畢業(yè)設(shè)計（論文）重樓葉多糖提取工藝及其抗氧化活性研究

1、巴黎重樓葉多糖提取工藝及其抗氧化活性研究摘要 在單因素分析的基礎(chǔ)上，利用中心組合設(shè)計實驗優(yōu)化巴黎重樓葉多糖的提取條件。設(shè)置三個獨立的變量，包括提取溫度（），水料比和時間（h)并研究其對多糖得率的影響。采用多元回歸分析和統(tǒng)計學(xué)方法對擬合一個二次多項式方程實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行。 最佳工藝條件為：提取溫度為90.8，水料比為21.3:1，提取時間為4.8h。在最佳條件下，實驗的回收率為54.18%，與模型預(yù)測值匹配。此外，純化的多糖對dpph自由基、羥自由基離子和超氧陰離子自由基有很強(qiáng)的抗氧化作用。關(guān)鍵字 重樓 優(yōu)化 多糖 抗氧化1.引言巴黎滇重樓，廣泛分布在中國的西南地區(qū)，長時間被作為中藥使用。它能有效的

2、消腫、有效的減輕疼痛、消除咽喉腫痛、治療蛇毒咬傷和擦傷1。巴黎滇重樓中有許多生物活性成分，如皂甙，蛻皮激素，植物甾醇和黃酮甙2。它們被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤、抗菌、止血和鎮(zhèn)痛3。多糖是高分子碳水化合物結(jié)構(gòu)，形成重復(fù)單元由糖苷鍵連接在一起4。因為多糖特殊的理化性質(zhì)和生物活性高，所以對多糖的研究受到了許多關(guān)注5。然而，一些研究已經(jīng)從云南滇重樓葉多糖（pplps)提取中開展了。熱水提取技術(shù)是常用的植物多糖的提取方法，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于許多研究6。在提取過程中，提取率是由多個獨立變量影響的。因此，開發(fā)一個可以確定所有因素的優(yōu)化方法是必要的。另外，要確定最佳提取條件就應(yīng)該考慮自變量之間的相互作用。當(dāng)自變量有一個

3、聯(lián)合的效果的時候，響應(yīng)面法（rsm）在優(yōu)化工藝方面是一種有效的統(tǒng)計技術(shù)。rsm的優(yōu)化過程比傳統(tǒng)方法需要較少的材料和時間7是一種典型的響應(yīng)面設(shè)計。在本設(shè)計中，處理結(jié)合在試驗點，軸點，中心點。設(shè)計是旋轉(zhuǎn)（或接近旋轉(zhuǎn)），要求每一個因子五水平。與傳統(tǒng)方法相比ccd能更有效的進(jìn)行試驗?；钚匝跏羌?xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品。過多的自由基會引起許多疾病，如癌癥、心血管疾病、動脈粥樣硬化。抗氧化劑和癌癥治療的常規(guī)藥物，如bha、bht和tbhq的療效有限并且有顯著的毒性8。多糖是一種天然的生物大分子，廣泛存在于生物界中。因為多糖具有抗氧化、抗癌和免疫活動，所以植物多糖引起了極大的關(guān)注。9。然而，很少資料是研究p

4、plps的。本研究的目的是調(diào)查關(guān)鍵變量（提取溫度，提取時間和水料比）并進(jìn)一步優(yōu)化pplps的提取工藝。另外，對獲得純化的多糖及其抗氧化活性進(jìn)行了評價。2.材料與方法2.1材料和試劑將巴黎重樓葉干燥，將干燥的材料用粉碎機(jī)，然后過60目篩。將巴黎重樓葉粉末分別用石油醚（60-90）和乙醇在索氏抽提器中回流5小時。脫脂后將粉末干燥，室溫下放置在干燥器中保存。乙醇，苯酚，硫酸，和葡萄糖分別來自成都科隆化工廠購買。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（dpph），1,10-菲咯啉，,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nadh）和氮藍(lán)四唑（nbt）購自西格瑪化學(xué)公司。所有化學(xué)試劑均為分析純。2.2提取pplps每個預(yù)處理粉

5、末（1.0克），在設(shè)定的提取溫度，水料比和提取時間下萃取多糖。將所得的懸浮液通過離心（5000r/min,10分鐘）分離。收集上清液并加蒸餾水補(bǔ)至100ml。采用苯酚-硫酸法測定多糖的含量10。使用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)，并將結(jié)果表示為葡萄糖當(dāng)量。2.3實驗設(shè)計通過單因素實驗確定提取變量的初步范圍。設(shè)計一個五水平三因素的ccd用于優(yōu)化pplps的提取率的最佳變量組合。分別選擇提取溫度（x1），水與原料的比例（x2），和提取時間（x 3）用于多糖的提取率待優(yōu)化的獨立變量。三個變量和五個水平的范圍如表一所示。提取率（y）被作為對三個變量在表2中的相互作用的響應(yīng)。根據(jù)等式三個變量進(jìn)行編碼： xi -x0 x

6、i= i=1,2,3 (1) x其中x是獨立變量的編碼值，xi獨立變量的實際值，x0是自變量的中心點的實際值，和x為變量的階躍變化。該系統(tǒng)的行為由下列二次方程解釋： 3 3 2 3y=a0+aixi +aiixi+aijxij (2) i=1 i=1 i=1i=1 其中y是預(yù)測響應(yīng)，a0是一個常數(shù)，ai，aii和aij是由模型估計系數(shù)，以及xi和xj是獨立變量。這些數(shù)值分別代表的是截距，線性，二次互動變量的影響在響應(yīng)面中的情況。該模型評價三個變量的影響。所有實驗均重復(fù)三次。來估計自變量的響應(yīng)，實驗設(shè)計進(jìn)行分析，并使用設(shè)計專家軟件預(yù)測的數(shù)據(jù)進(jìn)行了計算11。隨后，三個額外的實驗以驗證統(tǒng)計實驗策略的

7、有效性。2.4制備和多糖的純化取預(yù)處理的樣品（100.0 g），采用優(yōu)化的條件下熱水提取方法提取pplps溶液。將懸浮液以5000rpm離心10分鐘，并且將上清液收集并濃縮至約100毫升。濃縮液采用sevag法除蛋白12。四體積的乙醇加入到濃縮物中，并將混合物在4保持12小時。收集沉淀物并真空干燥獲得pplpspplps（1.0克）溶解在去離子水中。該溶液通過deae-纖維素de-52柱（3厘米60厘米）膜過濾（0.45微米; 直徑）。用水平衡后，將柱用梯度的nacl水溶液（0-1.00摩爾/毫升）水洗。將洗脫物收集到10毫升每管并用苯酚 - 硫酸法確定每管多糖的總含量。主適當(dāng)部分（純化的多糖

8、）收集，透析，并凍干，并指定為pplp。在使用之前，pplp溶解在去離子水，并根據(jù)需要稀釋成各種濃度。2.5抗氧化活性的檢測方法2.5.1對dpph自由基清除作用的影響根據(jù)13的方法并略有改動做多糖對dpph自由基的清除作用實驗。在一個典型的方法中，將2毫升樣品溶液（0.05，0.1，0.3，0.5，0.7，以及0.9毫克/毫升）和2ml的dpph的乙醇溶液（0.1毫摩爾/升）混合，混合物在25下反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)液在517nm處測定吸光度。dpph自由基清除效果，計算用下面的公式：清除效果（%）=（1-as/ac）100其中，as是樣品和dpph溶液的混合物的吸光度，和ac是控制反應(yīng)的其中樣

9、品被替換乙醇的吸光度。2.5.2對羥基自由基清除作用的檢測羥基自由基測定按照文獻(xiàn)的方法14稍作修改。在一個典型的方法中加入1.0ml樣品溶液（0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0毫克/毫升）再加入鄰二氮菲（5mm的1.0毫升），磷酸鹽緩沖液（50mm，ph值7.4），硫酸亞鐵（7.5毫，0.5毫升），和h 2 o 2（0.1，0.5毫升）在37下保溫1小時。在510 nm波長下用光譜儀測定混合物的吸光度。羥基自由基的清除效果，計算用下面的公式：清除效果（%）=（1-as/ac)100其中，as是樣品和反應(yīng)溶液的混合物的吸光度，和ac是控制反應(yīng)的其中樣品代替去離子水的吸光度。

10、2.5.3對超氧陰離子自由基清除作用的測定方法對超氧陰離子自由基的清除作用的測定方法按文獻(xiàn)方法15略有修改。在一個典型的方法中，pplp溶解在水中，稀釋成一系列不同濃度的樣品溶液（0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0毫克/毫升），每個樣品溶液加入 1毫升16毫摩爾/毫升的tris-hcl（ph8.0，含有557u m + nadh），1毫升16毫摩爾/毫升的tris-hcl（ph8.0含有108 um + nbt），和1毫升16毫摩爾/毫升tris-hcl中（ph混合8.0，含45um的pms)。將反應(yīng)混合物在25下保溫5分鐘，并在560nm處測定吸光度。計算用下面的公式：

11、清除效果（%）=（1-as/ac)100%其中，as是樣品的平均吸光度值，ac為對照的平均吸光度值。3. 結(jié)果與討論3.1單因素實驗分析3.1.1提取溫度對pplps提取率的影響 當(dāng)提取時間為3小時，水與原料的比率為30：1時研究了溫度對提取效率的影響，提取過程中進(jìn)行了在60，70，80，90，和100。當(dāng)溫度60提高到90提取率升高。如圖1（a）所示，提取溫度持續(xù)上升90是，提取率提高到了最大量49.15，然后提取率不在增大。因此，85-95c的溫度范圍內(nèi)被選為最優(yōu)的ccd的實驗。3.1.2提取時間對pplps產(chǎn)量的影響提取時間是影響萃取效率的另一因素。提取過程中當(dāng)水與原料的比率為30：1，

12、溫度在80是時，提取時間（2，3，4，5，和6小時）對產(chǎn)率的影響，設(shè)計表如圖1（b）。當(dāng)提取時間變化從2小時至6小時，提取效率提高和pplps產(chǎn)量在4小時時達(dá)到最大值的46.44，然后隨時間降低。結(jié)果表明在本實驗中4-6小時時的范圍被認(rèn)為是最佳的提取時間范圍。3.1.3水與原料的比例對pplps提取率的影響水與原料的比例是本實驗的重要提取參數(shù)，它可以顯著的影響萃取效率。在本研究中，在提取溫度為80，提取時間為3小時的條件下，水料比設(shè)定為10:1，20：1，30:1，40:1和50:1，實驗結(jié)果如圖1(c)所示，當(dāng)提取效率提高到47.22%時，水料比達(dá)到30:1，當(dāng)水料比提高時，提取效率下降。因

13、此，水料比的最佳范圍在20:1-40:1時，有利于pplps的提取。3.2 pplps的提取條件3.2.1預(yù)測模型和統(tǒng)計分析rsm實驗設(shè)計矩陣和相應(yīng)的結(jié)果如表2，rms實驗設(shè)計三個獨立變量，包括萃取溫度（x1），水與原料的比率（x2）和提取時間（x3）。基于ccd的實驗數(shù)據(jù)多元回歸分析，預(yù)測的模型表示由下述的二次多項式方程：y = 53.41 + 2.06x1 1.19x2 + 0.35x3 + 1.21x1x2 0.55x1x3 0.88x2x3 1.72x12 0.97x22 0.64x32 (3) 其中y是多糖的預(yù)測的良品率，x1，x2和x3分別代表提取溫度，水料比和提取時間。進(jìn)行方差分

14、析（anova）來評估預(yù)測模型和變量。p值被用作一種工具來檢查每個系數(shù)的意義，并表示變量之間的相互作用的模式。p的值是越小，越顯著相應(yīng)系數(shù)。甲顯著缺乏合適的顯示，擬合模型失敗未能代表在該點不包括在回歸中的實驗域的數(shù)據(jù)。方差分析對提取效率的擬合二次多項式模型示于表3中。“模型f-價值”54.75隱含的模式是顯著。一個“f型價值”有只有0.01（ p 0.0001）的機(jī)會出現(xiàn)偏差。同時，“缺乏合適的f值”2.77暗示缺乏合適的不顯著，相對于純的錯誤?！叭狈线m的f值”這個大的有14.37%，p = 0.1437）的發(fā)生機(jī)會發(fā)生偏差。決定系數(shù)（r2）表明，98.03%的變化可以通過擬合模型解釋。調(diào)整

15、后的決定系數(shù)的值為0.9626，這也證實了該模型是高度顯著的。此外，變異系數(shù)相對較低的值（1.09%）顯示高精度和大量的可靠性實驗值?！白銐虻木葴y量的信噪比。大于4的比例是可取的。21.10的比例表明適當(dāng)?shù)男盘枴Ｒ虼?，實驗結(jié)果表明，該模型可用于導(dǎo)航的設(shè)計空間。回歸系數(shù)的值（3）如表3所示，所有的系數(shù)均顯著（p 0.05），包括線性項系數(shù)（x1，x2和 x3），交互項的系數(shù)（x1x2，x1x3和x2x3），和二次項系數(shù)（x12，x22和x32）。經(jīng)驗?zāi)Ｐ娃D(zhuǎn)化為三維（3d）和等高線圖來預(yù)測的自變量和響應(yīng)之間的關(guān)系。3.2.2提取方法的優(yōu)化 回歸公式的圖形由表三（3）中使用設(shè)計專家評估獨立變量的影

16、響以及它們對pplps的提取效率的相互作用獲得的。在響應(yīng)面圖和等高線圖，pplps的提取效率有兩個連續(xù)變量研究沿，而另一個變量保持在其零電平。多糖的提取效率受提取溫度，水與原料的比例，并提取時間的影響結(jié)果如示圖2所示，.受提取溫度和水與原料比多糖的提取率示于圖2（a），并且（a1）具有固定在零電平（4小時）提取時間。提取溫度由85到89.35多糖的產(chǎn)量明顯增加。然而，除了89.35，提取率下降非常緩慢，隨著溫度上升。根據(jù)提取溫度和提取時間的響應(yīng)面和等高線圖顯示在圖2（b）和（b1）的水到原料固定比率在零電平（30：1）。多糖產(chǎn)量的增加可以顯著伴隨提取溫度的增加而增加。提取率隨著時間的增加，從3

17、小時到4.5小時迅速增加。然而，除了4.5小時，的時間?；谒c原料比例和提取時間的響應(yīng)面和等高線圖顯示在圖2（c）和（c1）與提取溫度固定在零電平（90）。它表明，水與原料的比率為20：1至26：1時，多糖的產(chǎn)率提高。然后用水與原料的比例下降26：1到40：1的提取率增加非常緩慢。根據(jù)單因素實驗和重復(fù)分析，提取多糖的最佳工藝條件如下：提取溫度90.83，水與原料的比例21.3：1和提取時間4.8小時。在三種測試的獨立變量中，根據(jù)二次多項式模型（表3）和梯度的回歸系數(shù)意義顯示，萃取溫度是影響多糖的產(chǎn)率最顯著因素，其次是提取時間，水與原料的比例斜率在響應(yīng)面圖（圖2）。圖2.響應(yīng)面圖和等高線圖顯示

18、出的變量對pplps的提取率的影響（x1：提取溫度，x2：水與原料配比和x3提取時間）。3.3預(yù)測模型的驗證驗證模型方程的充足程度，適合用于預(yù)測最佳值選擇的最佳的條件下進(jìn)行了測試。如表4中所示，優(yōu)化的提取條件為提取溫度90.83c，水與原料的21.3：1的比例，提取時間4.8小時，pplps的預(yù)測的良品率是54.24。以確保該預(yù)測結(jié)果不偏于實用價值，三驗證實驗進(jìn)行了修改后的最佳條件下：提取溫度90.8c，水與原料的21.3：1的比例，并提取時間4.8小時。實驗產(chǎn)量pplps的是54.18和接近該預(yù)測值。結(jié)果表明實驗值和預(yù)測值之間沒有差異顯著并確認(rèn)響應(yīng)模型準(zhǔn)確和充分的pplps的提取。3.4多糖

19、的分離與純化pplps分別在最佳條件下制備，用乙醇沉淀，脫蛋白，并凍干。將粗多糖，褐色的粉末，呈現(xiàn)負(fù)碘 - 碘化鉀反應(yīng)，這表明不存在淀粉型多糖。pplps經(jīng)deae-纖維素de52柱色譜純化。如圖3，主峰洗脫用0.3摩爾/升的nacl溶液。主要部分（pplp）收集，濃縮，透析，凍干的抗氧化活性進(jìn)一步研究。pplp出現(xiàn)，為淺黃色粉末，并表現(xiàn)出對茚三酮試驗否定響應(yīng)。uv光譜在260和280nm處檢測到?jīng)]有吸收的事實，暗示pplp不含有核酸和蛋白質(zhì)。3.5抗氧化活性的研究3.5.1對dpph自由基清除活性dpph自由基是穩(wěn)定的自由基，多糖已被廣泛用于評估天然化合物的自由基清除活性。dpph的乙醇溶液

20、在517納米處具有特征吸收的最大值。當(dāng)dpph乙醇溶液降低，吸光度降低，并且從紫色溶液變?yōu)闇\黃色。清除dpph自由基的機(jī)制的原理是以dpph引起的天然化合物可以傳輸電子或氫原子16。基于這一原理，進(jìn)行pplp對dpph自由基清除活性進(jìn)行測定，結(jié)果如圖4（a)所示。的pplp的清除能力呈劑量依賴性。pplp的清除效果從7.62提高到84.73時的pplp的濃度分別為0.05毫克/毫升增加到0.9毫克/毫升。pplp和抗壞血酸清除dpph自由基半數(shù)抑制效果（ie50）值分別為0.25和0.06毫克/毫升。pplp的清除活性比抗壞血酸低，而類似的結(jié)果已經(jīng)表明在其他植物多糖中17。3.5.2羥基自由基

21、清除活性在活性氧反應(yīng)中，羥基自由基被認(rèn)為是一個可以很容易地穿過細(xì)胞膜的生物大分子，是最容易最有效的氧化劑，如碳水化合物，蛋白質(zhì)，脂類，和dna。羥基自由基可以引起相鄰的生物分子嚴(yán)重?fù)p害或細(xì)胞死亡18。因此，清除羥基自由基對生物系統(tǒng)的保護(hù)極為重要。基于fenton反應(yīng)的原理，確定pplp對羥基自由基的清除作用，結(jié)果顯示在圖4（b）。pplp羥自由基的清除作用隨濃度的升高而增強(qiáng)。在1毫克/毫升的濃度下，測定多糖對羥自由基和抗壞血酸的清除作用，清除率結(jié)果分別是79.04%和91.98%，pplp和抗壞血酸為清除羥自由e50值分別為0.31和0.25毫克/毫升。結(jié)果表明，pplp有很強(qiáng)的清除羥基自由基

22、的作用，且接近抗壞血酸的能力。可能的機(jī)制可涉及的任一個電子或氫原子由多糖的供應(yīng)，它可以與羥基自由基相結(jié)合而形成穩(wěn)定的化合物，以終止自由基鏈反應(yīng)。另一種抗氧化劑機(jī)制可能是由于供給任一個電子或氫原子由多糖，其可以結(jié)合與自由基離子如fe2+和cu2+的。這些機(jī)制暗示的pplp可以充當(dāng)電子或氫供體，以清除羥自由基19。3.5.3超氧陰離子自由基清除活性超氧陰離子自由基被認(rèn)為是作為一個初始自由基和由線粒體的電子傳遞體系形成。它除了直接攻擊一些生物分子外，超氧陰離子自由基還可降解來創(chuàng)建其它基團(tuán)，如羥基，單線態(tài)氧，和過氧化氫，這可以觸發(fā)脂質(zhì)過氧化作用和誘導(dǎo)病理事件，如關(guān)節(jié)炎和阿爾茨海默氏病20。因此，清除超

23、氧陰離子自由基的研究是必要的。超氧陰離子自由基由pms/ nadm系統(tǒng)測定在nbt的還原產(chǎn)生離子。pplp對超氧陰離子自由基的清除效果圖4（c）。pplp的清除活性，隨后的pplp清除活性呈劑量依賴的方式在所有測試的濃度。在濃度為1.0毫克/毫升時，pplp和抗壞血酸對超氧陰離子自由基的清除作用分別為76.09和94.78，此外，pplp和抗壞血酸清除超氧陰離子的ie50值分別為0.35和0.17毫克/毫升。結(jié)果表明，pplp有明顯的超氧自由基清除活性。然而，pplp對超氧陰離子自由基的清除作用比抗壞血酸低。4. 結(jié)論rsm被證實為對于pplps的優(yōu)化的最有用工具之一。最佳變量如下：萃取的溫度

24、為90.8；水與原料的比例為21.3：1；提取時間為4.8小時。在這些條件下，實驗的產(chǎn)率是54.18，這與預(yù)測值對應(yīng)良好。此外，pplp是經(jīng)deae纖維素-52陰離子交換層析得到的淺黃色粉末。pplp有很強(qiáng)的體外抗氧化活性。因此，pplp作為一種新的潛在的抗氧化劑有一定的探索價值，并且進(jìn)一步的研究，以評估在體內(nèi)抗氧化活動，并闡明其抗氧化機(jī)制至關(guān)重要。5.參考文獻(xiàn)1 chen, r., liu, z., zhao, j., chen, r., meng, f., zhang, m., et al. (2011). antioxidant andimmunobiological activity

25、of water-soluble2 polysaccharide fractions purifiedfrom acanthopanax senticosu. food chemistry, 127(2), 434440.3 cuesta, g., suarez, n., bessio, m. i., ferreira, f., & massaldi, h. (2003). quantitativedetermination of pneumococcal capsular polysaccharide serotype 14 using amodification of phenolsulf

26、uric acid method. journal of microbiological methods,52(1), 6973.4 dubois, m., gilles, k. a., hamilton, j. k., rebers, p. a., & smith, f. (1956). colorimetricmethod for determination of sugars and related substances. analytical chemistry,28(3), 350356.5 fan, l., li, j., deng, k., & ai, l. (2012). ef

27、fects of drying methods on the antioxidantactivities of polysaccharides extracted from ganoderma lucidum. carbohydratepolymers, 87(2), 18491854.6 forabosco, a., bruno, g., sparapano, l., liut, g., marino, d., & delben, f. (2006).pullulans produced by strains of cryphonectria parasiticai. production

28、andcharacterisation of the exopolysaccharides. carbohydrate polymers, 63(4),535544.7 giovanni, m. (1983). response surface methodology and product optimization. foodtechnology, 37(11), 4145.8 li, x. l., & zhou, a. g. (2007). evaluation of the antioxidant effects of polysac-charides extracted from ly

29、cium barbarum. medicinal chemistry research, 15(9),471482.9 liu, j., sun, y., liu, l., & yu, c. (2011). the extraction process optimization and physic-ochemical properties of polysaccharides from the roots of euphorbia fischeriana.international journal of biological macromolecules, 49(3), 416421.10

30、liu, w., wang, h., pang, x., yao, w., & gao, x. (2010). characterization and antioxidantactivity of two low-molecular-weight polysaccharides purified from the fruitingbodies of ganoderma lucidum. international journal of biological macromolecules,46(4), 451457.11 macdonald, j., galley, h. f., & webs

31、ter, n. r. (2003). oxidative stress and gene expres-sion in sepsis. british journal of anaesthesia, 90(2), 221232.12 naik, g. h., priyadarsini, k. i., satav, j. g., banavalikar, m. m., sohoni, d. p., biyani, m. k.,et al. (2003). comparative antioxidant activity of individual herbal componentsused in

32、 ayurvedic medicine. phytochemistry, 63(1), 97104.13 qian, x., zhu, l., hu, j., li, m., xie, l., wang, l., et al., & liu, b. (2012). rhizoma paridisethanol extract selectively inhibits the proliferation of huvecs comparing tolovo cells and shows anti-angiogenesis effects in a mouse model. journal of

33、ethnopharmacology, 143(1), 256261.14 qin, x. j., sun, d. j., ni, w., chen, c. x., hua, y., he, l., et al. (2012). steroidal saponinswith antimicrobial activity from stems and leaves of paris polyphylla var. yun-nanensis. steroids, 77(12), 12421248.15 robak, j., & gryglewski, r. (1988). flavonoids ar

34、e scavengers of superoxide anions.journal of biochemical pharmacology, 37, 837841.16 sun, l., wang, c., shi, q., & ma, c. (2009). preparation of different molecular weightpolysaccharides from porphyridium cruentum and their antioxidant activities.international journal of biological macromolecules, 4

35、5(1), 4247.17 sun, y., wang, s., li, t., li, x., jiao, l., & zhang, l. (2008). purification, structureand immunobiological activity of a new water-soluble polysaccharide fromthe mycelium of polyporus albicans (imaz.) teng. bioresource technology, 99(4),900904.18 wang, q., xu, g., & jiang, y. (1990).

36、 analgesic and sedative effects of the chinesedrug rhizoma paridis. china journal of chinese materia medica, 15(2), 109-111,128.19 wang, y., & lu, z. (2005). optimization of processing parameters for the mycelialgrowth and extracellular polysaccharide production by boletus spp. accc 50328.process bi

37、ochemistry, 40(3-4), 10431051.20 wen, f., yin, h., chen, c., liu, x., xue, d., chen, t., et al., & zhang, h. (2012).chemical characteristics of saponins from paris fargesii var. brevipetala andcytotoxic activity of its main ingredient, paris saponin h. fitoterapia, 83(4),627635.21 wu, s., gao, w., &

38、 duan, h. (2004). advances in studies on chemical constituentsand pharmacological activities of rhizoma paridis. chinese traditional and herbaldrugs, 35(3), 345346.22 wu, y., cui, s. w., tang, j., & gu, x. (2007). optimization of extraction process ofcrude polysaccharides from boat-fruited sterculia

39、 seeds by response surfacemethodology. food chemistry, 105(4), 15991605.23 xu, w., zhang, f., luo, y., ma, l., kou, x., & huang, k. (2009). antioxidant activity of awater-soluble polysaccharide purified from pteridium aquilinum. carbohydrateresearch, 344(2), 217222.24 yan, y., yu, c., chen, j., li, x., wang, w., & li, s. (2011). ultrasonic-assisted extrac-tion optimized by response surface methodology, chemical composition andantioxidant activity of polysaccha