內(nèi)科學(xué)專業(yè)畢業(yè)論文[精品論文]肝衰竭時(shí)肝細(xì)胞高遷移率族蛋白1的移位及釋放研究

1、內(nèi)科學(xué)專業(yè)畢業(yè)論文 精品論文 肝衰竭時(shí)肝細(xì)胞高遷移率族蛋白1的移位及釋放研究關(guān)鍵詞：肝衰竭 重型肝炎 高遷移率族蛋白-1 肝細(xì)胞hmgb1 細(xì)胞因子 tnf- 免疫熒光摘要：肝衰竭是一種病死率很高的臨床危重癥，在我國(guó)肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis bvirus，hbv)感染。而高遷移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，hmgb1)在細(xì)胞外是一種關(guān)鍵的“晚期”促炎癥介質(zhì)，已經(jīng)成為膿毒癥防治研究中一個(gè)重要的新靶標(biāo)。有研究表明hmgb1可能在重型肝炎肝衰竭中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討肝衰竭時(shí)肝細(xì)胞hmgb1的移

2、位及釋放情況。 目的：(1)研究lps或tnf-，刺激是否可引起肝細(xì)胞hmgb1的移位及釋放，檢測(cè)是否同時(shí)伴有其他細(xì)胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞hmgb1移位；(3)研究d-gain+lps誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠肝細(xì)胞hmgb1移位；(4)初步探討肝細(xì)胞hmgb1移位及釋放的可能機(jī)制。 方法：(1)體外用不同濃度lps或tnf-刺激肝細(xì)胞系hepg2細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清。mtt法測(cè)定細(xì)胞存活率，tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)上清中的ldh含量，以明確細(xì)胞是否凋亡或壞死。western blotting方法檢測(cè)培養(yǎng)上清，細(xì)胞核和細(xì)胞漿組分蛋白中hm

3、gb1的含量，免疫熒光技術(shù)觀察hmgb1移位。elisa，細(xì)胞因子芯片技術(shù)檢測(cè)上清中的細(xì)胞因子分泌。(2)分別收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝組織，免疫組織化學(xué)染色觀察hmgb1在肝細(xì)胞中的分布情況。同時(shí)行he染色，評(píng)估肝組織的病理學(xué)改變。(3) d-gain聯(lián)合lps腹腔注射，誘導(dǎo)小鼠急性肝衰竭模型，同時(shí)設(shè)置生理鹽水對(duì)照組。于d-galn+lps注射后3h處死動(dòng)物，收集肝臟組織，進(jìn)行hmgb1的免疫組織化學(xué)染色。(4)用western blotting和免疫熒光技術(shù)，分別觀察來(lái)普霉素b(lmb)和曲古霉素(tsa)對(duì)lps誘導(dǎo)的肝細(xì)胞hmgb1移位和釋放的影響。 結(jié)果：(1)體

4、外用lps或tnf-刺激可誘導(dǎo)hepg2細(xì)胞釋放hmgb1，釋放到上清中的hmgb1量隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)而增高，20h時(shí)達(dá)到峰值，免疫熒光觀察到hepg2細(xì)胞胞核中的hmgb1發(fā)生了向細(xì)胞漿的移位。在一定劑量范圍內(nèi)，lps(400ng/ml)或tnf-(25ng/ml)誘導(dǎo)的hmgb1分泌量隨lps或tnf-劑量增加而增加。mtt，tunel檢測(cè)及上清中l(wèi)dh含量測(cè)定排除了細(xì)胞處于凋亡及壞死狀態(tài)。細(xì)胞組分蛋白westem blotting分析亦證實(shí)了細(xì)胞漿中的hmgb1表達(dá)增強(qiáng)。elisa和細(xì)胞因子抗體芯片檢測(cè)表明lps，tnf-或重組hmgb1刺激hepg2細(xì)胞24h，僅見個(gè)別其他細(xì)胞因子的釋

5、放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞中可觀察到明顯的hmgb1的移位，移位率約為32.847.13。而在慢性乙型肝炎組及正常肝組織中，肝細(xì)胞hmgb1集中分布于細(xì)胞核中，未見明顯的移位。(3) d-galn+lps注射后3h，發(fā)生移位的肝細(xì)胞百分率為：27.424.99。移位率與生理鹽水對(duì)照組比較，顯著為高(p<0.01)。(4)體外crm1抑制劑lmb可以顯著減少lps誘導(dǎo)的hepg2細(xì)胞hmgb1的釋放，及hmgb1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿的移位。組蛋白去乙?；敢种苿﹖sa可以促進(jìn)lps誘導(dǎo)的hmgb1釋放，促進(jìn)hmgb1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿的移位。 結(jié)論：(1) lps或tnf-a可

6、時(shí)間及劑量依賴性誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的hepg2細(xì)胞核蛋白hmgb1的移位及釋放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞中存在hmgb1從細(xì)胞核向胞漿的移位，而在慢性乙型肝炎及正常對(duì)照肝細(xì)胞中并無(wú)這種移位現(xiàn)象。(3)d-gal+lps誘導(dǎo)的急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞hmgbi存在從細(xì)胞核向胞漿的移位。(4)lps誘導(dǎo)的hepg2細(xì)胞hmgb1的移位和釋放可能存在crm1依賴的核轉(zhuǎn)運(yùn)，可能與乙?；嚓P(guān)。正文內(nèi)容 肝衰竭是一種病死率很高的臨床危重癥，在我國(guó)肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis bvirus，hbv)感染。而高遷移率族蛋白l(high mobility gro

7、up box-1protein，hmgb1)在細(xì)胞外是一種關(guān)鍵的“晚期”促炎癥介質(zhì)，已經(jīng)成為膿毒癥防治研究中一個(gè)重要的新靶標(biāo)。有研究表明hmgb1可能在重型肝炎肝衰竭中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討肝衰竭時(shí)肝細(xì)胞hmgb1的移位及釋放情況。 目的：(1)研究lps或tnf-，刺激是否可引起肝細(xì)胞hmgb1的移位及釋放，檢測(cè)是否同時(shí)伴有其他細(xì)胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞hmgb1移位；(3)研究d-gain+lps誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠肝細(xì)胞hmgb1移位；(4)初步探討肝細(xì)胞hmgb1移位及釋放的可能機(jī)制。 方法：(1)體外用不同濃度lps或tnf-刺激肝細(xì)胞系hepg2細(xì)胞

8、，不同時(shí)間點(diǎn)分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清。mtt法測(cè)定細(xì)胞存活率，tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)上清中的ldh含量，以明確細(xì)胞是否凋亡或壞死。western blotting方法檢測(cè)培養(yǎng)上清，細(xì)胞核和細(xì)胞漿組分蛋白中hmgb1的含量，免疫熒光技術(shù)觀察hmgb1移位。elisa，細(xì)胞因子芯片技術(shù)檢測(cè)上清中的細(xì)胞因子分泌。(2)分別收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝組織，免疫組織化學(xué)染色觀察hmgb1在肝細(xì)胞中的分布情況。同時(shí)行he染色，評(píng)估肝組織的病理學(xué)改變。(3) d-gain聯(lián)合lps腹腔注射，誘導(dǎo)小鼠急性肝衰竭模型，同時(shí)設(shè)置生理鹽水對(duì)照組。于d-galn+lps注射后3h處

9、死動(dòng)物，收集肝臟組織，進(jìn)行hmgb1的免疫組織化學(xué)染色。(4)用western blotting和免疫熒光技術(shù)，分別觀察來(lái)普霉素b(lmb)和曲古霉素(tsa)對(duì)lps誘導(dǎo)的肝細(xì)胞hmgb1移位和釋放的影響。 結(jié)果：(1)體外用lps或tnf-刺激可誘導(dǎo)hepg2細(xì)胞釋放hmgb1，釋放到上清中的hmgb1量隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)而增高，20h時(shí)達(dá)到峰值，免疫熒光觀察到hepg2細(xì)胞胞核中的hmgb1發(fā)生了向細(xì)胞漿的移位。在一定劑量范圍內(nèi)，lps(400ng/ml)或tnf-(25ng/ml)誘導(dǎo)的hmgb1分泌量隨lps或tnf-劑量增加而增加。mtt，tunel檢測(cè)及上清中l(wèi)dh含量測(cè)定排除了細(xì)

10、胞處于凋亡及壞死狀態(tài)。細(xì)胞組分蛋白westem blotting分析亦證實(shí)了細(xì)胞漿中的hmgb1表達(dá)增強(qiáng)。elisa和細(xì)胞因子抗體芯片檢測(cè)表明lps，tnf-或重組hmgb1刺激hepg2細(xì)胞24h，僅見個(gè)別其他細(xì)胞因子的釋放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞中可觀察到明顯的hmgb1的移位，移位率約為32.847.13。而在慢性乙型肝炎組及正常肝組織中，肝細(xì)胞hmgb1集中分布于細(xì)胞核中，未見明顯的移位。(3) d-galn+lps注射后3h，發(fā)生移位的肝細(xì)胞百分率為：27.424.99。移位率與生理鹽水對(duì)照組比較，顯著為高(p<0.01)。(4)體外crm1抑制劑lmb可以顯

11、著減少lps誘導(dǎo)的hepg2細(xì)胞hmgb1的釋放，及hmgb1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿的移位。組蛋白去乙酰化酶抑制劑tsa可以促進(jìn)lps誘導(dǎo)的hmgb1釋放，促進(jìn)hmgb1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿的移位。 結(jié)論：(1) lps或tnf-a可時(shí)間及劑量依賴性誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的hepg2細(xì)胞核蛋白hmgb1的移位及釋放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞中存在hmgb1從細(xì)胞核向胞漿的移位，而在慢性乙型肝炎及正常對(duì)照肝細(xì)胞中并無(wú)這種移位現(xiàn)象。(3)d-gal+lps誘導(dǎo)的急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞hmgbi存在從細(xì)胞核向胞漿的移位。(4)lps誘導(dǎo)的hepg2細(xì)胞hmgb1的移位和釋放可能存在crm1依賴的核轉(zhuǎn)運(yùn)，可能與

12、乙?；嚓P(guān)。肝衰竭是一種病死率很高的臨床危重癥，在我國(guó)肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis bvirus，hbv)感染。而高遷移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，hmgb1)在細(xì)胞外是一種關(guān)鍵的“晚期”促炎癥介質(zhì)，已經(jīng)成為膿毒癥防治研究中一個(gè)重要的新靶標(biāo)。有研究表明hmgb1可能在重型肝炎肝衰竭中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討肝衰竭時(shí)肝細(xì)胞hmgb1的移位及釋放情況。 目的：(1)研究lps或tnf-，刺激是否可引起肝細(xì)胞hmgb1的移位及釋放，檢測(cè)是否同時(shí)伴有其他細(xì)胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝

13、細(xì)胞hmgb1移位；(3)研究d-gain+lps誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠肝細(xì)胞hmgb1移位；(4)初步探討肝細(xì)胞hmgb1移位及釋放的可能機(jī)制。 方法：(1)體外用不同濃度lps或tnf-刺激肝細(xì)胞系hepg2細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清。mtt法測(cè)定細(xì)胞存活率，tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)上清中的ldh含量，以明確細(xì)胞是否凋亡或壞死。western blotting方法檢測(cè)培養(yǎng)上清，細(xì)胞核和細(xì)胞漿組分蛋白中hmgb1的含量，免疫熒光技術(shù)觀察hmgb1移位。elisa，細(xì)胞因子芯片技術(shù)檢測(cè)上清中的細(xì)胞因子分泌。(2)分別收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝組織，

14、免疫組織化學(xué)染色觀察hmgb1在肝細(xì)胞中的分布情況。同時(shí)行he染色，評(píng)估肝組織的病理學(xué)改變。(3) d-gain聯(lián)合lps腹腔注射，誘導(dǎo)小鼠急性肝衰竭模型，同時(shí)設(shè)置生理鹽水對(duì)照組。于d-galn+lps注射后3h處死動(dòng)物，收集肝臟組織，進(jìn)行hmgb1的免疫組織化學(xué)染色。(4)用western blotting和免疫熒光技術(shù)，分別觀察來(lái)普霉素b(lmb)和曲古霉素(tsa)對(duì)lps誘導(dǎo)的肝細(xì)胞hmgb1移位和釋放的影響。 結(jié)果：(1)體外用lps或tnf-刺激可誘導(dǎo)hepg2細(xì)胞釋放hmgb1，釋放到上清中的hmgb1量隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)而增高，20h時(shí)達(dá)到峰值，免疫熒光觀察到hepg2細(xì)胞胞核中

15、的hmgb1發(fā)生了向細(xì)胞漿的移位。在一定劑量范圍內(nèi)，lps(400ng/ml)或tnf-(25ng/ml)誘導(dǎo)的hmgb1分泌量隨lps或tnf-劑量增加而增加。mtt，tunel檢測(cè)及上清中l(wèi)dh含量測(cè)定排除了細(xì)胞處于凋亡及壞死狀態(tài)。細(xì)胞組分蛋白westem blotting分析亦證實(shí)了細(xì)胞漿中的hmgb1表達(dá)增強(qiáng)。elisa和細(xì)胞因子抗體芯片檢測(cè)表明lps，tnf-或重組hmgb1刺激hepg2細(xì)胞24h，僅見個(gè)別其他細(xì)胞因子的釋放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞中可觀察到明顯的hmgb1的移位，移位率約為32.847.13。而在慢性乙型肝炎組及正常肝組織中，肝細(xì)胞hmgb1集中分布于細(xì)

16、胞核中，未見明顯的移位。(3) d-galn+lps注射后3h，發(fā)生移位的肝細(xì)胞百分率為：27.424.99。移位率與生理鹽水對(duì)照組比較，顯著為高(p<0.01)。(4)體外crm1抑制劑lmb可以顯著減少lps誘導(dǎo)的hepg2細(xì)胞hmgb1的釋放，及hmgb1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿的移位。組蛋白去乙酰化酶抑制劑tsa可以促進(jìn)lps誘導(dǎo)的hmgb1釋放，促進(jìn)hmgb1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿的移位。 結(jié)論：(1) lps或tnf-a可時(shí)間及劑量依賴性誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的hepg2細(xì)胞核蛋白hmgb1的移位及釋放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞中存在hmgb1從細(xì)胞核向胞漿的移位，而在慢性乙型肝炎及

17、正常對(duì)照肝細(xì)胞中并無(wú)這種移位現(xiàn)象。(3)d-gal+lps誘導(dǎo)的急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞hmgbi存在從細(xì)胞核向胞漿的移位。(4)lps誘導(dǎo)的hepg2細(xì)胞hmgb1的移位和釋放可能存在crm1依賴的核轉(zhuǎn)運(yùn)，可能與乙?；嚓P(guān)。肝衰竭是一種病死率很高的臨床危重癥，在我國(guó)肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis bvirus，hbv)感染。而高遷移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，hmgb1)在細(xì)胞外是一種關(guān)鍵的“晚期”促炎癥介質(zhì)，已經(jīng)成為膿毒癥防治研究中一個(gè)重要的新靶標(biāo)。有研究表明hmgb1可能在重型肝炎肝衰竭中發(fā)揮

18、重要作用。本研究旨在探討肝衰竭時(shí)肝細(xì)胞hmgb1的移位及釋放情況。 目的：(1)研究lps或tnf-，刺激是否可引起肝細(xì)胞hmgb1的移位及釋放，檢測(cè)是否同時(shí)伴有其他細(xì)胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞hmgb1移位；(3)研究d-gain+lps誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠肝細(xì)胞hmgb1移位；(4)初步探討肝細(xì)胞hmgb1移位及釋放的可能機(jī)制。 方法：(1)體外用不同濃度lps或tnf-刺激肝細(xì)胞系hepg2細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清。mtt法測(cè)定細(xì)胞存活率，tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)上清中的ldh含量，以明確細(xì)胞是否凋亡或壞死。western blott

19、ing方法檢測(cè)培養(yǎng)上清，細(xì)胞核和細(xì)胞漿組分蛋白中hmgb1的含量，免疫熒光技術(shù)觀察hmgb1移位。elisa，細(xì)胞因子芯片技術(shù)檢測(cè)上清中的細(xì)胞因子分泌。(2)分別收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝組織，免疫組織化學(xué)染色觀察hmgb1在肝細(xì)胞中的分布情況。同時(shí)行he染色，評(píng)估肝組織的病理學(xué)改變。(3) d-gain聯(lián)合lps腹腔注射，誘導(dǎo)小鼠急性肝衰竭模型，同時(shí)設(shè)置生理鹽水對(duì)照組。于d-galn+lps注射后3h處死動(dòng)物，收集肝臟組織，進(jìn)行hmgb1的免疫組織化學(xué)染色。(4)用western blotting和免疫熒光技術(shù)，分別觀察來(lái)普霉素b(lmb)和曲古霉素(tsa)對(duì)lps誘導(dǎo)

20、的肝細(xì)胞hmgb1移位和釋放的影響。 結(jié)果：(1)體外用lps或tnf-刺激可誘導(dǎo)hepg2細(xì)胞釋放hmgb1，釋放到上清中的hmgb1量隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)而增高，20h時(shí)達(dá)到峰值，免疫熒光觀察到hepg2細(xì)胞胞核中的hmgb1發(fā)生了向細(xì)胞漿的移位。在一定劑量范圍內(nèi)，lps(400ng/ml)或tnf-(25ng/ml)誘導(dǎo)的hmgb1分泌量隨lps或tnf-劑量增加而增加。mtt，tunel檢測(cè)及上清中l(wèi)dh含量測(cè)定排除了細(xì)胞處于凋亡及壞死狀態(tài)。細(xì)胞組分蛋白westem blotting分析亦證實(shí)了細(xì)胞漿中的hmgb1表達(dá)增強(qiáng)。elisa和細(xì)胞因子抗體芯片檢測(cè)表明lps，tnf-或重組hmgb

21、1刺激hepg2細(xì)胞24h，僅見個(gè)別其他細(xì)胞因子的釋放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞中可觀察到明顯的hmgb1的移位，移位率約為32.847.13。而在慢性乙型肝炎組及正常肝組織中，肝細(xì)胞hmgb1集中分布于細(xì)胞核中，未見明顯的移位。(3) d-galn+lps注射后3h，發(fā)生移位的肝細(xì)胞百分率為：27.424.99。移位率與生理鹽水對(duì)照組比較，顯著為高(p<0.01)。(4)體外crm1抑制劑lmb可以顯著減少lps誘導(dǎo)的hepg2細(xì)胞hmgb1的釋放，及hmgb1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿的移位。組蛋白去乙?；敢种苿﹖sa可以促進(jìn)lps誘導(dǎo)的hmgb1釋放，促進(jìn)hmgb1從細(xì)胞核

22、向細(xì)胞漿的移位。 結(jié)論：(1) lps或tnf-a可時(shí)間及劑量依賴性誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的hepg2細(xì)胞核蛋白hmgb1的移位及釋放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞中存在hmgb1從細(xì)胞核向胞漿的移位，而在慢性乙型肝炎及正常對(duì)照肝細(xì)胞中并無(wú)這種移位現(xiàn)象。(3)d-gal+lps誘導(dǎo)的急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞hmgbi存在從細(xì)胞核向胞漿的移位。(4)lps誘導(dǎo)的hepg2細(xì)胞hmgb1的移位和釋放可能存在crm1依賴的核轉(zhuǎn)運(yùn)，可能與乙酰化相關(guān)。肝衰竭是一種病死率很高的臨床危重癥，在我國(guó)肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis bvirus，hbv)感染。而高遷移率族

23、蛋白l(high mobility group box-1protein，hmgb1)在細(xì)胞外是一種關(guān)鍵的“晚期”促炎癥介質(zhì)，已經(jīng)成為膿毒癥防治研究中一個(gè)重要的新靶標(biāo)。有研究表明hmgb1可能在重型肝炎肝衰竭中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討肝衰竭時(shí)肝細(xì)胞hmgb1的移位及釋放情況。 目的：(1)研究lps或tnf-，刺激是否可引起肝細(xì)胞hmgb1的移位及釋放，檢測(cè)是否同時(shí)伴有其他細(xì)胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞hmgb1移位；(3)研究d-gain+lps誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠肝細(xì)胞hmgb1移位；(4)初步探討肝細(xì)胞hmgb1移位及釋放的可能機(jī)制。 方法：(1)體外用不同濃度

24、lps或tnf-刺激肝細(xì)胞系hepg2細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清。mtt法測(cè)定細(xì)胞存活率，tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)上清中的ldh含量，以明確細(xì)胞是否凋亡或壞死。western blotting方法檢測(cè)培養(yǎng)上清，細(xì)胞核和細(xì)胞漿組分蛋白中hmgb1的含量，免疫熒光技術(shù)觀察hmgb1移位。elisa，細(xì)胞因子芯片技術(shù)檢測(cè)上清中的細(xì)胞因子分泌。(2)分別收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝組織，免疫組織化學(xué)染色觀察hmgb1在肝細(xì)胞中的分布情況。同時(shí)行he染色，評(píng)估肝組織的病理學(xué)改變。(3) d-gain聯(lián)合lps腹腔注射，誘導(dǎo)小鼠急性肝衰竭模型，同時(shí)設(shè)置生理鹽水

25、對(duì)照組。于d-galn+lps注射后3h處死動(dòng)物，收集肝臟組織，進(jìn)行hmgb1的免疫組織化學(xué)染色。(4)用western blotting和免疫熒光技術(shù)，分別觀察來(lái)普霉素b(lmb)和曲古霉素(tsa)對(duì)lps誘導(dǎo)的肝細(xì)胞hmgb1移位和釋放的影響。 結(jié)果：(1)體外用lps或tnf-刺激可誘導(dǎo)hepg2細(xì)胞釋放hmgb1，釋放到上清中的hmgb1量隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)而增高，20h時(shí)達(dá)到峰值，免疫熒光觀察到hepg2細(xì)胞胞核中的hmgb1發(fā)生了向細(xì)胞漿的移位。在一定劑量范圍內(nèi)，lps(400ng/ml)或tnf-(25ng/ml)誘導(dǎo)的hmgb1分泌量隨lps或tnf-劑量增加而增加。mtt，t

26、unel檢測(cè)及上清中l(wèi)dh含量測(cè)定排除了細(xì)胞處于凋亡及壞死狀態(tài)。細(xì)胞組分蛋白westem blotting分析亦證實(shí)了細(xì)胞漿中的hmgb1表達(dá)增強(qiáng)。elisa和細(xì)胞因子抗體芯片檢測(cè)表明lps，tnf-或重組hmgb1刺激hepg2細(xì)胞24h，僅見個(gè)別其他細(xì)胞因子的釋放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞中可觀察到明顯的hmgb1的移位，移位率約為32.847.13。而在慢性乙型肝炎組及正常肝組織中，肝細(xì)胞hmgb1集中分布于細(xì)胞核中，未見明顯的移位。(3) d-galn+lps注射后3h，發(fā)生移位的肝細(xì)胞百分率為：27.424.99。移位率與生理鹽水對(duì)照組比較，顯著為高(p<0.0

27、1)。(4)體外crm1抑制劑lmb可以顯著減少lps誘導(dǎo)的hepg2細(xì)胞hmgb1的釋放，及hmgb1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿的移位。組蛋白去乙酰化酶抑制劑tsa可以促進(jìn)lps誘導(dǎo)的hmgb1釋放，促進(jìn)hmgb1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿的移位。 結(jié)論：(1) lps或tnf-a可時(shí)間及劑量依賴性誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的hepg2細(xì)胞核蛋白hmgb1的移位及釋放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞中存在hmgb1從細(xì)胞核向胞漿的移位，而在慢性乙型肝炎及正常對(duì)照肝細(xì)胞中并無(wú)這種移位現(xiàn)象。(3)d-gal+lps誘導(dǎo)的急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞hmgbi存在從細(xì)胞核向胞漿的移位。(4)lps誘導(dǎo)的hepg2細(xì)胞hmgb1的移位

28、和釋放可能存在crm1依賴的核轉(zhuǎn)運(yùn)，可能與乙酰化相關(guān)。肝衰竭是一種病死率很高的臨床危重癥，在我國(guó)肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis bvirus，hbv)感染。而高遷移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，hmgb1)在細(xì)胞外是一種關(guān)鍵的“晚期”促炎癥介質(zhì)，已經(jīng)成為膿毒癥防治研究中一個(gè)重要的新靶標(biāo)。有研究表明hmgb1可能在重型肝炎肝衰竭中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討肝衰竭時(shí)肝細(xì)胞hmgb1的移位及釋放情況。 目的：(1)研究lps或tnf-，刺激是否可引起肝細(xì)胞hmgb1的移位及釋放，檢測(cè)是否同時(shí)伴有其他細(xì)胞因

29、子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞hmgb1移位；(3)研究d-gain+lps誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠肝細(xì)胞hmgb1移位；(4)初步探討肝細(xì)胞hmgb1移位及釋放的可能機(jī)制。 方法：(1)體外用不同濃度lps或tnf-刺激肝細(xì)胞系hepg2細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清。mtt法測(cè)定細(xì)胞存活率，tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)上清中的ldh含量，以明確細(xì)胞是否凋亡或壞死。western blotting方法檢測(cè)培養(yǎng)上清，細(xì)胞核和細(xì)胞漿組分蛋白中hmgb1的含量，免疫熒光技術(shù)觀察hmgb1移位。elisa，細(xì)胞因子芯片技術(shù)檢測(cè)上清中的細(xì)胞因子分泌。(2)分別收集慢性重

30、型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝組織，免疫組織化學(xué)染色觀察hmgb1在肝細(xì)胞中的分布情況。同時(shí)行he染色，評(píng)估肝組織的病理學(xué)改變。(3) d-gain聯(lián)合lps腹腔注射，誘導(dǎo)小鼠急性肝衰竭模型，同時(shí)設(shè)置生理鹽水對(duì)照組。于d-galn+lps注射后3h處死動(dòng)物，收集肝臟組織，進(jìn)行hmgb1的免疫組織化學(xué)染色。(4)用western blotting和免疫熒光技術(shù)，分別觀察來(lái)普霉素b(lmb)和曲古霉素(tsa)對(duì)lps誘導(dǎo)的肝細(xì)胞hmgb1移位和釋放的影響。 結(jié)果：(1)體外用lps或tnf-刺激可誘導(dǎo)hepg2細(xì)胞釋放hmgb1，釋放到上清中的hmgb1量隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)而增高，20h時(shí)達(dá)

31、到峰值，免疫熒光觀察到hepg2細(xì)胞胞核中的hmgb1發(fā)生了向細(xì)胞漿的移位。在一定劑量范圍內(nèi)，lps(400ng/ml)或tnf-(25ng/ml)誘導(dǎo)的hmgb1分泌量隨lps或tnf-劑量增加而增加。mtt，tunel檢測(cè)及上清中l(wèi)dh含量測(cè)定排除了細(xì)胞處于凋亡及壞死狀態(tài)。細(xì)胞組分蛋白westem blotting分析亦證實(shí)了細(xì)胞漿中的hmgb1表達(dá)增強(qiáng)。elisa和細(xì)胞因子抗體芯片檢測(cè)表明lps，tnf-或重組hmgb1刺激hepg2細(xì)胞24h，僅見個(gè)別其他細(xì)胞因子的釋放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞中可觀察到明顯的hmgb1的移位，移位率約為32.847.13。而在慢性乙型肝炎組及

32、正常肝組織中，肝細(xì)胞hmgb1集中分布于細(xì)胞核中，未見明顯的移位。(3) d-galn+lps注射后3h，發(fā)生移位的肝細(xì)胞百分率為：27.424.99。移位率與生理鹽水對(duì)照組比較，顯著為高(p<0.01)。(4)體外crm1抑制劑lmb可以顯著減少lps誘導(dǎo)的hepg2細(xì)胞hmgb1的釋放，及hmgb1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿的移位。組蛋白去乙?；敢种苿﹖sa可以促進(jìn)lps誘導(dǎo)的hmgb1釋放，促進(jìn)hmgb1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿的移位。 結(jié)論：(1) lps或tnf-a可時(shí)間及劑量依賴性誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的hepg2細(xì)胞核蛋白hmgb1的移位及釋放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞中存在hmgb

33、1從細(xì)胞核向胞漿的移位，而在慢性乙型肝炎及正常對(duì)照肝細(xì)胞中并無(wú)這種移位現(xiàn)象。(3)d-gal+lps誘導(dǎo)的急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞hmgbi存在從細(xì)胞核向胞漿的移位。(4)lps誘導(dǎo)的hepg2細(xì)胞hmgb1的移位和釋放可能存在crm1依賴的核轉(zhuǎn)運(yùn)，可能與乙?；嚓P(guān)。肝衰竭是一種病死率很高的臨床危重癥，在我國(guó)肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis bvirus，hbv)感染。而高遷移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，hmgb1)在細(xì)胞外是一種關(guān)鍵的“晚期”促炎癥介質(zhì)，已經(jīng)成為膿毒癥防治研究中一個(gè)重要的新靶標(biāo)。有研

34、究表明hmgb1可能在重型肝炎肝衰竭中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討肝衰竭時(shí)肝細(xì)胞hmgb1的移位及釋放情況。 目的：(1)研究lps或tnf-，刺激是否可引起肝細(xì)胞hmgb1的移位及釋放，檢測(cè)是否同時(shí)伴有其他細(xì)胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞hmgb1移位；(3)研究d-gain+lps誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠肝細(xì)胞hmgb1移位；(4)初步探討肝細(xì)胞hmgb1移位及釋放的可能機(jī)制。 方法：(1)體外用不同濃度lps或tnf-刺激肝細(xì)胞系hepg2細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清。mtt法測(cè)定細(xì)胞存活率，tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)上清中的ldh含量，以明確細(xì)胞

35、是否凋亡或壞死。western blotting方法檢測(cè)培養(yǎng)上清，細(xì)胞核和細(xì)胞漿組分蛋白中hmgb1的含量，免疫熒光技術(shù)觀察hmgb1移位。elisa，細(xì)胞因子芯片技術(shù)檢測(cè)上清中的細(xì)胞因子分泌。(2)分別收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝組織，免疫組織化學(xué)染色觀察hmgb1在肝細(xì)胞中的分布情況。同時(shí)行he染色，評(píng)估肝組織的病理學(xué)改變。(3) d-gain聯(lián)合lps腹腔注射，誘導(dǎo)小鼠急性肝衰竭模型，同時(shí)設(shè)置生理鹽水對(duì)照組。于d-galn+lps注射后3h處死動(dòng)物，收集肝臟組織，進(jìn)行hmgb1的免疫組織化學(xué)染色。(4)用western blotting和免疫熒光技術(shù)，分別觀察來(lái)普霉素b

36、(lmb)和曲古霉素(tsa)對(duì)lps誘導(dǎo)的肝細(xì)胞hmgb1移位和釋放的影響。 結(jié)果：(1)體外用lps或tnf-刺激可誘導(dǎo)hepg2細(xì)胞釋放hmgb1，釋放到上清中的hmgb1量隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)而增高，20h時(shí)達(dá)到峰值，免疫熒光觀察到hepg2細(xì)胞胞核中的hmgb1發(fā)生了向細(xì)胞漿的移位。在一定劑量范圍內(nèi)，lps(400ng/ml)或tnf-(25ng/ml)誘導(dǎo)的hmgb1分泌量隨lps或tnf-劑量增加而增加。mtt，tunel檢測(cè)及上清中l(wèi)dh含量測(cè)定排除了細(xì)胞處于凋亡及壞死狀態(tài)。細(xì)胞組分蛋白westem blotting分析亦證實(shí)了細(xì)胞漿中的hmgb1表達(dá)增強(qiáng)。elisa和細(xì)胞因子抗體

37、芯片檢測(cè)表明lps，tnf-或重組hmgb1刺激hepg2細(xì)胞24h，僅見個(gè)別其他細(xì)胞因子的釋放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞中可觀察到明顯的hmgb1的移位，移位率約為32.847.13。而在慢性乙型肝炎組及正常肝組織中，肝細(xì)胞hmgb1集中分布于細(xì)胞核中，未見明顯的移位。(3) d-galn+lps注射后3h，發(fā)生移位的肝細(xì)胞百分率為：27.424.99。移位率與生理鹽水對(duì)照組比較，顯著為高(p<0.01)。(4)體外crm1抑制劑lmb可以顯著減少lps誘導(dǎo)的hepg2細(xì)胞hmgb1的釋放，及hmgb1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿的移位。組蛋白去乙?；敢种苿﹖sa可以促進(jìn)lps誘

38、導(dǎo)的hmgb1釋放，促進(jìn)hmgb1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿的移位。 結(jié)論：(1) lps或tnf-a可時(shí)間及劑量依賴性誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的hepg2細(xì)胞核蛋白hmgb1的移位及釋放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞中存在hmgb1從細(xì)胞核向胞漿的移位，而在慢性乙型肝炎及正常對(duì)照肝細(xì)胞中并無(wú)這種移位現(xiàn)象。(3)d-gal+lps誘導(dǎo)的急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞hmgbi存在從細(xì)胞核向胞漿的移位。(4)lps誘導(dǎo)的hepg2細(xì)胞hmgb1的移位和釋放可能存在crm1依賴的核轉(zhuǎn)運(yùn)，可能與乙?；嚓P(guān)。肝衰竭是一種病死率很高的臨床危重癥，在我國(guó)肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis

39、 bvirus，hbv)感染。而高遷移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，hmgb1)在細(xì)胞外是一種關(guān)鍵的“晚期”促炎癥介質(zhì)，已經(jīng)成為膿毒癥防治研究中一個(gè)重要的新靶標(biāo)。有研究表明hmgb1可能在重型肝炎肝衰竭中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討肝衰竭時(shí)肝細(xì)胞hmgb1的移位及釋放情況。 目的：(1)研究lps或tnf-，刺激是否可引起肝細(xì)胞hmgb1的移位及釋放，檢測(cè)是否同時(shí)伴有其他細(xì)胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞hmgb1移位；(3)研究d-gain+lps誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠肝細(xì)胞hmgb1移位；(4)初步探討肝細(xì)胞hmgb1移位及釋

40、放的可能機(jī)制。 方法：(1)體外用不同濃度lps或tnf-刺激肝細(xì)胞系hepg2細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清。mtt法測(cè)定細(xì)胞存活率，tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)上清中的ldh含量，以明確細(xì)胞是否凋亡或壞死。western blotting方法檢測(cè)培養(yǎng)上清，細(xì)胞核和細(xì)胞漿組分蛋白中hmgb1的含量，免疫熒光技術(shù)觀察hmgb1移位。elisa，細(xì)胞因子芯片技術(shù)檢測(cè)上清中的細(xì)胞因子分泌。(2)分別收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝組織，免疫組織化學(xué)染色觀察hmgb1在肝細(xì)胞中的分布情況。同時(shí)行he染色，評(píng)估肝組織的病理學(xué)改變。(3) d-gain聯(lián)合lps腹腔注射

41、，誘導(dǎo)小鼠急性肝衰竭模型，同時(shí)設(shè)置生理鹽水對(duì)照組。于d-galn+lps注射后3h處死動(dòng)物，收集肝臟組織，進(jìn)行hmgb1的免疫組織化學(xué)染色。(4)用western blotting和免疫熒光技術(shù)，分別觀察來(lái)普霉素b(lmb)和曲古霉素(tsa)對(duì)lps誘導(dǎo)的肝細(xì)胞hmgb1移位和釋放的影響。 結(jié)果：(1)體外用lps或tnf-刺激可誘導(dǎo)hepg2細(xì)胞釋放hmgb1，釋放到上清中的hmgb1量隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)而增高，20h時(shí)達(dá)到峰值，免疫熒光觀察到hepg2細(xì)胞胞核中的hmgb1發(fā)生了向細(xì)胞漿的移位。在一定劑量范圍內(nèi)，lps(400ng/ml)或tnf-(25ng/ml)誘導(dǎo)的hmgb1分泌量隨

42、lps或tnf-劑量增加而增加。mtt，tunel檢測(cè)及上清中l(wèi)dh含量測(cè)定排除了細(xì)胞處于凋亡及壞死狀態(tài)。細(xì)胞組分蛋白westem blotting分析亦證實(shí)了細(xì)胞漿中的hmgb1表達(dá)增強(qiáng)。elisa和細(xì)胞因子抗體芯片檢測(cè)表明lps，tnf-或重組hmgb1刺激hepg2細(xì)胞24h，僅見個(gè)別其他細(xì)胞因子的釋放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞中可觀察到明顯的hmgb1的移位，移位率約為32.847.13。而在慢性乙型肝炎組及正常肝組織中，肝細(xì)胞hmgb1集中分布于細(xì)胞核中，未見明顯的移位。(3) d-galn+lps注射后3h，發(fā)生移位的肝細(xì)胞百分率為：27.424.99。移位率與生理鹽水對(duì)照

43、組比較，顯著為高(p<0.01)。(4)體外crm1抑制劑lmb可以顯著減少lps誘導(dǎo)的hepg2細(xì)胞hmgb1的釋放，及hmgb1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿的移位。組蛋白去乙?；敢种苿﹖sa可以促進(jìn)lps誘導(dǎo)的hmgb1釋放，促進(jìn)hmgb1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿的移位。 結(jié)論：(1) lps或tnf-a可時(shí)間及劑量依賴性誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的hepg2細(xì)胞核蛋白hmgb1的移位及釋放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞中存在hmgb1從細(xì)胞核向胞漿的移位，而在慢性乙型肝炎及正常對(duì)照肝細(xì)胞中并無(wú)這種移位現(xiàn)象。(3)d-gal+lps誘導(dǎo)的急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞hmgbi存在從細(xì)胞核向胞漿的移位。(4)

44、lps誘導(dǎo)的hepg2細(xì)胞hmgb1的移位和釋放可能存在crm1依賴的核轉(zhuǎn)運(yùn)，可能與乙?；嚓P(guān)。肝衰竭是一種病死率很高的臨床危重癥，在我國(guó)肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis bvirus，hbv)感染。而高遷移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，hmgb1)在細(xì)胞外是一種關(guān)鍵的“晚期”促炎癥介質(zhì)，已經(jīng)成為膿毒癥防治研究中一個(gè)重要的新靶標(biāo)。有研究表明hmgb1可能在重型肝炎肝衰竭中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討肝衰竭時(shí)肝細(xì)胞hmgb1的移位及釋放情況。 目的：(1)研究lps或tnf-，刺激是否可引起肝細(xì)胞hmgb

45、1的移位及釋放，檢測(cè)是否同時(shí)伴有其他細(xì)胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞hmgb1移位；(3)研究d-gain+lps誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠肝細(xì)胞hmgb1移位；(4)初步探討肝細(xì)胞hmgb1移位及釋放的可能機(jī)制。 方法：(1)體外用不同濃度lps或tnf-刺激肝細(xì)胞系hepg2細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清。mtt法測(cè)定細(xì)胞存活率，tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)上清中的ldh含量，以明確細(xì)胞是否凋亡或壞死。western blotting方法檢測(cè)培養(yǎng)上清，細(xì)胞核和細(xì)胞漿組分蛋白中hmgb1的含量，免疫熒光技術(shù)觀察hmgb1移位。elisa，細(xì)胞因子芯片技術(shù)檢測(cè)

46、上清中的細(xì)胞因子分泌。(2)分別收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝組織，免疫組織化學(xué)染色觀察hmgb1在肝細(xì)胞中的分布情況。同時(shí)行he染色，評(píng)估肝組織的病理學(xué)改變。(3) d-gain聯(lián)合lps腹腔注射，誘導(dǎo)小鼠急性肝衰竭模型，同時(shí)設(shè)置生理鹽水對(duì)照組。于d-galn+lps注射后3h處死動(dòng)物，收集肝臟組織，進(jìn)行hmgb1的免疫組織化學(xué)染色。(4)用western blotting和免疫熒光技術(shù)，分別觀察來(lái)普霉素b(lmb)和曲古霉素(tsa)對(duì)lps誘導(dǎo)的肝細(xì)胞hmgb1移位和釋放的影響。 結(jié)果：(1)體外用lps或tnf-刺激可誘導(dǎo)hepg2細(xì)胞釋放hmgb1，釋放到上清中的hm

47、gb1量隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)而增高，20h時(shí)達(dá)到峰值，免疫熒光觀察到hepg2細(xì)胞胞核中的hmgb1發(fā)生了向細(xì)胞漿的移位。在一定劑量范圍內(nèi)，lps(400ng/ml)或tnf-(25ng/ml)誘導(dǎo)的hmgb1分泌量隨lps或tnf-劑量增加而增加。mtt，tunel檢測(cè)及上清中l(wèi)dh含量測(cè)定排除了細(xì)胞處于凋亡及壞死狀態(tài)。細(xì)胞組分蛋白westem blotting分析亦證實(shí)了細(xì)胞漿中的hmgb1表達(dá)增強(qiáng)。elisa和細(xì)胞因子抗體芯片檢測(cè)表明lps，tnf-或重組hmgb1刺激hepg2細(xì)胞24h，僅見個(gè)別其他細(xì)胞因子的釋放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞中可觀察到明顯的hmgb1的移位，移位率約

48、為32.847.13。而在慢性乙型肝炎組及正常肝組織中，肝細(xì)胞hmgb1集中分布于細(xì)胞核中，未見明顯的移位。(3) d-galn+lps注射后3h，發(fā)生移位的肝細(xì)胞百分率為：27.424.99。移位率與生理鹽水對(duì)照組比較，顯著為高(p<0.01)。(4)體外crm1抑制劑lmb可以顯著減少lps誘導(dǎo)的hepg2細(xì)胞hmgb1的釋放，及hmgb1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿的移位。組蛋白去乙?；敢种苿﹖sa可以促進(jìn)lps誘導(dǎo)的hmgb1釋放，促進(jìn)hmgb1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿的移位。 結(jié)論：(1) lps或tnf-a可時(shí)間及劑量依賴性誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的hepg2細(xì)胞核蛋白hmgb1的移位及釋放。(2

49、)慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞中存在hmgb1從細(xì)胞核向胞漿的移位，而在慢性乙型肝炎及正常對(duì)照肝細(xì)胞中并無(wú)這種移位現(xiàn)象。(3)d-gal+lps誘導(dǎo)的急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞hmgbi存在從細(xì)胞核向胞漿的移位。(4)lps誘導(dǎo)的hepg2細(xì)胞hmgb1的移位和釋放可能存在crm1依賴的核轉(zhuǎn)運(yùn)，可能與乙酰化相關(guān)。肝衰竭是一種病死率很高的臨床危重癥，在我國(guó)肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis bvirus，hbv)感染。而高遷移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，hmgb1)在細(xì)胞外是一種關(guān)鍵的“晚期”促炎癥介質(zhì)，已經(jīng)

50、成為膿毒癥防治研究中一個(gè)重要的新靶標(biāo)。有研究表明hmgb1可能在重型肝炎肝衰竭中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討肝衰竭時(shí)肝細(xì)胞hmgb1的移位及釋放情況。 目的：(1)研究lps或tnf-，刺激是否可引起肝細(xì)胞hmgb1的移位及釋放，檢測(cè)是否同時(shí)伴有其他細(xì)胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞hmgb1移位；(3)研究d-gain+lps誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠肝細(xì)胞hmgb1移位；(4)初步探討肝細(xì)胞hmgb1移位及釋放的可能機(jī)制。 方法：(1)體外用不同濃度lps或tnf-刺激肝細(xì)胞系hepg2細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清。mtt法測(cè)定細(xì)胞存活率，tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，

51、同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)上清中的ldh含量，以明確細(xì)胞是否凋亡或壞死。western blotting方法檢測(cè)培養(yǎng)上清，細(xì)胞核和細(xì)胞漿組分蛋白中hmgb1的含量，免疫熒光技術(shù)觀察hmgb1移位。elisa，細(xì)胞因子芯片技術(shù)檢測(cè)上清中的細(xì)胞因子分泌。(2)分別收集慢性重型乙型肝炎，慢性乙型肝炎患者及正常肝組織，免疫組織化學(xué)染色觀察hmgb1在肝細(xì)胞中的分布情況。同時(shí)行he染色，評(píng)估肝組織的病理學(xué)改變。(3) d-gain聯(lián)合lps腹腔注射，誘導(dǎo)小鼠急性肝衰竭模型，同時(shí)設(shè)置生理鹽水對(duì)照組。于d-galn+lps注射后3h處死動(dòng)物，收集肝臟組織，進(jìn)行hmgb1的免疫組織化學(xué)染色。(4)用western blot

52、ting和免疫熒光技術(shù)，分別觀察來(lái)普霉素b(lmb)和曲古霉素(tsa)對(duì)lps誘導(dǎo)的肝細(xì)胞hmgb1移位和釋放的影響。 結(jié)果：(1)體外用lps或tnf-刺激可誘導(dǎo)hepg2細(xì)胞釋放hmgb1，釋放到上清中的hmgb1量隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)而增高，20h時(shí)達(dá)到峰值，免疫熒光觀察到hepg2細(xì)胞胞核中的hmgb1發(fā)生了向細(xì)胞漿的移位。在一定劑量范圍內(nèi)，lps(400ng/ml)或tnf-(25ng/ml)誘導(dǎo)的hmgb1分泌量隨lps或tnf-劑量增加而增加。mtt，tunel檢測(cè)及上清中l(wèi)dh含量測(cè)定排除了細(xì)胞處于凋亡及壞死狀態(tài)。細(xì)胞組分蛋白westem blotting分析亦證實(shí)了細(xì)胞漿中的h

53、mgb1表達(dá)增強(qiáng)。elisa和細(xì)胞因子抗體芯片檢測(cè)表明lps，tnf-或重組hmgb1刺激hepg2細(xì)胞24h，僅見個(gè)別其他細(xì)胞因子的釋放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞中可觀察到明顯的hmgb1的移位，移位率約為32.847.13。而在慢性乙型肝炎組及正常肝組織中，肝細(xì)胞hmgb1集中分布于細(xì)胞核中，未見明顯的移位。(3) d-galn+lps注射后3h，發(fā)生移位的肝細(xì)胞百分率為：27.424.99。移位率與生理鹽水對(duì)照組比較，顯著為高(p<0.01)。(4)體外crm1抑制劑lmb可以顯著減少lps誘導(dǎo)的hepg2細(xì)胞hmgb1的釋放，及hmgb1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿的移位。組

54、蛋白去乙?；敢种苿﹖sa可以促進(jìn)lps誘導(dǎo)的hmgb1釋放，促進(jìn)hmgb1從細(xì)胞核向細(xì)胞漿的移位。 結(jié)論：(1) lps或tnf-a可時(shí)間及劑量依賴性誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的hepg2細(xì)胞核蛋白hmgb1的移位及釋放。(2)慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞中存在hmgb1從細(xì)胞核向胞漿的移位，而在慢性乙型肝炎及正常對(duì)照肝細(xì)胞中并無(wú)這種移位現(xiàn)象。(3)d-gal+lps誘導(dǎo)的急性肝衰竭模型小鼠肝細(xì)胞hmgbi存在從細(xì)胞核向胞漿的移位。(4)lps誘導(dǎo)的hepg2細(xì)胞hmgb1的移位和釋放可能存在crm1依賴的核轉(zhuǎn)運(yùn)，可能與乙?；嚓P(guān)。肝衰竭是一種病死率很高的臨床危重癥，在我國(guó)肝衰竭最主要的原因是病毒性肝炎，其中最主要的是乙肝病毒( hepatitis bvirus，hbv)感染。而高遷移率族蛋白l(high mobility group box-1protein，hmgb1)在細(xì)胞外是一種關(guān)鍵的“晚期”促炎癥介質(zhì)，已經(jīng)成為膿毒癥防治研究中一個(gè)重要的新靶標(biāo)。有研究表明hmgb1可能在重型肝炎肝衰竭中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討肝衰竭時(shí)肝細(xì)胞hmgb1的移位及釋放情況。 目的：(1)研究lps或tnf-，刺激是否可引起肝細(xì)胞hmgb1的移位及釋放，檢測(cè)是否同時(shí)伴有其他細(xì)胞因子的分泌；(2)研究慢性重型乙型肝炎患者肝細(xì)胞hmgb1移位；(3)研究d-gain+lps誘