生物化學(xué)I英文版課件：（新）chapter 3 AA and primary structure of protein（part 2）

1、3.6 Peptide bonds link amino acids in proteins 3.7 Protein Purification Techniques,多肽的雙縮脲反應(yīng)(Biuret reaction)是多肽特有的顏色反應(yīng);雙縮脲是兩分子的尿素經(jīng)加熱失去一分子NH3而得到的產(chǎn)物。 雙縮脲能夠與堿性硫酸銅作用，產(chǎn)生蘭色的銅-雙縮脲絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。含有兩個以上肽鍵的多肽（三肽以上），具有與雙縮脲相似的結(jié)構(gòu)特點，也能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，生成紫紅色或藍紫色絡(luò)合物（540nm)。這是多肽定量測定的重要反應(yīng)。,3.6 Peptide bonds link amino acids in p

2、roteins,1. Discovery of peptide bond:,Peptide bond - linkage between amino acids is a amide bond Formed by condensation of the a-carboxyl of one amino acid with the a-amino of another amino acid (loss of H2O molecule) Primary structure - linear sequence of amino acids in a polypeptide or protein,2.

3、Polypeptide chain nomenclature,Amino acid “residues” compose peptide chains Peptide chains are numbered from the N (amino) terminus to the C (carboxyl) terminus Example: (N) Gly-Arg-Phe-Ala-Lys (C) (or GRFAK) Formation of peptide bonds eliminates the ionizable a-carboxyl and a-amino groups of the fr

4、ee amino acids = side chains contribute mostly to the protein charge, solubility , and shape,pentapeptide （五肽）,Main chain and side chain,Peptide group(unit),Oligopeptide (up to about 20AA) Polypeptide (usually more than 20AA),Most of the ionic charges in proteins are contributed by side chains of AA

5、s,雖是單鍵卻有雙鍵性質(zhì) 周邊六個原子在同一平面上 前后兩個a-carbon在對角(trans),C-N 0.145 nm (正常),C=N 0.133 nm,C=N 0.125 nm (正常),酰胺平面 由肽鍵周圍的6個原子組成的剛性平面,部分雙鍵,偶極（0.28）,肽平面（酰胺平面）,兩個相鄰酰胺平面繞Ca的旋轉(zhuǎn),四肽的結(jié)構(gòu),肽鍵的構(gòu)型,穩(wěn)定 不穩(wěn)定,肽的來源： 蛋白質(zhì)水解 激素：insulin, 胰高血糖素，催產(chǎn) 素，加壓素，舒緩激肽 活性肽 抗生素：短桿菌肽S，多粘菌素E， 放線菌素D，抗菌肽 其 它：腦啡肽，鵝膏蕈堿， GSH 活性肽中存在肽鍵，AA和DAA，以防止 蛋白酶的水解。,

6、L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短桿菌肽S(環(huán)十肽) 由細菌分泌的多肽，有時也都含有D-氨基酸和一些非蛋白氨基酸。如:鳥氨酸（Ornithine, 縮寫為 Orn）。,Aspartame(阿斯巴甜 ) is a sweetening agent which is about 200 times sweeter than table sugar.,3.7 Protein Purification Techniques,General procedure: 1. Preparing a solution of

7、proteins; 2. Crude fractionation (separation); 3. Fine fractionation (separation);,in as few steps as possible in as short a time as possible,A. Preparing a solution of proteins,物理法凍融法，超聲波法，均漿法，研磨法等。 酶裂解法就是利用水解酶將細胞壁和細胞膜消化的方法，常用的水解酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶、糖苷酶、殼多糖酶、細胞壁溶解酶等。其中溶菌酶主要對細菌類有作用，其他酶對酵母作用顯著。,Ultrasonic

8、homogenizer,B. Purification methods of proteins Purification methods according to difference of solubility; Purification methods according to difference of molecular mass (size); Purification methods according to difference of charge; Purification methods according to the interaction of a protein wi

9、th other compounds;,1. Purification methods according to difference of solubility (1) Isoelectric precipitation (2) Salting in and Salting out W=505（S2S1）/（10.285S2） V = 100（S2S1）/（1S2） (3) Organic solvent precipitation (4) Heating precipitation,有機溶劑沉淀法（Organic solvent precipitation）,2. Purification

10、 methods according to difference of molecular mass(size) (1) Gel filtration chromatography（molecular exslusion chromatography) (2) membrane separation technique（Dialysis and ultrafiltration） (3) Density gradient centrifugation,(1) Gel filtration chromatography,Vt = Vo + Vi + Vm Vi + Vm= Vt Vo Kd =（V

11、e Vo）/ Vi,VeVo = ab logM logM = K1K2 Ve,分部收集器,紫外監(jiān)測儀,記錄儀,常用凝膠過濾介質(zhì),Sephadex：交聯(lián)葡聚糖，是采用環(huán)氧氯丙烷作交聯(lián)劑將右旋葡聚糖交聯(lián)而成。干粉容易膨脹，在水、鹽溶液、有機溶液、堿和弱酸中化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可高壓滅菌。高交聯(lián)度的Sephadex，其顆粒堅硬，適于高流速下操作。 Sephacryl : 烯丙基葡聚糖同N、N甲叉雙丙烯酰胺共價交聯(lián)而成。顆粒堅硬，性質(zhì)比Sephadex更為穩(wěn)定，可高壓滅菌，在pH311條件下穩(wěn)定，可用有機溶劑洗脫，也可用SDS、尿素及鹽酸胍洗脫。,Sepharose：瓊脂糖凝膠，是將瓊脂糖溶液冷卻，多糖鏈

12、形成雙螺旋，凝集成束，自發(fā)的形成穩(wěn)定的珠狀顆粒。瓊脂糖由氫鍵維系，在pH49條件下穩(wěn)定，超過40熔化，冷凍出現(xiàn)珠狀。 可分為Sepharose 2B、4B、6B（即含瓊脂2%、4%、6%）。 Sepharose CL 又稱交聯(lián)瓊脂糖，是Sepharose 同 2，3-二溴丙醇在強堿下交聯(lián)而成。在pH311條件下穩(wěn)定。 Sepharose Fast Flow 是經(jīng)過高度交聯(lián)的瓊脂糖珠體，大大增加了其機械強度，以流速快為特征。由于流速快，所以工業(yè)規(guī)模使用。有極高的物理化學(xué)穩(wěn)定性，可用多種有機溶劑清洗，還可用1-2mol/L的NaOH進行“原位清洗”。,瓊脂糖凝膠的骨架結(jié)構(gòu),交聯(lián)葡聚糖凝膠的骨架結(jié)構(gòu)

13、,凝膠的再生和保養(yǎng),凝膠過濾柱一般可多次使用，無需特殊的再生處理。但當多次使用后，凝膠可能被壓緊，流速變慢。這時需要重新填裝。 葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠都是碳水化合物，能被微生物（如細菌和霉菌）分解。為防止細菌生長和發(fā)酵，可用0.02%疊氮鈉等防腐劑。層析前再用緩沖液將防腐劑洗去。 保存：短期保存，可在反復(fù)洗滌除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)后，加入防腐劑；長期保存，則需將凝膠從柱中取出，進行洗滌、脫水和干燥。方法是將凝膠用低濃度的酸或堿溶液短時間浸泡，再用水反復(fù)洗滌除去雜質(zhì)，過濾抽干，浸泡在50%乙醇溶液中進行脫水。最終浸泡在75%乙醇中長期保存。,一些注意事項,為了提高分辨率，柱高應(yīng)為柱直徑的2040倍；

14、上樣量應(yīng)小于柱床體積的5%，最大不應(yīng)超過柱床體積的10%，上樣的蛋白質(zhì)樣品濃度以不超過4%為宜，渾濁樣品需離心后上樣。 洗脫時，流速要恒定。緩沖液的pH值、離子強度等必須都有利于蛋白質(zhì)穩(wěn)定；中等離子強度的緩沖液有助于消除蛋白質(zhì)與凝膠可能產(chǎn)生的相互作用； Sephadex在使用前需要溶脹，一份凝膠加10份水；在搖床上或手動混合，避免使用電力攪拌器；待凝膠顆粒沉降后，去除上清，重復(fù)幾次，直到液相不再混濁為止；自然溶脹需24h或幾天，加熱可促進溶脹，12h即可完成；,(2) membrane separation technique Dialysis and ultrafiltration,膜分離技

15、術(shù)-微濾,微濾主要用于除菌過濾、細胞收集和產(chǎn)品的澄清，采用的微濾膜孔徑為0.1-10mm，適用的驅(qū)動力為0.1-0.5MPa。 采用微濾方法，可做到封閉式操作，不與環(huán)境產(chǎn)生交叉污染，所用設(shè)備投資少，操作過程安全，加工量可大可小等優(yōu)點。,膜分離技術(shù)-超濾（ ultrafiltration）,超濾主要用于大分子物質(zhì)的分離、濃縮、除鹽和改變緩沖體系等，可分離分子量從3001,000,000Da的可溶性大分子物質(zhì)，在以截留的濃縮液為產(chǎn)物時，可達到濃縮的目的在濃縮大分子物質(zhì)時又可同時除去無機鹽及小分子不純物。 超濾膜孔徑為0.001-0.1mm，適用的驅(qū)動力為0.2-1MPa。 超濾具有膜材料本身無毒性

16、，在操作中不溶出有害物質(zhì)，故對終產(chǎn)品不會產(chǎn)生不利影響，可在室溫或低溫條件下操作，適于熱敏感物質(zhì)的分離濃縮；化學(xué)強度及機械損害最小，減少失活；系統(tǒng)可密閉循環(huán)，防止外來污染；處理效率高，設(shè)備經(jīng)濟簡單等優(yōu)點。,卷式超濾器,中空纖維超濾器,膜包,離心沉降技術(shù),離心沉降是利用固體和液體之間的密度差將兩者分離，一般來說細胞、細胞碎片、蛋白質(zhì)沉淀物及病毒顆粒的密度都大于其相應(yīng)的液體環(huán)境，可以利用離心的方式使其沉降。 沉降的難易取決于幾種因素：密度差越大，離心沉降速度越快；在密度差存在的條件下，分子的質(zhì)量越大，沉降速度越快，但體積大的分子出于阻力大，會影響其沉降速度；液體的粘稠度越大越不容易離心。,(3) D

17、ensity gradient centrifugation,Sedimentation coefficient (s)-單位離心力的沉降速度 s = dx/dt /2r 1S (Svedberg) =10-13 秒,離心沉降技術(shù),離心機按轉(zhuǎn)速可分為：普通離心機(500一4000rpm)、高速離心機(800一25000rpm)、超速離心機(2500080000rpm)和超高速離心機(150000rpm)。分子量大于108者可用高速和普通離心機， 106- 108者應(yīng)選用超速離心機，而小于106者用離心效果不好。 利用離心機分離物質(zhì)主要采用兩種方式：沉降速度法和沉降平衡法。,離心沉降技術(shù),沉降速

18、度法 主要用于分離沉降系數(shù)不同(相差達一個數(shù)量級以上)的物質(zhì)，這種方法采用差速離心，逐步分級增大離心力，開始在一個較低的速度下離心，使可溶物和不溶物分開，取上清后加大離心速度，使某些沉降系數(shù)大的物質(zhì)沉淀，然后再次去上清，加大離心力，再次獲得另一種物質(zhì)沉淀，如此反復(fù)多次，使不同物質(zhì)按沉降系數(shù)不同逐級分開。,離心沉降技術(shù),沉降平衡法 當兩種物質(zhì)的沉降系數(shù)差別不到一個數(shù)量級時，用沉降速度法很難分開，這時要借助于沉降平衡法來獲得比較滿意的分離效果，常用的為密度梯度離心法。這種方法的原理是人為造成離心管中不同的密度環(huán)境，使介質(zhì)的最大密度大于分離物的最大密度，這樣分離物在離心力的作用下，各自停留在與其密度

19、相當?shù)膮^(qū)域，從而達到分離的目的，這一方法的要點是離心時間要足夠，離心后分層收集。,(3) Density gradient centrifugation,臺式離心機,大容量離心機,超速離心機,超高速離心機,3. Purification methods according to difference of charge (1) Ion exchange chromatography： (2) Polyacrylamide gel electrophoresis（PAGE） (3) Isoelectric focusing electrophoresis（IEF）：,(1) Ion exchan

20、ge chromatography,離子交換層析類型,強酸型：磺乙基、磺丙基 陽離子交換樹脂 中酸型：磷酸基 弱酸型：羧甲基 強堿型：三乙基氨基乙基、 陰離子交換樹脂 二乙基（2羥丙基）氨基乙基 中強堿型：二乙基氨基乙基 弱堿型：氨基乙基、對氨基苯甲基,蛋白質(zhì)純化常用的離子交換劑,蛋白質(zhì)純化常用親水性離子交換劑。因為親水性離子交換劑對生物大分子物質(zhì)的吸附和洗脫均較溫和，被分離純化的物質(zhì)不易被破壞。 纖維素類：纖維素離子交換劑是最早用于生物大分子分離的介質(zhì)，它具有松散的親水網(wǎng)絡(luò)，大孔隙、表面積大等優(yōu)點。但因以無定型為主，故很難用于層析柱操作。DEAE-Sephacel 是經(jīng)特殊交聯(lián)處理制成的珠狀

21、離子交換纖維素。,蛋白質(zhì)純化常用的離子交換劑,葡聚糖系離子交換介質(zhì)：主要以Sephadex系的產(chǎn)品為主，它是在Sephadex G25及G50兩種凝膠過濾介質(zhì)上引入功能基后，產(chǎn)生的多種離子交換介質(zhì)。該類介質(zhì)容量大，價格較低，但由于流速、體積受外界影響較大，逐漸被新一代的BioProcess凝膠所代替。 瓊脂糖系（agarose)：瓊脂糖凝膠介質(zhì)上引入功能基得到的多種離子交換劑。其中，新一代BioProcess系列凝膠，具有流速高，載量大，理化穩(wěn)定性好，可就地清洗，并可反復(fù)使用，是目前使用最多的離子交換介質(zhì)。,Test-tube methods for selecting ion exchang

22、e conditions,(2) SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE）,Monomer：Acrylamide，Methylenebisacrylamide; Accelerator：TEMED （N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine）; Initiator：Ammonium Persulfate； Denaturant：SDS； Reductant：-Mercaptoethanol;,Staining：1. Coomassie brilliant blue G-250 2. Silver staini

23、ng,SDSPAGE,logM = K1K2R,(3) Isoelectric focusing electrophoresis （IEF）,（）,（）,（+）,（+）,Principle of IEF,Principle of IEF,2-D electrophoresis,Condition A,Condition B,SAMPLE PREPARATION,FIRST DIMENSION,SECOND DIMENSION,STAINING,IMAGING,ANALYSIS & EXTRACTION,MASS SPECTROMETRIC IDENTIFICATION OF SPOTS,2-D

24、 Expression Proteomics Methodology,Types of proteins,Proteomics - study of large sets of proteins, such as the entire complement of proteins produced by a cell E. coli has about 4000 different polypeptides (average size 300 amino acids, Mr 33,000) Fruit fly (Drosophila melanogaster) about 16,000, humans, other mammals about 40,000 different polypeptides,4. Purification met