蛋白質(zhì)偶聯(lián)技術(shù)

1、蛋白質(zhì)交聯(lián)技術(shù)蛋白質(zhì)交聯(lián)是指將小分子物質(zhì)（如藥物、半抗原等）或大分子物質(zhì)（如酶、蛋白毒素等）一共價(jià)鍵的方式連接于蛋白質(zhì)分子四大行，以制備人工抗原酶標(biāo)抗體等。但標(biāo)志交聯(lián)方法首先發(fā)展于人孔抗原的制備研究。自70年前l(fā)andsteiner第一次合成人工抗原以來，人們將許多沒有抗原性的小分子物質(zhì)如化學(xué)藥物，神經(jīng)遞質(zhì)等與蛋白質(zhì)或多糖等載體大分子物質(zhì)共價(jià)結(jié)合，使其具有抗原性，以誘發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生特異性抗體，用于放射免疫分析等。目前經(jīng)常采用的的偶聯(lián)方法主要有重氮法，戊二醛法，戊二酸酐法，碳化二亞胺法等?，F(xiàn)將我對(duì)上述方法的理解研究歸結(jié)如下:重氮法（1）（2）芳香族伯胺在低溫（05）和強(qiáng)酸（鹽酸或硫酸）溶液中與亞硝酸

2、鈉作用，生成重氮鹽的反應(yīng)稱為重氮化反應(yīng)。若環(huán)上具有-n02或-so3h等的芳胺可以高一些（4060）溫度進(jìn)行重氮化反應(yīng)。 在芳香重氮正離子中， 鍵呈線形結(jié)構(gòu)， 鍵中的一個(gè) 軌道與苯環(huán)上的 軌道形成共軛體系，電子離域，使重氮鹽在低溫、強(qiáng)酸介質(zhì)中能穩(wěn)定存在。 苯環(huán)上有吸電子基團(tuán)的重氮鹽較為穩(wěn)定，這是由于強(qiáng)化了 與苯環(huán)的共軛，重氮鹽在弱酸、中性或堿溶液中與芳胺或酚類作用，由偶氮基(n=n)將兩個(gè)分子偶聯(lián)起來，生成偶氮化合物的反應(yīng)，稱為偶聯(lián)反應(yīng)?？珊铣膳嫉玖?。 偶聯(lián)反應(yīng)是親電取代反應(yīng)，重氮陽離子是弱的親電試劑，它進(jìn)攻苯環(huán)上電子出現(xiàn)幾率密度比較大的碳原子。 重氮鹽與酚在微堿性溶液中很快發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。

3、這是由于： 帶負(fù)電的氧原子比中性的羥基更能使苯環(huán)活化。 但溶液ph10: 所以在進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)，可考慮到多種因素，既考慮到 的活性，又要考慮到 和酚的活性，選擇最適宜的反應(yīng)條件，才能收到預(yù)期的效果。戊二醛法戊二醛是帶有兩個(gè)活性基團(tuán)雙功能的連結(jié)劑，它借助兩端的醛基與載體和半抗原的氨基以共價(jià)鍵連接，其反應(yīng)如下： 反應(yīng)機(jī)制脂肪族醛、酮與氨、伯胺的反應(yīng)可生成亞胺，也稱為西佛堿（schiff base)：脂肪族醛、酮生成的亞胺中含的c=n雙鍵在反應(yīng)條件下不是很穩(wěn)定的，它易于發(fā)生進(jìn)一步的聚合反應(yīng)。芳香族的醛、酮與伯胺反應(yīng)生成的亞胺則比較穩(wěn)定。 西佛堿是一類有機(jī)弱堿，其氮上的孤對(duì)電子的活性比較低。在有機(jī)合成

4、中亞胺類化合物多有應(yīng)用。戊二醛是反應(yīng)條件最溫和的偶聯(lián)劑之一，可以在440，ph6.89之間反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間控制在25h。一般條件下溫度在室溫下反應(yīng)即可，但是如果反應(yīng)物活性較高，可以在4條件下反應(yīng)。在磷酸緩沖液中ph6.87.5，在碳酸緩沖液中ph8-9.一般來說，ph越高，西弗堿的生成率越高，而且穩(wěn)定，但是也越容易反應(yīng)自身的偶聯(lián)反應(yīng)。ph越低，西弗堿的生成率越低，而且穩(wěn)定不高。反應(yīng)體系中，戊二醛的含量一般在0.2-1%之間。偶聯(lián)后的物質(zhì)均一性不好，穩(wěn)定性差，一般用于酶標(biāo)產(chǎn)品。可以用硼氫化鈉等還原劑將c=n還原成c-n，穩(wěn)定性增強(qiáng)，一般硼氫化鈉的加入量是10mg/ml，加入后有大量的氣泡產(chǎn)生。碳化

5、二亞胺法碳化二亞胺是一種化學(xué)性質(zhì)非?；钴S的雙功能試劑，它們既可與半抗原上的羧基又可與半抗原上的氨基縮合。 此法非常簡(jiǎn)便，只要將半抗原與載體蛋白質(zhì)按一定分子比混合在適當(dāng)?shù)娜芤褐?，然后加入碳二亞胺，攪拌l2h，置室溫反應(yīng)24h，最后透析除去未反應(yīng)的半抗原，即可得到人工免疫原。 兩個(gè)截圖碳化二亞胺主要有兩種，一種是水溶性（主要是edc），一種是非水溶性（主要是dcc）。先是羧基上的氧原子作為親核進(jìn)攻試劑進(jìn)攻n=c=n中的碳原子，形成活性中間結(jié)構(gòu)。氨基跟令一個(gè)雙鍵發(fā)生親核反應(yīng)，將edc推掉，形成酰胺結(jié)構(gòu)。通常文獻(xiàn)中edc的反應(yīng)ph是4.76之間，但是碳化二亞胺最佳活性是ph7.5左右。羥基琥珀酰亞胺（

6、nhs）通常會(huì)作為該反應(yīng)的催化劑，即edc/nhs聯(lián)用,可以大幅度的提高反應(yīng)的速率。dcc有一定的水溶性，但是通常反應(yīng)體系是80%的dmf反應(yīng)。dcc的存在會(huì)對(duì)后續(xù)反應(yīng)有影響，通?？梢酝ㄟ^水洗的方法除去。戊二酸酐法小分子物質(zhì)沒有氨基或羧基不能直接跟蛋白偶聯(lián)，通常需要通過化學(xué)衍生的方法衍生出氨基或是羧基?？股氐刃》肿又杏泻芏嗍呛辛u基的，一般采用戊二酸酐法進(jìn)行衍生。反應(yīng)機(jī)制反應(yīng)多數(shù)情況下可由酸(質(zhì)子酸及l(fā)ewis酸)催化，其機(jī)理為加成-消除。其過程為醇或酚的氧親核進(jìn)攻?；瘎┑聂驶?可能已由酸催化作用更加極化，甚至已形成碳正離子)，由此加成到羰基上，然后消除?；瘎┥系碾x去基團(tuán)(該離去基團(tuán)可能需

7、要預(yù)先質(zhì)子化)，得到酯。 主要影響因素為底物的結(jié)構(gòu)、?；瘎┘按呋瘎┑?。與酸和酯作酰化劑相比，酸酐的酰化活性較強(qiáng)，而且?；磻?yīng)是不可逆的。酰化反應(yīng)過程可以被酸(硫酸等質(zhì)子酸以及三氟化硼等lewis酸)和堿(主要為醋酸鈉以及三乙胺等有機(jī)堿)所催化。酰化對(duì)象可以是醇，也可以是酚。其酸催化的反應(yīng)機(jī)理可以是?；x子歷程，也可以是加成-消除；堿催化的機(jī)理為加成-消除。 (1) 底物結(jié)構(gòu)的影響底物為醇或酚，親核物種為羥基氧原子。當(dāng)氧原子電子云密度降低時(shí)反應(yīng)活性會(huì)降低，由此可知，與烷基醇相比酚及烯丙醇的?；瘯?huì)困難一些，而難以?；牡孜锞托枰^強(qiáng)的?；瘎?，比如酚的酰酸化一般要用酐或酰鹵。此外空間障礙也是一個(gè)較

8、大的影響因素，如仲醇的反應(yīng)速率低于伯醇，而叔醇在酸催化下會(huì)形成碳正離子，所以叔醇的酯化一般是單分子親核取代(sn1)機(jī)理。 (2) 酰化劑的影響在一定的反應(yīng)條件下，羧酸、酸酐、酰鹵、酯以及酰胺都可以成為?；瘎?，其酰化活性順序一般為酰鹵(brcl)酸酐酯酸酰胺，這一順序?qū)嶋H上與離去基團(tuán)的離去能力一致。3催化劑催化劑可以是質(zhì)子酸，如濃硫酸、磷酸、干燥氯化氫氣體以及高氯酸等，也可以是對(duì)甲苯磺酸等有機(jī)酸。無機(jī)質(zhì)子酸價(jià)廉易得；有機(jī)質(zhì)子酸溫和，可避免某些不穩(wěn)定底物的分解或發(fā)生副反應(yīng)。還可以使用lewis酸，如三氯化鋁以及鈦酸酯等，可避免某些不穩(wěn)定底物的分解或發(fā)生副反應(yīng)。也可以使用強(qiáng)酸性離子交換樹脂，以及樹

9、脂負(fù)載的lewis酸，如強(qiáng)酸性離子交換樹脂負(fù)載sncl2。如肉桂酸甲酯的合成：bf3催化的加成-消除反應(yīng)(質(zhì)子酸催化時(shí)雙鍵會(huì)有反應(yīng)，甚至?xí)l(fā)生芳環(huán)上的烷基化反應(yīng))。除質(zhì)子酸、lewis酸外，有一些化合物可以一定的方式與底物羧酸結(jié)合，并使其羰基碳更容易被親核試劑進(jìn)攻，從而達(dá)到催化目的，如dcc及其類似物。dcc及其類似物催化羧酸和醇的酯化機(jī)理。注：1 加入有機(jī)堿可以幫助羧酸去質(zhì)子，增加其親核能力，故在此反應(yīng)過程中加入4-二甲氨基吡啶(dmap)等可以提高反應(yīng)速率。2 主要用于原料昂貴或結(jié)構(gòu)復(fù)雜、基團(tuán)敏感難以衍生的場(chǎng)合，如多肽合成。偶氮二甲酸二乙酯(dead)/三苯基膦也以類似的機(jī)理起到催化作用。

10、由以上機(jī)理可知，三苯基膦的三個(gè)苯基在醇與三苯基膦結(jié)合時(shí)會(huì)成為障礙，所以，該反應(yīng)對(duì)伯醇和仲醇具有選擇性，而叔醇難以反應(yīng)。與酸和酯作?；瘎┫啾?，酸酐的?；钚暂^強(qiáng)，而且?；磻?yīng)是不可逆的。?；磻?yīng)過程可以被酸(硫酸等質(zhì)子酸以及三氟化硼等lewis酸)和堿(主要為醋酸鈉以及三乙胺等有機(jī)堿)所催化。酰化對(duì)象可以是醇，也可以是酚。其酸催化的反應(yīng)機(jī)理可以是酰基正離子歷程，也可以是加成-消除；堿催化的機(jī)理為加成-消除。酸催化的兩種可能的反應(yīng)機(jī)理：堿催化的反應(yīng)機(jī)理也有兩種可能性，以dmap作催化劑為例：酸酐主要用于用酸或酯難以?；膱?chǎng)合，比如位阻較大的醇和酚的酰化。當(dāng)醇、酚羥基共存時(shí)，三氟化硼可對(duì)醇羥基選擇性

11、催化酰化。注：這個(gè)結(jié)果可以在一定程度上支持堿催化時(shí)活化羥基的機(jī)理。實(shí)際上，究竟是活化酸還是活化醇(酚)羥基可能與催化劑的堿性、親核性以及羥基的酸性和反應(yīng)條件有關(guān)。但長(zhǎng)鏈脂肪酸的酸酐難于制備，所以混酸酐的方法就顯得有較大實(shí)際意義?；焖狒ㄒ话闶前阉崴嵫苌鸀橄鄳?yīng)的三氟乙酸酐、磺酸酐、磷酸酐以及多取代的苯甲酸酐等，實(shí)際上也是引入了更好的離去基團(tuán)。這些酸酐可由羧酸(鹽)與相應(yīng)的酰鹵合成。磷酸酐反應(yīng)示例：該類反應(yīng)主要包括醇羥基酚羥基跟戊二酸酐發(fā)生?；磻?yīng)。2連接方法 半抗原與載體的連接通常可用物理和化學(xué)方法進(jìn)行。物理吸附的載體有羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等，它們借電荷和微孔吸附半抗原?；瘜W(xué)法則是利用某

12、些功能基團(tuán)把半抗原連接到載體上，這些載體包括血清白蛋白、甲狀腺球蛋白、銅藍(lán)蛋白、卵蛋白和人工合成的多聚賴氨酸。帶有游離氨基或游離羧基以及兩種基團(tuán)都有的半抗原，可直接與載體連接。其他不帶有氨基或羧基的半抗原，須加以適當(dāng)?shù)母脑欤蛊滢D(zhuǎn)變?yōu)閹в杏坞x氨基或游離羧基的衍生物，才能與載體連接。 1） 有游離氨基或游離羧基以及兩種基團(tuán)都有的半抗原與載體的連接方法 （1）碳化二亞胺法：碳化二亞胺是一種化學(xué)性質(zhì)非常活躍的雙功能試劑，它們既可與半抗原上的羧基又可與半抗原上的氨基縮合。 此法非常簡(jiǎn)便，只要將半抗原與載體蛋白質(zhì)按一定分子比混合在適當(dāng)?shù)娜芤褐校缓蠹尤胩级啺?，攪拌l2h，置室溫反應(yīng)24h，最后透析除去

13、未反應(yīng)的半抗原，即可得到人工免疫原。 （2）戊二醛法：戍二醛是帶有兩個(gè)活性基團(tuán)雙功能的連結(jié)劑，它借助兩端的醛基與載體和半抗原的氨基以共價(jià)鍵連接，其反應(yīng)如下： （3）混和酸酐法：混合酸酐法又稱為氯甲基異丁酯法，主要用以甾體激素與蛋白質(zhì)的偶連。以烷基氯甲基為偶連劑，最常用的是氯甲基異丁酯。含有羧基的半抗原與氯甲基異丁酯反應(yīng)形成混合酸酐，然后在與蛋白質(zhì)載體上的氨基反應(yīng)形成肽鍵。其反應(yīng)如下： （4）過碘酸氧化法：過碘酸將糖環(huán)氧化成雙醛基，再與蛋白質(zhì)上的氨基偶聯(lián)。本法常用于配糖體類藥物與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)。2） 帶有氨基或羧基的半抗原可用下面方法改造后，再用上述方法進(jìn)行連接 （1） 琥珀酸酐法：本法用于帶有羥

14、基的半抗原的改造。琥珀酸酐加水轉(zhuǎn)變成琥珀酸。如將帶有羥基的半抗原和琥珀酸酐在無水吡啶中反應(yīng)，即可得到帶有羧基的半抗原琥珀酸的衍生物。其反應(yīng)式如下： （2） 羧甲基羥胺法：帶有酮基的半抗原（如孕酮、睪酮）與o-(羧甲基)羥胺反應(yīng)，轉(zhuǎn)變?yōu)閹в恤然陌肟乖苌?。其反?yīng)式如下： （3） 重氮化的對(duì)氨基苯甲酸法：本法適于帶有酚基的半抗原（如某些藥物）的改造。先將對(duì)氨基苯甲酸和亞硝酸鈉反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物再作用于帶有酚基的半抗原，從而制得帶有羧基的半抗原衍生物。 （4）一氯醋酸鈉：本法適于帶有酚基半抗原的改造。將帶有酚基的藥物與一氯醋酸鈉反應(yīng)即可得到帶有羧基的半抗原衍生物。西弗堿戊二醛本身性質(zhì)反應(yīng)ph戊二醛的

15、量反應(yīng)時(shí)間硝基化合物的還原 硝基的還原 工業(yè)上用鐵粉和水還原硝基苯，但是用大量的鐵粉會(huì)產(chǎn)生大量含苯胺的鐵泥。造成環(huán)境的污染。所以，逐漸改用催化加氫的方法，常用的催化劑有鎳、鉑、鈀。 二硝基化合物還原生成二元胺： 硝基的選擇性還原 二硝基化合物若只需要還原一個(gè)硝基，使用計(jì)算的硫化銨、多硫化銨、硫氫化銨或硫化鈉的水溶液等選擇性還原劑即可達(dá)到目的。 如果用氯化亞錫作還原劑，可避免醛的還原： （2）c-n鍵化合物的還原： 氰還原為胺： 缺點(diǎn)：反應(yīng)中同時(shí)產(chǎn)生少量的第二。第三胺。 特點(diǎn)：還原產(chǎn)物無第二、三胺。 肟還原： 酰胺的還原： 3.還原氨化： 酮和醛與氨（胺）作用，在氫和適當(dāng)?shù)拇呋瘎┐嬖谙?，轉(zhuǎn)變?yōu)橄?/p>

16、應(yīng)的胺。 埃施韋勒-克拉克(eschweiler-clarke)反應(yīng)：在上面反應(yīng)中，用過量的甲酸代替氫作還原劑，由于第一或第二胺與甲醛作用，則生成氮原子上最少含一個(gè)甲基的第三胺，這一反應(yīng)稱為eshweiler-clarke反應(yīng)。 反應(yīng)過程： 六、烯胺： 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：烯胺類似烯醇，通常是不穩(wěn)定的，容易轉(zhuǎn)變?yōu)榛プ儺悩?gòu)體的亞胺。 從結(jié)構(gòu)上不難看出，烯胺和烯醇負(fù)離子類似，可以有兩個(gè)反應(yīng)的位置，一個(gè)是在碳上，一個(gè)是在氮上。 2.反應(yīng)： 與鹵化物（碘甲烷、烯丙基鹵、芐鹵）反應(yīng)（主要適用于伯鹵代烴）： 烯胺與一般鹵代烴反應(yīng)，易發(fā)生n-烴基化反應(yīng)。這類反應(yīng)合成意義不大，但當(dāng)采用強(qiáng)親電的碘甲烷、烯丙基鹵化物、芐鹵

17、等。可高產(chǎn)率得到c-烴基化產(chǎn)物（這是由于首先形成n-烴化合物可以發(fā)生分子內(nèi)或分子間轉(zhuǎn)移。形成c-烴化合物） 與親電烯烴反應(yīng)（michael加成反應(yīng)） 烯胺可以和、-不飽和氰、酯、酮進(jìn)行烴基化反應(yīng)。 主要產(chǎn)物是c-烴化產(chǎn)物，原因時(shí)反應(yīng)是可逆的。n-烴化產(chǎn)物可以轉(zhuǎn)變?yōu)閏-烴化產(chǎn)物。 以上反應(yīng)的特點(diǎn)： a.反應(yīng)條件緩和，不需要堿性催化劑。可以避免一般堿性催化劑存在而引起的副反應(yīng)。 b.很容易控制在一元烷基化階段。 c.-取代酮生成的烯胺，烴基化時(shí)烷基進(jìn)攻沒有取代基的-碳原子。 ?；磻?yīng)： 烯胺發(fā)生?；磻?yīng)最常用的試劑是酰鹵，它與烴不同，n-?；a(chǎn)物，也是良好的c-酰化試劑，因此，可以高產(chǎn)率的形成c

18、-?；a(chǎn)物。 重氮和偶氮化合物 重氮和偶氮化合物都含有n2原子團(tuán)。在重氮化合物中n2-的一端和碳原子相連；在偶氮化合物中則兩端都和碳相連，其結(jié)構(gòu)中含nn原子團(tuán)。-n=n-官能團(tuán)的兩端都分別與烴基相連的化合物稱為偶氮化合物. 若-n=n-官能團(tuán)的一端與烴基相連,另一端與其他原子非碳原子(cn例外)或原子團(tuán)相連的化合物,稱為重氮化和物。 脂肪族的重氮化和物多符合 : 一、 芳香族重氮化反應(yīng) : 芳香族伯胺在低溫（05）和強(qiáng)酸（鹽酸或硫酸）溶液中與亞硝酸鈉作用，生成重氮鹽的反應(yīng)稱為重氮化反應(yīng)。若環(huán)上具有-n02或-so3h等的芳胺可以高一些（4060）溫度進(jìn)行重氮化反應(yīng)。 在芳香重氮正離子中， 鍵呈線形結(jié)構(gòu)， 鍵中的一個(gè) 軌道與苯環(huán)上的 軌道形成共軛體系，電子離域，使重氮鹽在低溫、強(qiáng)酸介質(zhì)中能穩(wěn)定存在。 苯環(huán)上有吸電子基團(tuán)的重氮鹽較為穩(wěn)定，這是由于強(qiáng)化了 與苯環(huán)的共軛，二、芳香族重氮鹽的性質(zhì) 重氮基是個(gè)正離子，是一個(gè)親電試劑，能進(jìn)攻活化了的芳環(huán)，如酚羥基、氨基的鄰、對(duì)位： 另一方面它本身又易為親核試劑所取代，是芳環(huán)上導(dǎo)入負(fù)性基團(tuán)，如鹵素、羥基、氨基等的可能的途徑。所以在合成上非常有用。 重氮鹽的反應(yīng)一般歸納為兩類：取代反應(yīng)和偶聯(lián)反應(yīng)。1.取代反應(yīng)