇具有使用價值的除草劑品種。除草劑的篩選程序有兩種： 一是直接采用盆栽法或圃場試驗進(jìn)行初篩，然后將初篩入選的化合物進(jìn)行田間試驗。這一程序的優(yōu)點是切合生產(chǎn)實際，可靠性大；缺點是篩選周期長、工作

38、量很大。 二是先在實驗室內(nèi)進(jìn)行簡易初篩，將初篩入選的化合物再進(jìn)行盆栽或圃場試驗復(fù)篩，最后再進(jìn)入大田試驗。這一程序的最大優(yōu)點是大大減少了工作量。這種篩選程序成敗的關(guān)鍵取決于簡易初篩所采用的生物測定方法。簡易初篩的生測應(yīng)具備下述4個條件：1、方法簡便，快速 2、條件易于控制，結(jié)果可靠，防止誤篩或漏篩； 3、有較廣的測定范圍； 4、對同類藥劑或作用方式相同的藥劑，其劑量與除草活性有一定的相關(guān)性。二、為某一種或某幾種優(yōu)勢雜草尋求最有效的除草劑 在人力、物力有限的條件下，從一系列除草劑候選品種，通過生測，比較這些供試除草劑的活性，從中挑選出10余種進(jìn)行盆栽試驗，最后選出35種進(jìn)行大田試驗。 除草劑生物測

39、定技術(shù)在這個方面應(yīng)用要注意一個問題，即生測中所用的指示生物即為某種或某幾種雜草，這就要求試驗者根據(jù)這種雜草的生物學(xué)特性，設(shè)計出一種合適的生物測定程序。三、利用生物測定進(jìn)行除草劑特性的研究 1、明確植物對除草劑的主要吸收和傳導(dǎo)部位 植物的不同部位對除草劑的吸收能力差異很大，研究植物對除草劑的主要吸收、傳導(dǎo)部位的實際意義在于決定正確的施藥方法。 2、除草劑在土壤中的動態(tài)研究 研究除草劑在土壤中的持效、淋溶、吸附、移動以及殘留 四、利用生物測定進(jìn)行除草劑應(yīng)用技術(shù)的研究 多用盆栽法進(jìn)行。除草劑應(yīng)用技術(shù)的研究大致包括下列7個方面： 合適劑量、合適的處理方法 、最佳處理時間 、除草劑混用、混配測定方法、除草劑的選擇性、用于除草劑殘留量分析 除草劑實驗方法一、種子萌發(fā)鑒定 指示植物的種子（常用黃瓜、高粱）在藥劑處理過的砂土內(nèi)萌發(fā)，一般不以萌發(fā)率作為評判指標(biāo)，而是在萌發(fā)后一定時間內(nèi)測定根和莖的長度，并以此作評判標(biāo)準(zhǔn)。 激素型除草劑，如2，4-D類，一般采用這