艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法課件

1、艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法1 HIV-1HIV-1耐藥及耐藥檢測(cè)耐藥及耐藥檢測(cè) 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 艾滋病研究所艾滋病研究所 張張 旻旻 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法2 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法3 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法4 HIVHIV生活周期生活周期 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法5 HIVHIV基因組模式圖基因組模式圖 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法6 我國(guó)及國(guó)際兩種不同抗我國(guó)及國(guó)際兩種不同抗HIVHIV治療方案效治療方案效 果比較果比較 治療方案治療方案 國(guó)內(nèi)治療病毒抑制效果國(guó)內(nèi)治療病毒抑制效果 國(guó)際治療病毒國(guó)際治療病毒 抑制效果抑制效果

2、 平均治療平均治療 時(shí)間時(shí)間( (月月) ) 載量載量LDL9590-9580-9070-8070 服藥依從性服藥依從性 (%) 82.1 71.4 66.7 54.6 21.7 2. 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法25 那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)? ? 服藥依從性服藥依從性 (%) 2. 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法26 那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)? ? 藥物配伍不當(dāng)藥物配伍不當(dāng) 藥代顯著不同藥物配伍藥代顯著不同藥物配伍3. 0244836 12 時(shí)間時(shí)間 (小時(shí)小時(shí)) 藥物濃度藥物濃度 潛在病毒復(fù)制區(qū) IC90 IC50 最后一

3、次用藥最后一次用藥 單藥治療 S. Taylor et al. 11th CROI Abs 131 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法27 那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)? ? 細(xì)胞周期依賴(lài)性藥物細(xì)胞周期依賴(lài)性藥物 AZT, D4T ( AZT, D4T ( 活化期細(xì)胞活化期細(xì)胞) ) DDI (DDI (靜止相細(xì)胞靜止相細(xì)胞) ) 蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑 ( (活化期細(xì)胞活化期細(xì)胞) ) 非細(xì)胞周期依賴(lài)性藥物非細(xì)胞周期依賴(lài)性藥物 3TC, FTC, Abacavir3TC, FTC, Abacavir TenofovirTenofovir NNRTIsNNRTIs 3

4、. 藥物配伍不當(dāng)藥物配伍不當(dāng) 缺乏對(duì)某一時(shí)相細(xì)胞內(nèi)病毒抑制或抑制不足缺乏對(duì)某一時(shí)相細(xì)胞內(nèi)病毒抑制或抑制不足 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法28 那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)那些因素促使耐藥性病毒株出現(xiàn)? ? 胃腸道吸收不好：嘔吐，腹瀉；胃腸道吸收不好：嘔吐，腹瀉； 隨意間歇服藥；隨意間歇服藥； 與中藥或其他藥物同時(shí)服用。與中藥或其他藥物同時(shí)服用。 4. 其他因素其他因素 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法29 什么是好治療方案什么是好治療方案? ? 能快速抑制病毒；能快速抑制病毒； 不易產(chǎn)生耐藥性；不易產(chǎn)生耐藥性； 可長(zhǎng)期維持；可長(zhǎng)期維持； 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法30 耐藥性分類(lèi)耐藥性分類(lèi)

5、 1、原發(fā)性耐藥(Primary resistance): 病人在接受抗 病毒治療前產(chǎn)生了藥物作用靶點(diǎn)的變異，或者感染 了耐藥毒株，均降低抗病毒藥物的敏感性。在已經(jīng) 開(kāi)展HAART的國(guó)家普遍存在，感染了耐藥毒株的病 人很容易引起藥物治療失敗。 2、繼發(fā)性耐藥(Secondary resistance): 病人已經(jīng)接 受了抗病毒治療并產(chǎn)生治療失敗，在藥物的選擇壓 力下產(chǎn)生的耐藥。 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法31 耐藥機(jī)制：耐藥機(jī)制： 核苷和核苷類(lèi)似物 1、破壞核苷類(lèi)似物結(jié)合病毒破壞核苷類(lèi)似物結(jié)合病毒DNA的能力的能力 M184V 突變: RT酶第184位密碼子 的氨基酸由蛋氨酸(M)變成為纈

6、氨酸(V) 。拉米夫定(Lamivudine) Q151M mutation: 在HIV-1中出現(xiàn)低于 5%；HIV-2中出現(xiàn)頻率較高。 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法32 耐藥機(jī)制：耐藥機(jī)制： 2、切除病毒DNA鏈末端的核苷類(lèi) 似物 Thymidine analogues mutations: 突變引起 ATP或者焦磷酸介導(dǎo)的切除DNA鏈3末端核 苷類(lèi)似物。 核苷和核苷類(lèi)似物 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法33 耐藥機(jī)制：耐藥機(jī)制： 非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI) 突變降低了抑制劑對(duì)酶的結(jié)合力。不同 于核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，其單一突變就 能導(dǎo)致高度耐藥。如K103N、Y181C。 艾滋病抗

7、病毒治療的耐藥檢測(cè)方法34 耐藥機(jī)制：耐藥機(jī)制： K103N突變的機(jī)制突變的機(jī)制 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法35 耐藥機(jī)制：耐藥機(jī)制： 蛋白酶抑制劑 HIV蛋白酶由兩個(gè)同樣的蛋 白質(zhì)鏈組成。這兩個(gè)蛋白質(zhì)鏈 在一起就如同核桃的兩半，而 蛋白酶的活性位點(diǎn)就在兩個(gè)半 殼的中間。 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法36 突變點(diǎn)的表示方法：突變點(diǎn)的表示方法： 基因的突變通常以字母數(shù)字字母的書(shū)寫(xiě)方式 來(lái)表示，第一個(gè)字母代表野生型病毒株特定密碼子處 的氨基酸，第二個(gè)字母代表在特定密碼子處替換了的 氨基酸，中間數(shù)字表示突變點(diǎn)的位置。例如：逆轉(zhuǎn)錄 酶（RT）K103N的突變表示逆轉(zhuǎn)錄酶第103位密碼子 的氨基酸

8、由天冬酰胺（K）變成為賴(lài)氨酸（N）。 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法37 如何檢測(cè)耐藥株：如何檢測(cè)耐藥株： 目前耐藥性檢測(cè)有兩種方法，即表型檢測(cè)及基因型檢測(cè)。表型檢 測(cè)通過(guò)用藥期間的病毒培養(yǎng)進(jìn)行，而基因型檢測(cè)則通過(guò)分子生物學(xué)方 法檢測(cè)與耐藥性相關(guān)的病毒基因突變?；蛐蜋z測(cè)的費(fèi)用較低，技術(shù) 也相對(duì)容易，可在樣品收集后12周得到結(jié)果，但分析基因型耐藥檢 測(cè)時(shí)，需要掌握大量相關(guān)知識(shí)，如突變與抗病毒藥物及其它藥物的交 叉耐藥等，才能對(duì)結(jié)果進(jìn)行正確的分析。表型檢測(cè)可以直接檢測(cè)病毒 的耐藥性，但操作復(fù)雜、耗時(shí)，技術(shù)要求高，且非常昂貴，因此目前 國(guó)際上廣泛應(yīng)用于臨床的是基因型耐藥檢測(cè)。 艾滋病抗病毒治療的耐

9、藥檢測(cè)方法38 如何檢測(cè)耐藥株：如何檢測(cè)耐藥株： Translation into linear string of amino acids Folding into functional protein 表型檢測(cè)表型檢測(cè) 基因型檢測(cè)基因型檢測(cè) 基因型和表型檢測(cè)基因型和表型檢測(cè) 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法39 檢測(cè)中注意事項(xiàng)檢測(cè)中注意事項(xiàng): : 在病人仍在治療失敗的方案上收集樣品，可保 證耐藥株占總病毒量的20%以上； 病毒載量 1000時(shí), 可出現(xiàn)假陰性。 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法40 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法41 HIV基因型耐藥性檢測(cè) （序列測(cè)定法） 艾滋病抗病毒治療的耐

10、藥檢測(cè)方法42 檢 測(cè) 流 程 病人血漿標(biāo)本 HIV RNA 病毒 cDNA HIV RT和PR基因片段 序列測(cè)定 結(jié)果解釋 RNA提取 逆轉(zhuǎn)錄 PCR擴(kuò)增 特定的解釋系統(tǒng) 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法43 標(biāo)本 新鮮EDTA抗凝血漿，或-80保存，避 免反復(fù)凍融 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法44 病毒RNA提取（ Qiagen公司試劑盒） 裂解標(biāo)本，滅活RNA酶 加到離心柱中，RNA與硅膠膜結(jié)合 洗兩次，去除雜質(zhì) 用無(wú)RNA酶的緩沖液洗脫RNA 收集RNA備用 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、快速、得率高 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法45 逆轉(zhuǎn)錄 RNA cDNA 反應(yīng)體系： 10XBuffer 1l

11、 dNTP 0.5l 外側(cè)反向引物 1l RNase inhibitor 0.25l M-MuLV RT 0.25l DEPC水 2l RNA模板 5l 42水浴1小時(shí)，95 5分鐘滅活RT 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法46 巢式PCR擴(kuò)增病毒蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因 第一輪擴(kuò)增反應(yīng)體系： 10XBuffer 5l MgCl2 3l dNTP 1l 外側(cè)正向引物 1l 外側(cè)反向引物 1l Taq酶 0.5l 水 29.5l cDNA模板 10l 945min，9430sec，5530sec，722.5min 30循環(huán) 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法47 巢式PCR擴(kuò)增病毒蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因 第

12、二輪擴(kuò)增反應(yīng)體系： 10XBuffer 5l MgCl2 3l dNTP 1l 內(nèi)側(cè)正向引物 1l 內(nèi)側(cè)反向引物 1l Taq酶 0.5l 水 29.5l 第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物 10l 945min，9430sec，5530sec，722.5min 30循環(huán) 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法48 擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定：瓊脂糖凝膠電泳 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法49 擴(kuò)增產(chǎn)物純化 QIAquick Gel extraction試劑盒 核酸序列測(cè)定 雙脫氧鏈末端終止法 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法50 : Protease: CCTCAAATCACTCTTTGGCAACGACCCCTCGTCACAGTAAA

13、GATAGGGGGGCAATTAA AGGAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGATGATACAGTATTAGAAGAAATGAATTTGCC AGGAAAATGGAAACCAAAAATGATAGGGGGAATTGGAGGTTTTATCAAAGTAAGACA GTATGATCAGGTATCCATAGAAATCTGTGGACATAAGGCTGTAGGTACAGTATTAATAG GACCTACACCAGTCAACATAATTGGGAGAAATCTGTTGACTCAGATTGGTTGCACTTT RT: AAATTTTCCCATTAGTCCTATTGAAACTGTACCAGTAAAATT

14、AAAGCCAGGAATGGATG GCCCAAAAGTTAAACAATGGCCATTGACAGAAGAAAAAATAAAAGCATTAGTAGAAA TTTGTACAGAAATGGGAAAGGAAGGAAAAATTTCAAAAATTGGGCCTGAAAATCCAT ACAATACTCCAGTATTTGCCATAAAGAAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAATTAGT AGATTTCAGAGAACTCAATAAAAGAACTCAAGACTTTTGGGAAGTTCAATTAGGAATA CCACATCCCGCAGGATTAAAACAGAAAAAATCTGTAACAGTCCTGGAT

15、GTGGGTGATG CATATTTCTCAGTCCCTTTAGATAAAGACTTCAGGAAGTACACTGCATTTACCATACCTA GTGTAAACAATGAGACACCAGGGATTAGATATCAGTACAATGTACTTCCACAGGGATG GAAAGGATCACCAGCAATATTCCAATGTAGTATGACAAAGATCTTAGAGCCTTTTAGGA AACAAAATCCAGACATAGTTATCTATCAATACATGGATGATTTGTTAGTAGGATCTGACT TAGAAATAGGGCAGCATAGAGCAAAAATAGAGGAACTGAGACAACATC

16、TGTTGAGGT GGGGATTTACCACACCAGACAAAAAACATCAGAGAGGACCTTCCATA 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法51 利用網(wǎng)絡(luò)工具確定耐藥性突變并進(jìn)行耐藥性解釋 Web站點(diǎn)： HIV Drug Resistance Algorithm2 HIV Drug Resistance Algorithm3 HIV Drug resistance database HIV Drug Resistance Algorithm1 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法52 高度耐藥：大于60分 中度耐藥：3059分 低度耐藥：1529分 潛在低度耐藥：1014分 敏感：09分 耐藥

17、性突變計(jì)分 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法53 HIV-1耐藥性檢測(cè)的臨床指征： （1）抗病毒治療病毒學(xué)失敗需要改變抗病毒治療 方案時(shí)應(yīng)進(jìn)行耐藥性檢測(cè)以協(xié)助選擇有效的抗病 毒藥物。 （2）抗病毒治療病毒載量下降不理想時(shí)可進(jìn)行 HIV-1的耐藥性檢測(cè)。 （3）抗病毒治療失敗需要進(jìn)行耐藥性檢測(cè)時(shí)，應(yīng) 該在病人仍在服藥時(shí)或停藥后立即（4周內(nèi)）進(jìn)行 檢測(cè)。 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法54 HIV-1耐藥性檢測(cè)的臨床指征： （4）急性HIV1感染的病人進(jìn)行抗病毒治療，最好進(jìn) 行耐藥性檢測(cè)，對(duì)于選擇合適的抗病毒藥物、取得最 佳抗病毒效果很有益處。 （5）對(duì)于未經(jīng)抗病毒治療的慢性HIV感染者不一定要 做耐藥性檢測(cè)，但當(dāng)有跡象顯示感染的是耐藥性HIV毒 株時(shí)（例如感染來(lái)自于正在服用抗病毒藥物的病人）， 就應(yīng)當(dāng)進(jìn)行耐藥性檢測(cè)。 （6）不推薦對(duì)病毒載量1000cp/ml的病人做病毒載量 檢測(cè)，因?yàn)椴《舅教秃茈y擴(kuò)增出目的基因片段 艾滋病抗病毒治療的耐藥檢測(cè)方法55 耐藥性檢測(cè)結(jié)果的解釋 HIV-1的耐藥性不是全或無(wú)的現(xiàn)象，基因型和表型耐藥性 檢測(cè)結(jié)果的分析和解釋都有困難 所有抗病毒治療都是聯(lián)合用藥，他們之間是相互協(xié)同的， 即對(duì)一種藥物的敏感性降低并不干擾同一治療方案中其他 藥物的抗病毒活性。 藥物即使有耐藥性也可能有益處，因?yàn)橛心退幮酝蛔兊?病毒比敏感