藏豬興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體EAAC1基因的克隆與原核表達(dá)

1、農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究第 32 卷農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究第 32 卷第 6 期vol32 no6 2011 年 11 月research of agricultural modernization nov 2011 藏豬興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體 eaac1 基因的克隆與原核表達(dá)傅德智 1, 2，孔祥峰 1，楊煥勝 1, 2，褚武英 1, 3，李鐵軍 1，印遇龍（1. 中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心， 湖南 長(zhǎng)沙 410125；2. 中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京 100049；3. 長(zhǎng)沙大學(xué)生物工程與環(huán)境科學(xué)系，湖南 長(zhǎng)沙 410003）摘 要：興奮性氨

2、基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體 eaac1 是腸道內(nèi)谷氨酸的主要載體。本研究根據(jù)人的基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，以藏豬空 腸總 rna 為模板，通過(guò) rt-pcr 獲得一長(zhǎng)約 1600 bp 的 cdna 片段，t/a 克隆后測(cè)序，并進(jìn)行序列分析；將該基因片段連接到原 核表達(dá)載體 pet-32a（+）中構(gòu)建融合表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到 e. coli bl21（de3）中進(jìn)行表達(dá)。測(cè)序結(jié)果顯示，獲得的 cdna 全長(zhǎng)為1575 bp，編碼 524 個(gè)氨基酸；eaac1 分子量為 57 kd，等電點(diǎn)為 5.34，genbank 登錄號(hào)為 gq375513；該蛋白質(zhì)具有 3 個(gè) n-糖基 化位點(diǎn)、8 個(gè)蛋白激酶 c 磷酸

3、化位點(diǎn)和 1 個(gè) camp/cgmp 依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，含有 7 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)信號(hào)肽序列； sds-page 電泳檢測(cè)結(jié)果表明，表達(dá)蛋白質(zhì)與預(yù)期蛋白質(zhì)大小一致。上述結(jié)果為進(jìn)一步研究 eaac1 的功能及其調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞：藏豬；興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體；序列分析；原核表達(dá)中圖分類號(hào)：q781，q786文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：a文章編號(hào)：1000-0275(2011)06-0756-05gene cloning and prokaryotic expressing of excitatory amino acid carrier 1 in tibetan pigfu de-zhi1,2,

4、kong xiang-feng1, yang huan-sheng1,2, chu wu-ying1,3, li tie-jun1, yin yu-long1 (1. key laboratory for agro-ecological processes in subtropical region/hunan engineering and research center of animal and poultry science, institute of subtropical agriculture, the chinese academy of sciences, changsha,

5、 hunan410125, china; 2. graduate university of chinese academy of sciences, beijing 100049, china; 3. department ofbiotechnology and environmental science, changsha university, changsha, hunan 410003, china)abstract：excitatory amino acid carrier 1 (eaac1) is the major transporter of glutamate in the

6、 intestine. a cdnafragment about 1600 bp was amplified from the total rna of jejunum in tibetan piglets by rt-pcr with a pair of specific primers based on the sequences of human. the recombinant vector was constructed by inserting the cdna fragment into the prokaryotic expression vector pet-32a （）an

7、d then transformed into e. coli bl21 (de3). sequenceanalysis showed that the orf of eaac1 cdna in tibetan piglets was 1575 bp in length encoding 524 amino acid residues with a molecular mass of 57 kd and isoionic point of 5.34. its genbank accession number is gq375513. three putative extracellular n

8、-glycosylation sites, eight potential protein kinase c phosphorylation sites and one deduced camp/cgmp-dependent protein kinase phosphorylation site were identified. seven proposed transmembrane domains and a n-terminus signal peptide were presented in eaac1 sequence. the sds-page displayed that the

9、 expressed protein was consistent with the size of expected protein. these findings maybe provide some scientific basis for the study on function and regulation of eaac1 in pigs.key words：tibetan pig; excitatory amino acid carrier 1; sequence analysis; prokaryotic expression蛋白質(zhì)在小腸內(nèi)被消化為小肽和游離氨基酸，并由腸道上

10、皮細(xì)胞刷狀緣膜和基底膜上存在的大量轉(zhuǎn)運(yùn)載體介導(dǎo)，被 腸壁細(xì)胞吸收參與體內(nèi)代謝1。游離氨基酸和小肽的跨膜轉(zhuǎn) 運(yùn)在蛋白質(zhì)消化吸收過(guò)程中是相當(dāng)關(guān)鍵的步驟。仔豬攝入的 日糧谷氨酸 50以上在腸道中被完全氧化生成 co2，其產(chǎn)量 高于消化道葡萄糖氧化產(chǎn)生的 co2 數(shù)量2, 3。腸道中的酸性氨 基酸（包括谷氨酸和天冬氨酸）不僅主要用于氧化供能，也是合 成谷胱甘肽、精氨酸和脯氨酸等生物活性分子的重要前體4, 5。興 奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體 eaac1 是腸道內(nèi)酸性氨基酸的主要載 體。kanai 和 hediger 通過(guò)原位雜交對(duì)小腸中 eaac1 進(jìn)行研 究，發(fā)現(xiàn) eaac1 僅表達(dá)在腸上皮細(xì)胞；同時(shí)，eaa

11、c1 也在腎 臟中表達(dá)，推測(cè)其很可能參與酸性氨基酸的重吸收過(guò)程6。對(duì) eaac1 基因的克隆、測(cè)序及原核表達(dá)研究，有助于在分子水 平上開展腸道上皮細(xì)胞酸性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制與調(diào)控技術(shù)研究，對(duì)提高動(dòng)物蛋白質(zhì)利用效率和生產(chǎn)性能、降低氮排放具有重大實(shí)踐價(jià)值。藏豬是我國(guó)著名的小型地方豬種，具有體 型小、基因純合、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)7，與其他動(dòng)物模型相比，其 解剖、生理和代謝特點(diǎn)更類似于人類，可作為研究人類腸道 發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的理想動(dòng)物模型 8。關(guān)于藏豬 eaac1 cdna 的克隆至今尚未見報(bào)道，為此，本研究以藏豬為試驗(yàn)材 料，設(shè)計(jì)擴(kuò)增 eaac1 基因的引物進(jìn)行克隆和序列分析，并通 過(guò)原核表達(dá)獲得 ea

12、ac1 蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步探討酸性氨基酸 吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 樣品采集試驗(yàn)動(dòng)物為 28 日齡純種藏豬，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物中心。通過(guò)注射過(guò)量 10%戊巴比妥鈉溶液處死仔豬，快基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （編號(hào)：31110103909、30928018、30901040、31001016）；中國(guó)科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新工程重要方向項(xiàng)目 （編號(hào)：kzcx2-ew-412）。作者簡(jiǎn)介：傅德智（1986-），男，碩士研究生，主要從事分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究。通訊作者：印遇龍（1956-），男，研究員，主要從事動(dòng)物生態(tài)營(yíng)養(yǎng)與分子 生物學(xué)研究。收稿日期：2011- 05- 05，修回日期

13、：2011- 09- 28速取出空腸，置于 1.5 ml 指型管中液氮速凍，轉(zhuǎn)入 - 70 保存?zhèn)溆谩?.2 rna 提取和 cdna 合成利用 trizol 試劑（invitrogen，usa）提取空腸總 rna，操作 步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。紫外比色法測(cè)定總 rna的 濃度，1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) rna 質(zhì)量。 利用 dnase i（fermentas，usa） 處理 rna 樣品，除去可能殘留的基因組dna；利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（fermentas，usa），合成第一鏈 cdna。1.3 eaac1 的克隆根據(jù)人的 eaac1 基因序列，用軟件 primer 5.0 設(shè)計(jì)藏豬 ea

14、ac1 基因的特異引物。上游引物為 5- atggggaaacc ggcgagga- 3；下游引物為 5- ctagaactgggaggtctgg gtg a- 3。藏豬 eaac1 片段的預(yù)期長(zhǎng)度為 1575 bp。pcr 的 擴(kuò)增條件為：94 預(yù)變性 5 min；94 變性 30 s，52 退火45 s，72 延伸 2 min，共 30 個(gè)循環(huán)；最后 72 延伸 10 min。 pcr 產(chǎn)物用 2%瓊脂糖凝膠在 tbe 電泳緩沖液中分離。將純 化的 pcr 產(chǎn)物連接到 pgem- t 載體 （promega，usa） 上，用 ecor酶切篩選陽(yáng)性克隆，送上海英濰捷基有限公司測(cè)序。1.4 重

15、組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定根據(jù)克隆的核苷酸序列設(shè)計(jì)含特定酶切位點(diǎn)（ecori/ xhoi）的 引 物 ，上 游 引 物 為 5- cggaattcatggggaaa ccggcgagga- 3，下 游 引 物 為 5- ccgctcgagctagaa ctgggaggtctgggtg- 3，在上、下游引物的 5端分別加入 ecori 和 xhoi 酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基 （下劃線部分為酶切位 點(diǎn)，斜體部分為保護(hù)堿基）。純化 pcr 產(chǎn)物和 pet- 32a(+)載體（merk，德國(guó)） 用 ecori 和 xhoi 酶切進(jìn)行亞克隆。重組質(zhì)粒pet32a- eaac1 經(jīng)酶切驗(yàn)證，送上海英濰捷基有限公司測(cè)

16、序。1.5 重組蛋白質(zhì)的表達(dá)與純化將重組質(zhì)粒 pet32a- eaac1 和空載質(zhì)粒 pet- 32a（+）分 別轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株 bl21（de3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取抗性單菌落接 種于 3 ml 液體 lb 培養(yǎng)基中 （含 100 g/ml 卡那霉素）37 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日以 1：100 的比例轉(zhuǎn)接到新的液體 lb 培 養(yǎng)基中 （含 100 g/ml 卡那霉素）37振蕩培養(yǎng)至 od6000.6 時(shí)，加 iptg（終濃度為 1 mmol/l）分別誘導(dǎo) 0h、1h、2h、4h 和 6 h，其間離心收集菌體，用 100 l sds 凝膠加樣緩沖液 重懸，混勻后沸水浴 5 min，12 000 轉(zhuǎn)離心

17、1 min，取 20 l 上 清液于 12%的 sds- page 電泳檢測(cè)。將誘導(dǎo) 6 h 后收集的菌體用 50 mmol/l 的磷酸鈉緩沖液 重懸細(xì)胞。加入 5 mg 溶菌酶，室溫下消化 0.5 h，超聲破碎 30 次。去除細(xì)胞碎片，用 hi- trap 鎳親和柱 （北京康為） 純化 eaac1 蛋白質(zhì)。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，用 bradford 法進(jìn) 行蛋白質(zhì)定量。12%丙烯酰胺進(jìn)行 sds- page，分析純化后的 蛋白質(zhì)。1.6 生物信息學(xué)分析利 用 motifscan 軟 件（http:/myhits.isb- sib.ch/cgi- bin/ motifscan）分析 eaac

18、1 開放閱讀框（orf），推導(dǎo)氨基酸序列， 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)；利用 signalp 3.0 server（http:/www. cbs.dtu.dk/services/signalp/）預(yù)測(cè)信號(hào)肽；利用 clustal w 軟件進(jìn)行序列間同源性比對(duì)；利用 pir（http:/pir.georgetown. edu/pirwww/search/pattern.shtml） 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)細(xì)胞外 n- 糖基化位點(diǎn)、蛋白激酶 c 磷酸化位點(diǎn)、camp/cgmp 依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)；利用 prop 1.0 server（http:/www.cbs.dtu.dk/ services/prop/

19、） 預(yù)測(cè)信號(hào)肽位點(diǎn)；利用 tmhmm（http:/www. cbs.dtu. dk/services/tmhmm- 2.0/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域；利 用 phyre（http:/www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre/index.cgi）預(yù)測(cè)蛋白 質(zhì) 三 級(jí) 結(jié) 構(gòu) ；利 用 protscale（http:/www.expasy.ch/tools/ protscale. html）分析蛋白質(zhì)疏水性。2 結(jié)果與分析2.1 藏豬 eaac1 基因全長(zhǎng) cdna 的克隆以藏豬空腸 cdna 為模板進(jìn)行 rt- pcr，擴(kuò)增出單一的 pcr 條帶（圖 1a），與預(yù)期大小一致。將該片段切

20、膠回收并連 接到 pgem- t 載體上，藍(lán)白斑篩選后，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒 定，結(jié)果表明該片段已成功連接至載體上（圖 1b）。將成功連 接的 pgem- t 載體進(jìn)行目的序列的測(cè)序，結(jié)果表明該片段含 有一個(gè)長(zhǎng)為 1575 bp 的 orf，并將該基因序列在 genbank 上 注冊(cè)（登錄號(hào)為 gq375513）。該基因編碼 524 個(gè)氨基酸，分子 量為 57.2 kd，等電點(diǎn)為 5.34。通過(guò) genbank 信息查詢和比 對(duì)，結(jié)果表明，該序列與其他物種的 eaac1 基因具有很高的同源性，如與普通豬、人和小鼠的同源性分別為 99.87%、90.27% 和 84.44% ，且該序列編碼的 肽鏈

21、和其他物種的 eaac1 蛋白質(zhì)具有高度的保守性，說(shuō)明該片段為藏豬的eaac1 基因。m12m 34bpbp450030001200200015001000ab圖 1rt- p cr 擴(kuò)增 eaac1 基因（a）和pgem- eaac1 酶切鑒定（b）注 ：m：dna marker；1，2：rt- pcr 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 ；3：pgem- eaac1 酶 切 ；4：pgem- eaac1 未酶切。2.2 藏豬 eaac1 基因的序列分析為了獲得藏豬 eaac1 的結(jié)構(gòu)和可能的功能信息，對(duì)該 基因進(jìn)行了深入的生物信息學(xué)分析。通過(guò) pir 預(yù)測(cè)，在藏豬 eaac1 中存在 3 個(gè) n- 糖基化位點(diǎn)

22、、8 個(gè)蛋白激酶 c 磷酸化位點(diǎn)和 1 個(gè) camp/cgmp 依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)（圖 2）。信號(hào)肽分析和剪切位點(diǎn)分析表明，eaac1 的 n 末端存在一個(gè)長(zhǎng) 31 個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，其剪切位點(diǎn)位于 glu31 和 ile32 之間，且信號(hào)肽序列在豬、牛、人、小鼠及大鼠中具有高度 的保守性。利用 motifscan 和 pir 進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，其具 有兩個(gè)鈉 / 二羧酸同向轉(zhuǎn)運(yùn)載體家族的信號(hào)序列以及 7 個(gè)潛 在跨膜結(jié)構(gòu)域，其中豬、牛、人、小鼠及大鼠具有相同的鈉 / 二 羧酸同向轉(zhuǎn)運(yùn)載體家族的信號(hào)序列，說(shuō)明其在結(jié)構(gòu)上具有高 度的保守性（圖 3）。運(yùn)用 protscale 進(jìn)行疏水

23、性分析，結(jié)果表 明，藏豬 eaac1 含有多個(gè)疏水性強(qiáng)的區(qū)域，具有明顯的跨膜 趨勢(shì)，這些疏水性強(qiáng)的區(qū)域和潛在的跨膜結(jié)構(gòu)域在氨基酸序 758 農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究第 32 卷列上具有很好的一致性（圖 4）。通過(guò) tmhmm 2.0 在線分析發(fā)現(xiàn)，藏豬 eaac1 含有 8 個(gè)潛在跨膜結(jié)構(gòu)和 1 個(gè)信號(hào)肽序列， 跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽序列與上述預(yù)測(cè)的基本一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽的存在。在 eaac1 成熟之前，信號(hào)肽被剪去，故成熟的 eaac1 肽鏈含有 7 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（圖 5）。圖 2 eaac1 基因 cdna 核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列注：* 代表終止子；方框代表 n- 糖基化位點(diǎn)；灰色代

24、表蛋白激酶 c 磷酸化位點(diǎn)；下劃線代表 camp/cgmp 依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。圖 3eaac1 氨基酸序列比對(duì)注：peaac1、ceaac1、heaac1、meaac1 和 reaac1 分別代表藏豬、牛、人、小鼠和大鼠的 eaac1；tm1- tm7 代表跨膜結(jié)構(gòu)域；方框代表信號(hào)肽序列；灰色代 表鈉 / 二羧酸同向轉(zhuǎn)運(yùn)載體家族信號(hào)序列。hohob./eisenberg et al.m12m 341.00.20.0- 0.2- 0.4bpbp8000600020001500100020001500ab0100 200 300 400 500 600amino acid

25、 positioneaac1 蛋白質(zhì)疏水性分析圖 6 p cr 擴(kuò)增（a）和 pet32a - eaac1 雙酶切鑒定（b）注：m：dna marker；1，2：pcr 擴(kuò)增產(chǎn)物；3：pet32a- eaac1 未酶切；4：pet32a- eaac1 酶切。圖 41.0約 57 kd 的蛋白質(zhì)，而空白對(duì)照 pet32a（+）質(zhì)粒表達(dá)的蛋白質(zhì)中沒有此條帶，且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，該蛋白質(zhì)的表達(dá) 量逐漸增加，誘導(dǎo) 6 h 后該蛋白質(zhì)的表達(dá)量最高。鎳親和柱一 步法純化該特異表達(dá)的蛋白質(zhì)，sds- page 電泳檢驗(yàn)其純 度，57 kd 附近出現(xiàn)特異性條帶（圖 7），分子量與軟件計(jì)算的 結(jié)果一致，說(shuō)明轉(zhuǎn)

26、化的大腸桿菌特異性表達(dá)了目的蛋白質(zhì) eaac1。0.20.00100200300inside400outside500transmembranem 1234567kd116圖 5eaac1 氨基酸跨膜分析6645352518.457kd2.3 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定以稀釋的測(cè)序質(zhì)粒 pgem- eaac1 為模板，擴(kuò)增到 1 條 約 1600 bp 的片段，與設(shè)計(jì)結(jié)果相符合（圖 6a）。pcr 純化產(chǎn) 物經(jīng) ecor i 和 xho i 雙酶切回收后，定向連接到 ecor i 和 xho i 雙 酶 切 的 pet32a (+) 載體上，獲得 重 組 質(zhì) 粒 pet32a-

27、 eaac1。 用 ecor i 和 xho i 雙酶切重組質(zhì)粒 pet32a- eaac1 可切出 1600 bp 左右的片段（圖 6b），表明擴(kuò) 增的 eaac1 片段已插入到載體質(zhì)粒中。為了進(jìn)一步證明重 組質(zhì)粒的構(gòu)建是否正確，在酶切鑒定基礎(chǔ)上，對(duì)重組表達(dá)質(zhì) 粒 pet32a- eaac1 進(jìn)行了序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果表明，連入表 達(dá)載體 pet- 32a(+)中的基因片段與目的序列一致，并且酶切 位點(diǎn)連接處序列也正確，未出現(xiàn)堿基突變及移碼現(xiàn)象，說(shuō)明 已獲得了正確的 eaac1 的原核表達(dá)重組質(zhì)粒。2.4 eaac1 基因的原核表達(dá)與 s ds - p age 分析將重組質(zhì)粒 pet32a-

28、eaac1 轉(zhuǎn)入到大腸桿菌 bl21 后， 用 iptg 誘導(dǎo)其表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒能夠特異表達(dá)一條圖 7 pet32a - eaac1 表達(dá)產(chǎn)物 s ds - p age 分析注：m：蛋白質(zhì) marker；1- 5：轉(zhuǎn)化 pet32a- eaac1 經(jīng) iptg 誘導(dǎo) 0h、1h、2h、4h 和 6 h 的總蛋白質(zhì)；6：轉(zhuǎn)化 pet32a （+） 空載體的總蛋白質(zhì)；7：純化后的eaac1 蛋白質(zhì)。3 結(jié)論與討論3.1 結(jié)論成功克隆了藏豬空腸 eaac1 cdna 的編碼區(qū)，其 cdna 全長(zhǎng)為 1575 bp，編碼 524 個(gè)氨基酸，分子量為 57 kd，等電點(diǎn) 為 5.34；eaac1

29、 蛋白質(zhì)具有 3 個(gè) n- 糖基化位點(diǎn)、8 個(gè)蛋白激 酶 c 磷酸化位點(diǎn)和 1 個(gè) camp/cgmp 依賴性蛋白激酶磷酸化 位點(diǎn)，具有 7 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)和 1 個(gè)信號(hào)肽；在大腸桿菌中成功 表達(dá)了 eaac1，獲得了融合蛋白質(zhì)。這為進(jìn)一步研究藏豬probabilityhydrophobicity 760 農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究第 32 卷eaac1 的組織分布、發(fā)育性表達(dá)規(guī)律、功能特性以及調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。3.2 討論動(dòng)物的蛋白質(zhì)（氨基酸）營(yíng)養(yǎng)及動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的高效利 用一直是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究關(guān)注的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題。隨著人和鼠 的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體 cdna 被克隆9，大量關(guān)于氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載 體轉(zhuǎn)運(yùn)特性的研究得以開展，

30、并陸續(xù)在分子水平上揭示了氨 基酸的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理。近年來(lái)，關(guān)于酸性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體 的研究取得了重要進(jìn)展。目前，在人上已經(jīng)克隆出了 5 種蛋 白質(zhì)亞型的酸性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體，并分別命名為 eaat1 / glast、eaat2/glt1、eaat3/eaac1、eaat4 和 eaat510，它 們?cè)谵D(zhuǎn)運(yùn)谷氨酸過(guò)程中均具有立體異構(gòu)性11。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 可調(diào)節(jié)神經(jīng)末梢谷氨酸的重?cái)z取12，其中 eaac1 是神經(jīng)末梢 中主要的神經(jīng)性谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白13。eaat 是鈉離子共轉(zhuǎn)運(yùn) 載體，在轉(zhuǎn)運(yùn)酸性氨基酸過(guò)程中同時(shí)需要偶聯(lián)鉀離子的反向 轉(zhuǎn)運(yùn)，以維持膜兩側(cè)的鈉離子梯度14。酸性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)廣 泛存在于動(dòng)物機(jī)

31、體中。例如，glast 和 glt- 1 存在于神經(jīng)膠 質(zhì)細(xì)胞中，而 eaac1 則存在于神經(jīng)元上15；glast 主要在小 腦表達(dá)，心臟、骨骼肌、胎盤和肺中也有表達(dá)16。本研究克隆的藏豬 eaac1 cdna 編碼區(qū)，長(zhǎng)度為 1575 bp，編碼 524 個(gè)氨基酸，與人和牛有相同的氨基酸數(shù)目，比小 鼠和大鼠多 1 個(gè)氨基酸17, 18。motifscan 和 pir 分析表明，藏豬 eaac1 含有 2 個(gè)鈉 / 二羧酸同向轉(zhuǎn)運(yùn)載體家族的信號(hào)序列， 屬于鈉 / 二羧酸同向轉(zhuǎn)運(yùn)載體家族。該家族成員一般含有710 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域19。從大鼠和人的 eaat1 末端拓?fù)浣Y(jié)構(gòu) 的研究來(lái)看，c 末端一側(cè)

32、有 4 個(gè)跨膜區(qū)域，在 8、9 兩個(gè)區(qū)域 為 2 個(gè)單環(huán)，形成一個(gè) v 字形結(jié)構(gòu)，并有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，第 7 和第 10 疏水區(qū)域存在底物識(shí)別位點(diǎn)，易位區(qū)域位于第 7 跨 膜區(qū)上的 tyr403 作為鉀離子結(jié)合位點(diǎn)，在氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程 中起著重要作用20。tmhmm2.0 預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，藏豬含有 7 個(gè)跨膜 結(jié)構(gòu)域，與人和牛數(shù)目一樣，但比小鼠和大鼠少 1 個(gè)跨膜結(jié) 構(gòu)域21。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的功能可以通過(guò)磷酸化和糖基化來(lái) 調(diào)控，所有的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體都含有 12 個(gè)進(jìn)化上保守的 糖基化位點(diǎn)。本研究分析表明，藏豬的 eaac1 含有 8 個(gè) n- 糖基化位點(diǎn)，包括兩個(gè)保守位點(diǎn)22。蛋白激酶 c 和 camp

33、/ cgmp 依賴性蛋白激酶也參與谷氨酸轉(zhuǎn)移載體的調(diào)控，在藏 豬 eaac1 上也發(fā)現(xiàn)了相對(duì)應(yīng)的潛在磷酸化位點(diǎn)23。本研究利 用構(gòu)建的原核表達(dá)載體 pet32a- eaac1，在大腸桿菌 bl21（de3）中表達(dá)了含 his- tag 的重組蛋白質(zhì)。pet32a（+）載體中 含有的組氨酸標(biāo)記物序列編碼的組氨酸標(biāo)記比通常所用的標(biāo) 記物相對(duì)分子量小、免疫性低、親和性好，便于分離與純化。參考文獻(xiàn)：g1208- g1217.reeds pj, burrin dg, stoll b, et al. intestinal glutamate metabolismj. j nutr, 2000(9): s7

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